Antihypoxic properties of ethylthiobenzimidazole succinate

Elena N. Selina; Селина Елена Николаевна; Irina B. Krylova; Крылова Ирина Борисовна; Andrey V. Lyubimov; Любимов Андрей Владимирович; Anton I. Orlov; Орлов Антон Иосифович; Ekaterina V. Maslovets; Масловец Екатерина Валентиновна; Petr D. Shabanov; Шабанов Петр Дмитриевич

doi:10.17816/RCF678948

Antihypoxic properties of ethylthiobenzimidazole succinate

Authors: Selina E.N.¹, Krylova I.B.¹, Lyubimov A.V.¹, Orlov A.I.¹, Maslovets E.V.¹, Shabanov P.D.¹
Affiliations:
1. Federal State Budgetary Scientific Institution «Institute of Experimental Medicine» (FSBSI «IEM»)
Section: Original study articles
Submitted: 05.05.2025
Accepted: 08.10.2025
Published: 08.10.2025
URL: https://journals.eco-vector.com/RCF/article/view/678948
DOI: https://doi.org/10.17816/RCF678948
ID: 678948

Cite item

Abstract

Background. 2-Ethylthiobenzimidazole succinate (I) is a new compound created by analogy with the domestically produced drug metaprot (bemitil), which is a hydrobromide salt of 2-ethylthiobenzimidazole (II).

The aim of the study was to compare the antihypoxic effects of compounds I and II in two models of normobaric hypoxia in mice.

Methods. Mice were randomized into 8 groups (n = 8-12 mice in each), which were subjected to normobaric hypoxia: 1) in a cupping test and 2) a hypoxic chamber with a variable gas composition, changing the oxygen concentration in the gas mixture from 21% to 2% by displacing it with nitrogen. Compounds I and II were administered intraperitoneally once 1 hour before hypoxia at doses of 50 and 100 mg/kg.

Results. In the cupping test (hypoxia with hypercapnia), both compounds significantly increased the survival time of mice by 13-21%, with the dose of 50 mg/kg being more effective. Under normobaric hypoxia with variable gas composition, the survival time of mice at critical oxygen concentrations decreasing from 6 to 2 vol% oxygen increased by 108% (from с 8.2±1.1 min to 17.0±1.7 min, р<0.05) after the administration of compound I and by 135% (to 19.3±2.2 min, р<0.01) after the administration of compound II. The threshold oxygen concentration at which mice survived, on the contrary, decreased from 4.56±0.16% in the control to 3.23±0.26% after the introduction of compound I and to 2.97±0.30% – compound II, i.e., to 71±6% and 65±7% of the initial values, respectively. Finally, the assessment of hypoxia resistance in points changed from 4.0±0.5 in the control to 8.8±0.7, which amounted to 220±18% (p<0.01), and 9.5±0.8 points, or 238±20% (p<0.001), after the introduction of compound I and compound II, respectively.

Conclusion. Compounds I and II at doses of 50 and 100 mg/kg exert a pronounced antihypoxic effect in two variants of normobaric hypoxia models in mice, and the antihypoxic effect is similar in magnitude for both compounds. The mechanism of the antihypoxic action of compounds I and II is apparently similar and is associated with the 2-ethylthiobenzimidazole molecule rather than with the anionic part of the molecule.

Keywords

antihypoxants, 2-ethylthiobenzimidazole, succinate, hydrobromide, cupping hypoxia, normobaric hypoxia, mice

