Polymorphisms of xenobiotic biotransformation genes and their role in individualization of pharmacological therapy and support of humans after heavy psychophysical loading

Full Text

Введение Расшифровка генома человека и развитие методов молекулярной генетики открыли широкие возможности выявления генетических маркеров, определяющих перспективное развитие и ранее проявление особых физических и психических особенностей человека [1]. В качестве таких маркеров широко используются однонуклеотидные полиморфизмы (ОНП) - отличия в последовательности ДНК размером в один нуклеотид между гомологичными участками гомологичных хромосом, возникающие в результате точечных мутаций. Подобные изменения в кодирующих последовательностях генов могут приводить к изменению экспрессии генов, формированию мутантного продукта или полному подавлению экспрессии, что, в свою очередь, оказывает влияние на физиологический статус. В настоящее время существует множество работ, описывающих роль отдельных генов при выявлении предрасположенности к тем или иным видам физической деятельности или развитию мультифакториальных заболеваний. Анализ частот аллелей таких генов позволил идентифицировать генотипы, ассоциированные с различным проявлением базовых психофизических качеств человека, включая предрасположенность к некоторым видам профессиональной деятельности, а также с ранним развитием патологических состояний [1]. В настоящее время в развитых странах все более широкое использование находят методы фармакогенетики - направления медицинской генетики и фармакологии, которое исследует генетические особенности пациентов, влияющие на фармакологический ответ. Основной интерес в настоящее время сосредоточен в той области фармакогенетики, которая анализирует изменения генов, участвующих в метаболизме лекарственных средств, с особым упором на усиление их безопасности, т. к. статистические исследования, проведенные в США и Европе, продемонстрировали, что побочные реакции на лекарственные препараты вызывают около 106 тыс. смертей и 2,2 млн серьезных нарушений ежегодно [1]. На наш взгляд, перспективным направлением молекулярно-генетических исследований является оценка уровня активности ферментов биотрансформации ксенобиотиков, защищающих организм от воздействия чужеродных химических соединений, осуществляя детоксикацию и выведение из организма самых разнообразных по своей химической структуре и биологической активности веществ как экзогенного, так и эндогенного происхождения. Сравнительный анализ перечня лекарственных средств, наиболее часто вызывающих побочные реакции, и перечня ферментов, связанных с известными ОНП показал, что препараты, обычно участвующие в развитии неблагоприятных реакций в большинстве случаев метаболизируются ферментами с известными полиморфизмами [12]. Показано, что наибольшее влияние на характер реакций организма на лекарственные средства оказывает ОНП генов белков, участвующих в процессах фармакокинетики или фармакодинамики лекарственных средств. Это, в первую очередь, гены, кодирующие ферменты биотрансформации и гены транспортеров, участвующих во всасывании, распределении и выведении лекарственных средств из организма. Принято считать, что процесс биотрансформации протекает в две фазы. Ключевым элементов первой фазы является ферментативная система цитохромов Р450 (CYP), основной реакцией которых является монооксигеназная активность. Так, к этому семейству принадлежит CYP1A1, который участвует в детоксикации полициклических ароматических углеводородов. В настоящее время известно несколько основных полиморфизмов в этом гене. Мутантные аллели полиморфных вариантов Т6235 С, А4889G, T5639C ассоциируют с повышенной активностью фермента [11]. Также к суперсемейству цитохрома Р450 относится изоформа 2 Е1 (CYP2 Е1), которая осуществляет биотрансформацию липофильных веществ экзогенного и эндогенного происхождения и активно вовлекается в процессы регуляции про-антиоксидантного баланса в клетках [2]. В гепатоцитах CYP2E1 активно участвует в процессах детоксикации ксенобиотиков и осуществляет метаболизм таких эссенциальных нутриентов, как омега-3 полиненасыщенные жирные кислоты [3]. Ключевыми ферментами второй фазы детоксикации является глутатион S-трансферазы (GST) - мультигенное семейство энзимов, детоксицирующих различные алифатические, ароматические и гетероциклические соединения путем их конъюгации с глутатионом. Таким образом обезвреживаются продукты перекисного окисления липидов, и также тяжелые металлы. Найдено большое количество полиморфных вариантов генов GST. Известны делеционные