Full Text

Введение

2-Этилтиобензимидазол сукцинат (соединение I) представляет собой новое химическое соединение, созданное по аналогии с выпускаемым отечественной промышленностью препаратом метапрот (бемитил), который является гидробромидной солью 2-этилтиобензимидазола (соединение II). Исходя из соображения структурного сходства с соединением II, которое обладает актопротекторными и антигипоксическими свойствами, предполагается, что соединение I может проявлять сходную фармакологическую активность, причем наличие сукцинатного аниона в его структуре потенциально может усилить его действие за счет активации SUCNR1 рецепторов. Сукцинатные рецепторы SUCNR1, ранее называемые как GPR91, относятся к сопряженным с G-белком рецепторам (G-protein-coupled receptors) и активируются сукцинатом. Сукцинат-анион, образуемый из янтарной кислоты в процессе высвобождения протона (Н⁺), обеспечивая взаимодействие с SUCNR1, участвует во многих патологических процессах, включая ишемию, воспаление, ожирение, фагоцитоз, стрессогенные реакции и т.д. [1]. Однако, не исключено, что сукцинатные рецепторы реагируют только на высокие концентрации эндогенного сукцината [2]. Поэтому нельзя с уверенностью утверждать, что введение сукцината в молекулу потенциального антигипоксанта повышает его активность. Примером может служить наша работа по сравнению антигипоксических свойств ряда потенциальных антигипоксантов разной структуры с включением сукцината, которая не позволяет сделать однозначный вывод о потенцировании сукцинатом антигипоксических свойств соединений [3].

Целью исследования было сравнение антигипоксических эффектов соединений I и II в двух моделях нормобарической гипоксии у мышей.

Методика

Эксперименты выполнены на белых беспородных мышах-самцах массой 20-22 г. Опыт включал 2 этапа: 1) изучение антигипоксической активности исследуемых соединений на модели нормобарической гипоксии с гиперкапнией в «баночной пробе» и 2) оценка их действия при нормобарической гипоксической гипоксии без гиперкапнии. Животные были рандомизированы на 8 групп по 8-12 мышей в каждой, которых подвергали нормобарической гипоксии: 1 – контроль I баночная гипоксия (БГ); 2 – БГ + соединение I 50 мг/кг; 3 – БГ + соединение I 100 мг/кг; 4 – БГ + соединение II 50 мг/кг; 5 – БГ + соединение II 100 мг/кг; 6 – контроль II норморбарическая гипоксическая гипоксия (НГГ) в гипоксической камере); 7 – НГГ + соединение I 100 мг/кг; 8 – НГГ + соединение II 100 мг/кг. Исследуемые соединения растворяли в физиологическом растворе с добавлением твина-80 и вводили однократно внутрибрюшинно (в/бр) в заявленных дозах за 1 час до гипоксического воздействия. Дозы соединений выбраны на основе описанных максимальных антигипоксических эффектов 2-этилтиобензимидазола [4, 5]. Контрольным животным вводили равный объем растворителя.

БГ воспроизводили путем помещения мышей в индивидуальные стеклянные камеры объемом 0,25 л, которые герметически закрывали, переворачивали и опускали в воду на высоту крышки, чтобы избежать подсоса воздуха. Регистрировали продолжительность жизни животных в минутах.

НГГ создавали у мышей с помощью герметичной газовой камеры для лабораторных исследований (КГЭЛ-1) в комплекте с устройством для очистки газовой среды от СО₂ и блоком автоматического контроля, управления и поддержания состава гипоксической среды в камере (БК ГС «Дупло-мини») производства ООО «НИИ ГЕРОПРО», Санкт-Петербург, Россия. Камера позволяет моделировать НГГ, снижая концентрацию кислорода в газовой смеси с 21% до 2% путем вытеснения его азотом. Снижение концентрации кислорода осуществляли в два приема: вначале автоматическим постепенным уменьшением концентрации кислорода с 21 до 6%, а затем ступенчато с 6 до 2%, путем снижения концентрации кислорода на 1% на каждой последующей площадке и содержанием животных на каждой из них в течение 5 минут.