полиморфизмы (GSTM1, GSTT1), обусловливающие функционально неактивные нулевые аллели. Считается, что у индивидуумов, являющихся носителями этих делеций в гомозиготном состоянии, снижена способность детоксикации химических веществ. В последние годы начато изучение влияния на фармакокинетику лекарственных средств полиморфизма генов-транспортеров: Р-гликопротеина (MDR1), транспортеров органических катионов (ОСТ-1), транспортеров органических анионов (OATP-C, ОАТ-1, ОАТ-3) [7] и др. Кроме того, важное значение для фармакогенетики имеют гены, кодирующие «молекулы-мишени» лекарственных средств (рецепторы, ферменты, ионные каналы) и гены, продукты которых вовлечены в патогенетические процессы (факторы свертывания крови, аполипопротеины и т. д.). Таким образом, генетически детерминированные особенности организма могут существенно влиять на фармакокинетику и все этапы метаболизма лекарственного препарата. В связи с этим совершенствование применения лекарственных препаратов должно включать индивидуальную оптимизацию фармакотерапии на основе комплексной оценки генетически предетерминированных процессов метаболизма препаратов в конкретном организме. Очевидно, что применение фармакогенетических тестов, отражающих наличие конкретных полиморфных аллелей генов, вовлеченных в метаболизм лекарственных препаратов, может позволить прогнозировать ответ пациента на эти препараты, а, следовательно, индивидуализировано подойти к выбору лекарственного средства и режиму его дозирования. В настоящей работе предпринята попытка выявить специфические генотипы по некоторым базовым генам, характерные для лиц, подверженных интенсивным психофизическим нагрузкам и нуждающихся в системной фармакологической поддержке (например, спортсмены спорта высоких достижений), по следующим генам: CYP1A1, EPHX1, GSTM1, GSTP1, GSTT1. Материалы и методы Объектом исследования служили образцы буккального эпителия 110 клинически здоровых спортсменов, подверженных высоким физическим и психическим нагрузкам и специализирующихся в различных видах единоборств (60) и академической гребле (50). Возраст спортсменов варьировал от 16 до 30 лет; 1 из них являлся заслуженным мастером спорта (ЗМС), 47 - мастерами спорта международного класса (МСМК), 41 - мастерами спорта (МС), 22 - кандидатами в мастера спорта (КМС). В качестве группы сравнения выступили 120 клинически здоровых добровольцев в возрасте 15-40 лет со сходными социально-демографическими характеристиками, не занимающиеся спортом. Сбор биологического материала проводился с соблюдением процедуры информированного согласия. Экстракция ДНК проводилось по стандартной методике [6]. Основной метод исследования - сайт-специфическая ПЦР. Для определения размеров продуктов ПЦР инсерционно-делеционных полиморфизмов проводился предварительный электрофорез в 2 % агарозном геле. Гели окрашивали бромистым этидием и визуализировали в трансиллюминаторе CN-1000 Darkroom с использованием оригинального программного обеспечения. Статистическая обработка и анализ параметричности выборок данных проводились с использованием пакета программ Statistica 8.0, а все необходимые промежуточные расчеты выполнялись с помощью программы Microsoft Office Excel 2007. Результаты и обсуждение В настоящем исследовании анализировалось частотное распределение полиморфных аллелей генов, ассоциированных с системой биотрансформации ксенобиотиков (табл. 1): CYP1A1 (rs1048943), EPHX1 (rs1051740), GSTM1 (rs147565), GSTP1 (rs1695), GSTT1 (rs71748309). Основные результаты проведенных исследований суммированы в таблицах 2-5 и на рисунке 1. Нами проведена оценка распространенности как отдельных аллелей, так и вариантов генотипов по исследуемым генам. Необходимость подобного анализа связана с тем, что при отсутствии статистически значимых различий по частоте встречаемости аллелей может, тем не менее, наблюдаться преобладание гомозиготного или гетерозиготного генотипа в одной из групп (см. табл. 2-5). Полиморфизм генов первой фазы детоксикации Эпоксидная гидролаза играет важную роль в детоксикации ряда химических веществ, включая полициклические ароматические углеводороды. Hassett и соавторы (1994) описали связь между мутантным аллелем EPHX1 и снижением ферментативной активности. Они продемонстрировали, что замена His113/Tyr113 в экзоне 3 приводит к уменьшению активности фермента примерно на 40 % и, как следствие, гетерозиготный генотип связан со сниженной степенью обезвреживания токсичных метаболитов, а мутантный гомозиготный генотип является функционально неполноценным. Sarmanova и соавторы (2001) предположили, что полиморфизм этого гена может играть существенную роль в развитии лимфоидных злокачественных новообразований [14]. Также ряд исследований показал наличие значимой связи между ОНП этого гена и риском развития рака легких [13]. Проведенный нами анализ аллельного распределения по гену EPHX1 показал, что преобладающим генотипом среди успешных спортсменов является гетерозиготный генотип EPHX1 Tyr/His (50,98 % ± 7,00 %), связанный со снижением ферментативной активности в физиологических пределах; в группе сравнения - функционально неполноценный гомозиготный генотип EPHX1 Tyr/Tyr (46,20 % ± 7,05 %). Статистически значимых различий между двумя группами не обнаружено (табл. 2). Ген CYP1A1 кодирует один из ферментов, участвующих в 1 фазе процесса биотрансформации. Продукт экспрессии гена CYP1A1 участвует в метаболизме полициклических ароматических углеводородов (таких как бензопирен), многие метаболиты которых являются признанными канцерогенами. Неоднократно показана связь некоторых полиморфных вариантов этого гена с различными формами онкопатологии, включая рак молочной железы [15], рак щитовидной железы [16], немелкоклеточный рак легких [18], и др. Ряд авторов показали связь курения во время беременности и снижения массы тела новорожденных с полиморфизмом генов CYP1A1 и GSTT1, отметив, что наибольшая разница с контролем наблюдается при наличии мутантных аллелей по обоим генам [17]. Анализ распределения генотипов гена CYP1A1 показал наличие статистически значимых различий в двух группах (табл. 3). Для спортсменов преобладающим является гетерогизотный генотип CYP1A1 AG (92,16 % ± 3,76 %), в группе сравнения частота гетерозигот CYP1A1 AG и гомозигот CYP1A1 AA практически не отличается (37,74 % ± 6,66 % и 41,51 % ± 6,78 % соответственно). Гомозиготный функционально неполноценный генотип CYP1A1 GG практически отсутствует в основной группе (1,96 % ± 1,94 %), однако его частота в группе сравнения составляет 20,75 % ± 5,57 % (p < 0,01). Полиморфизм генов второй фазы биотрансформации GST (глутатион-S-трансферазы) - это семейство ферментов, катализирующих коньюгацию различных ксенобиотиков; опосредуя вторую фазу детоксикации непосредственно их, а также вредных продуктов первой фазы. Глутатион-S-трансферазы обладают широкой субстратной специфичностью, а наличие полиморфизма кодирующих их генов приводит к появлению широкого изоморфного спектра ферментов, что модифицирует их способность метаболизировать ксенобиотики. При делеции по обеим аллелям в гене GSTM1, кодирующем фермент глутатион-S-трансферазу класса μ, полностью отсутствует синтез белкового продукта. Обычно делеция наблюдается в 40-45 % случаев в европеоидных популяциях, а ее наличие сопровождается увеличением риска онкологических и кардиоваскулярных заболеваний [5]. Результаты ранее выполненных исследований показали, что влияние курения на частоту развития коронарной болезни сердца связано с генотоксичными атерогенами, приводящими к повреждению хромосом [9]. Обширная делеция в структурной части гена GSTT1 (глутатион S-трансфераза ө-1) ассоциируется с низкой эффективностью детоксикации ряда распространенных потенциальных канцерогенов [5]. Частота распространенности делеции гена в европеоидных популяциях составляет 16-25 % и обуславливает повышенный риск развития раковых опухолей и коронарной болезни сердца. Также сравнение распределения частот аллелей по генам GSTM1 и GSTT1 показало наличие статистически значимых различий между основной группой и группой сравнения (табл. 4). Для обеих групп наблюдения характерно преобладание GSTM1 (+) генотипа, однако его частота выше у спортсменов (88,33 % ± 4,14 % против 74,17 % ± 4,20 %, p < 0,05). Для гена GSTT1 наблюдается противоположная картина: в группе сравнения также преобладает (+) генотип (71,67 % ± 6,35 % против 11,67 % ± 4,14 %, p < 0,001), в то время как для основной группы характерна делеция в структурной части гена (00-генотип) (88,33 % ± 4,14 % против 28,00 % ± 4,10 %, p < 0,001), что свидетельствует о задействовании иных путей детоксикации вредных веществ у лиц, успешно преодолевающих тяжелые психофизические нагрузки. Таким образом, наиболее распространенным генотипом в основной группе является GSTM1 (+) / GSTT1 00 (76,67 % ± 5,46 %), в то время как GSTM1 (+) / GSTT1 (+) генотип встречается только в 11,67 % ± 4,14 % случаев. В группе же сравнения превалирует генотип GSTM1 (+) + GSTT1 (+) (58,33 % ± 4,50 %, p < 0,001), частота гетерозиготных состояний в сумме составляет 29,17 % ± 4,15 % (p < 0,001) (рис. 1). Распространенность сочетания делеции по обоим генам значимо не