Гипоксическая камера позволяла одновременно помещать в нее мышей контрольной и опытных групп. Антигипоксическую активность препаратов оценивали по следующим параметрам [6, 7]: 1) продолжительность жизни в минутах (время от помещения животного в камеру до момента его гибели); 2) продолжительность жизни при критических концентрациях кислорода в мин (время от начала пребывания на площадке 6% кислорода до гибели животного); 3) выживаемость мышей при различных концентрациях кислорода (6 → 2%); 4) пороговая концентрация кислорода (ПКК) в %, при которой наступала гибель животного, определялась по формуле: ПКК = А-(Б/300), где: А – концентрация кислорода площадки, на которой зафиксировано агональное дыхание животного; Б – продолжительность жизни животного на площадке в секундах; 300 – длительность нахождения животного на площадке в секундах; 5) устойчивость к гипоксии по критерию ПКК (выражали в баллах путем присвоения 1 балла каждому временному промежутку пребывания на площадке длительностью 100 с. Например, при 6% кислорода, если мышь жила 100 с присваивали 1 балл, если 200 с – 2 балла, если 300 с – 3 балла. При 5% кислорода эти данные составляли 4, 5 и 6 баллов соответственно, при 4% кислорода – 7, 8 и 9 баллов соответственно, при 3% кислорода – 10, 11 и 12 баллов соответственно, наконец, при 2% кислорода – 13, 14 и 15 баллов соответственно.

Все эксперименты были выполнены в соответствии с правилами, указанными в Директиве Европейского сообщества (2010/63/ЕС), Хельсинской декларацией о гуманном отношении к животным (редакция 2000 г.), Женевской конвенцией «International Guiding Principals for Biomedical Involving Animals» (Geneva, 1990) и с одобрения локального этического комитета Института экспериментальной медицины протокол №2/23 от 15.06.2023.

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ GraphPad Prism 6. Сравнение экспериментальных групп выполняли с помощью однофакторного дисперсионного анализа ANOVA и t-критерия Стьюдента. Различия между группами считали статистически значимыми при p<0,05. Данные представлены в виде среднего арифметического и стандартной ошибки (M±SEM).

Результаты исследований

Полученные результаты свидетельствуют, что в условиях БГ соединение I в дозе 50 и 100 мг/кг достоверно увеличивало продолжительность жизни мышей по сравнению с контролем на 21% (p=0,0309) и 13% (p=0,0182), соответственно. Продолжительность жизни мышей под действием соединения II в дозе 50 мг/кг достоверно (p=0,0232) отличалась от контроля и превышала контрольные показатели на 16%. В дозе 100 мг/кг соединение II не оказывало антигипоксического эффекта. Разница между эффективностью соединений I и II была не достоверна (рис. 1).

На 2-ом этапе исследований оценивали антигипоксическое действие соединений I и II в гипоксической камере. Продолжительность жизни мышей после в/бр введения соединения I увеличивалась на 46%, а после соединения II – на 58%, статистических различий между этими значениями не отмечали (рис. 2).

Время жизни животных при критических концентрациях кислорода, уменьшающихся от 6 до 2%, в этих группах соответственно увеличивалось на 108% (с 8,2±1,1 мин до 17,0±1,7 мин, р<0,05) после введения соединения I и на 135% (до 19,3±2,2 мин, р<0,01) после введения соединения II. Пороговая концентрация кислорода, до которой доживали мыши, напротив, снижалась с 4,56±0,16% в контроле до 3,23±0,26% после введения соединения I и до 2,97±0,30% – соединения II, то есть соответственно до 71±6% и 65±7% от исходных значений. Наконец, оценка устойчивости к гипоксии в баллах менялась с 4,0±0,5 в контроле до 8,8±0,7, что составило 220±18% (р<0,01) после введения соединения I, и до 9,5±0,8 баллов, что составило 238±20% (р<0,001) после введения соединения II. Подтверждением этой закономерности стали показатели выживаемости мышей на площадках с различной концентрацией кислорода (рис. 3).

Следовательно, оба соединения (I и II) проявляют антигипоксическую активность в моделях БГ и НГГ на мышах при однократном использовании в дозах 50 и 100 мг/кг. Эти результаты подтверждаются по ряду характеристик, особенно в модели НГГ, позволяющей оценить не только выживаемость животных, но и другие параметры антигипоксической активности при дозированной нормобарической гипоксии.