отличается в обеих группах, тем не менее, для спортсменов вероятность формирования функционально мутантного генотипа (GSTM1 00 + GSTT1 00) почти в 2 раза превышает аналогичный показатель для группы сравнения (50,00 % против 27 %). При таком генотипе для нивелировки его отрицательного воздействия показано назначение специальной диеты и антиоксидантов. Для более точной оценки значимости этих характеристик необходимо увеличение объема выборки и расширение спектра исследуемых генов семейства GST. Экспрессия GSTP1 осуществляется, прежде всего, в сердце, легких и тканях мозга, и является наиболее распространенным GST-изоферментом, экспрессируемым вне печени. На основании его экспрессии в большинстве опухолевых клеточных линий человека и распространенности при химиотерапевтически-устойчивых опухолях было выдвинуто предположение о том, что GSTP1 играет важную роль в канцерогенезе и потенциальной резистентности опухолей к лекарственной терапии. Еще одним подтверждением этого является и то, что GSTP1 может селективно ингибировать JNK-фосфорилирование (с участием c-Jun N-терминальнх киназ), предотвращая апоптоз [8]. Gilliland и соавторы (2004) обнаружили, что мутации по GSTP1 и GSTM1 изменяют аллергический ответ организма. Показано, что делеция по GSTM1 или GSTP1 Ile105 дикого типа связаны со значительным увеличением выработки IgE и гистамина после действия аллергенов; при наличии одновременно генотипов GSTP1 Ile / Ile и GSTM1 00 наблюдаются еще более выраженные изменения [4]. Выявлено также, что подростки (13 до 21 лет), регулярно подвергающиеся дома воздействию табачного дыма, страдают более тяжелыми формами астмы при наличии гомозиготной мутации по гену GSTP1 [10]. Результаты проведенного молекулярно-генетического анализа показали, что для обеих групп характерно преобладание GSTP1 AA (Ile/Ile), генотипа, однако его частота незначительно выше среди лиц, не занимающихся спортом (41,18 % ± 6,89 % против 51,67 % ± 6,45 %) (табл. 5). Кроме того, отмечается выраженное (p < 0,02) преобладание генотипа GSTP1 GG (Val/Val) среди спортсменов относительно группы сравнения (21,57 % ± 5,76 % против 5,00 % ± 2,81 %). Заключение Проведенное исследование позволило выявить ряд особенностей. 1. Наиболее часто у успешных профессионалов-единоборцев встречаются следующие генетические характеристики: ген GSTT1 (88,33 % ± 4,14 % 00), ген GSTM1 (88,33 % ± 4,14 % +), ген CYP1A1 (92,16 % ± 3,76 % AG). Для выявления генетически обусловленных индивидуальных особенностей биотрансформации фармакологических препаратов анализ по этим генам является весьма перспективным. 2. Анализ данных по гену EPHX1, показал, что особенности этого гена не является ключевым (для представителей выбранных видов спорта). 3. Вероятность формирования функционально неполноценного генотипа по генам второй фазы детоксикации GSTM1 и GSTT1 (00 + 00) почти в 2 раза выше в основной группе (50 против 27 %). Для более точной оценки значимости гена GSTP1 целесообразным представляется увеличение размеров выборки. 4. Результаты исследований свидетельствуют о высокой частоте встречаемости генотипов, связанных с частичным уменьшением активности ферментов систем биотрансформации (EPHX1, CYP1A1, GSTT1) в основной группе. Формирование этих генотипов приводит к снижению степени обезвреживания токсичных метаболитов, что требует назначение антиоксидантных средств и специальной диеты. С другой стороны, связь между высокой устойчивостью к психофизическим нагрузкам лиц основной группы и наличие указанных особенностей, косвенно указывают на возможность задействования иных путей детоксикации ксенобиотиков и вредных метаболитов, что подчеркивает необходимость расширения спектра исследуемых генов системы детоксикации ксенобиотиков.

About the authors

Anna Sergeevna Kozlova

Respublic Scientific and Practical Centre of Sport

Email: annete.kozlova@gmail.com
Master of Sci., Head, Laboratory of Pharmacology and Sport Nutrition

Alexandre Olegovich Pyatibrat

A. M. Nikiforov All-Russian Centre of Extreme and Radiation Med., Emercom of Russia

Email: a5brat@yandex.ru
PhD (Pathophysiology), Head of Dept. of Organization and Sc. Activity

Sergei Borisovich Melnov

A. D. Sakharov International State Ecological University

Email: sbmelnov@gmail.com
Dr. Biol. Sci. (Genetics), Professor, Head. Dept. of Environmental and Molecular Medicine

Nadezhda Sergeevna Smolnik

A. D. Sakharov International State Ecological University

Petr Dmitriyevich Shabanov

S. M. Kirov Military Medical Academy

Email: pdshabanov@mail.ru
Professor, Head, Dept. of Pharmacology

References