Обсуждение полученных результатов

Сравнение антигипоксической активности двух солей 2-этилтиобензимидазола – соединения I (сукцинат) и соединения II (гидробромид) показало, что оба соединения проявляют заявленные свойства в двух моделях гипоксии – БГ и НГГ на мышах. Степень защиты от гипоксии колеблется в пределах +16 - 21% (р<0,05) в случае БГ и +46 - 135% (р<0,01) при НГГ. При этом соединение II по ряду показателей выглядит более активным, чем соединение I, хотя статистических различий между ними в рамках настоящих исследований ни по одному из показателей не выявлено.

Прежде всего необходимо отметить, что в модели БГ у обоих соединений антигипоксический эффект был выше в дозе 50 мг/кг. Возможно, это связано с тем, что доза 100 мг/кг превышает 1/10 LD₅₀ (для мышей LD₅₀ соединения II составляет 650 мг/кг [5], в наших предварительных опытах – 450±35 мг/кг). Не исключено, что антигипоксическое действие обоих соединений может частично нивелироваться токсическим эффектом.

Проводить сравнение полученных нами данных в отношении антигипоксической активности соединений I и II с результатами других исследований сложно. Увеличение продолжительности жизни мышей по отношению к контролю в них колеблется от 0% до 70% и зависит от дозы соединения, способа введения и лаборатории, где проводили исследование, точнее, где осуществляли его химический синтез (табл. 1).

Также не исключено, что такой разброс может быть связан с разными условиями проведения эксперимента: временем года, возрастом и линией животных, объемом гермокамеры, временем введения, чистотой используемого вещества и другими внешними факторами. Ссылок на работу с соединением I в базах данных не найдено.

Возвращаясь к предисловию, в котором мы позиционировали соединение I как потенциально активное не только за счет самой молекулы 2-этилтиобензимидазола, но и за счет сукцината, следует пояснить логику наших рассуждений. Известно, что янтарная кислота и ее соли в водном растворе диссоциируют, в нашем случае соединение I с высвобождением сукцинат-аниона, а соединение II с выделением анионов Br^-. Условно можно связать антигипоксическое действие соединения I именно с сукцинат-анионом, ведь многие сукцинатсодержащие соединения проявляют, в том числе, и антигипоксические свойства [13]. В качестве примера приведем работу [14], в которой сравнивали эффективность лечения астенического симптомокомплекса у хирургических больных и пострадавших с сочетанными травмами, а также у больных с невротическими и стрессогенными расстройствами с помощью сукцинатнесодержащих и сукцинатсодержащих метаболических протекторов (эмоксипин/мексикор, рибоксин/цитофлавин, метапрот/метапрот плюс). Было найдено, что сукцинатсодержащие препараты (мексикор, цитофлавин, метапрот плюс) были более эффективны в устранении астении у больных в сравнении с сукцинатнесодержащими препаратами (эмоксипин, рибоксин, метапрот). И хотя понятие астенического синдрома не включает прямого антигипоксического действия, исключить антигипоксический компонент в нормализации соматических и нервно-психических функций рассматриваемых контингентов больных не представляется возможным.

Действие самого сукцинат-аниона может рассматриваться, по крайней мере, с двух позиций. Первая из них заключается в метаболическом действии, связанном с включением в цикл трикарбоновых кислот, где сукцинат является одним из интермедиатов. Такой механизм можно допустить, однако проникающая способность сукцината достаточно невелика, поэтому его свойство оптимизировать энергетический обмен за счет метаболического эффекта ограничен. В тоже время в условиях гипоксии сукцинат способен активировать глюконеогенез, альтернативный путь образования глюкозы из недоокисленных продуктов распада, важный при кислородном голодании. Второй механизм заключается в прямой активации рецепторов SUCNR1, расположенных на внешней поверхности мембран клеток, хотя для этого необходима достаточно высокая концентрация сукцината [2, 15]. Учитывая, что различия в величине антигипоксического эффекта соединения I и II в наших опытах были незначительными, все же следует считать, что их антигипоксическое действие обусловлено самой молекулой 2-этилтиобензимидазола, а не ее анионной частью.

Выводы

Соединения I и II в дозах 50 и 100 мг/кг оказывают выраженный антигипоксический эффект в двух моделях нормобарической гипоксии у мышей, при этом антигипоксическое действие сравнимо по величине у обоих соединений.
Механизм антигипоксического действия соединений I и II, по-видимому, сходен и связан с молекулой 2-этилтиобензимидазола, нежели с анионной частью молекулы.

Рис. 1. Влияние соединений I и II на продолжительность жизни мышей в условиях баночной пробы

По оси ординат – продолжительность жизни (мин), по оси абсцисс – группы животных: 1 – контроль (гипоксия); 2 – гипоксия + соединение I 50 мг/кг; 3 – гипоксия + соединение I 100 мг/кг; 4 – гипоксия + соединение II 50 мг/кг; 5 – гипоксия + соединение II 100 мг/кг. * p<0,05 в сравнении с контролем.

Fig. 1. Effect of compounds I and II on the lifespan of mice under the cupping test conditions

The ordinate axis shows lifespan (min), the abscissa axis shows animal groups: 1 – control (hypoxia); 2 – hypoxia + compound I 50 mg/kg; 3 – hypoxia + compound I 100 mg/kg; 4 – hypoxia + compound II 50 mg/kg; 5 – hypoxia + compound II 100 mg/kg. * p<0.05 compared to control.

Рис. 2. Влияние соединений I и II на продолжительность жизни мышей в условиях нормобарической гипоксической гипоксии

По оси ординат – продолжительность жизни мышей (мин), по оси абсцисс – группы животных: 1 – контроль (гипоксия); 2 – гипоксия + соединение I 100 мг/кг; 3 – гипоксия + соединение II 100 мг/кг. * p<0,05 в сравнении с контролем.

Fig. 2. Effect of compounds I and II on the lifespan of mice under normobaric hypoxic hypoxia conditions

Ordinate axis – lifespan of mice (min), abscissa axis – animal groups: 1 – control (hypoxia); 2 – hypoxia + compound I 100 mg/kg; 3 – hypoxia + compound II 100 mg/kg. * p<0.05 compared to control.

Рис. 3. Выживаемость мышей на площадках с различной концентрацией кислорода в условиях нормобарической гипоксической гипоксии

По оси ординат – выживаемость мышей в %, по оси абсцисс – объемная доля кислорода в газовой смеси (%). 1 – контроль (гипоксия); 2 – гипоксия + соединение I 100 мг/кг; 3 – гипоксия + соединение II 100 мг/кг.

Fig. 3. Mice survival on the stages with different oxygen concentration under normobaric hypoxic hypoxia

The ordinate axis shows mouse survival in %, the abscissa axis shows volume fraction of oxygen in a gas mixture (%). 1 – control (hypoxia); 2 – hypoxia + compound I 100 mg/kg; 3 – hypoxia + compound II 100 mg/kg.

Таблица 1. Оценка антигипоксической активности соединения II по продолжительности жизни мышей в модели баночной гипоксии по данным разных авторов

Table 1. Antihypoxic activity of compound II in mice model of cupping hypoxia according to the literary data

Доза, способ введения	Продолжительность жизни в % к контролю	Город, учреждение	Источник химического соединения	Ссылка
50 мг/кг в/бр однократно	+70%	Смоленск, СГМА	Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург	[8]
50 мг/кг в/бр однократно	+5%	Уфа, БГМУ	Башкирский государственный медицинский университет, Уфа	[9]
50 мг/кг в/бр однократно 100 мг/кг в/бр однократно	0% +22%	Москва, Институт медико-биологических проблем РАН	Институт медико-биологических проблем РАН, Москва	[10]
50 мг/кг внутрь, 10 дней	+16%	Санкт-Петербург, СЗГМУ им. И.И. Мечникова	Метапрот, ЗАО «Сотекс», Москва	[11]
50 мг/кг однократно 100 мг/кг 200 мг/кг	0% +46% +95%	Беларусь, БГМУ, Минск	Белорусский государственный медицинский университет, Минск	[12]

×