The Regulation of Vascular Endothelial Growth Factor Expression by G-CSF in Human Endometrium

Full Text

                 ВВЕДЕНИЕ

         Клиническое наблюдение результатов лечения рекомбинантным гранулоцитарным колониестимулирующим фактором (Г-КСФ) пациенток с идиопатической нейтропенией, в симптомокомплекс которой входит бесплодие и невынашивание, продемонстрировало спонтанное наступление беременности у пациенток с бесплодием в анамнезе [1]. Данные результаты послужили основой для применения Г-КСФ при синдроме рефрактерного эндометрия и в протоколах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) [2]. Несколько мета-анализов продемонстрировали эффективность Г-КСФ, заключающуюся в повышении частоты имплантации в протоколах ВРТ [3-5]. Однако механизм действия Г-КСФ при местном и/или системном применении на ткани эндометрия до настоящего времени остается неизвестным.

Целью настоящего исследования было изучение влияния Г-КСФ на экспрессию гена фактора роста эндотелия сосудов (vascular endothelial growth factor, VEGF), участвующего в процессах ангиогенеза, и гена транскрипционного фактора HOXA10 (белок гомеобокса Hox-A10), вовлеченного в регуляцию имплантации, в клетках первичной культуры эндометрия.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

 

Общий дизайн исследования

         В исследовании приняли участие 8 пациенток, которые проходили обследование перед проведением лечения бесплодия с применением вспомогательных репродуктивных технологий. Всем пациенткам на 5-10 день менструального цикла выполнялась аспирационная биопсия эндометрия с помощью Пайпель-зонда («Цзянсу Яда Технолоджи Групп Ко., Лтд», Китай).

Полученный биоптат эндометрия подвергался культивированию в течение 72 часов в присутствии различных концентраций Г-КСФ (1 и 100 мг/мл), после чего в среде для культивирования с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) определялось содержание VEGF и методом ПЦР в режиме реального времени изучалась экспрессия VEGF и HOXA-10 в клеточных культурах.

 

Культивирование эндометрия

Культивирование клеток эндометриального аспирата проводили в течение 72 часов в среде DMEM (Sigma, США) с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (Sigma, США), 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (Gibco, США) при добавлении Г-КСФ (Биокад, Россия) в концентрации 1, 100 мг/мл или при его отсутствии при +37°С в атмосфере с содержанием 5% СO₂ в СO₂-инкубаторе.

 

 

ПЦР в режиме реального времени

Тотальную фракцию нуклеиновых кислот выделяли из клеточных культур эндометрия после культивирования по стандартному протоколу экстракции с использованием соответствующей тест-системы (7E303H9, Vazyme, Китай). Концентрацию выделенной РНК оценивали на спектрофотометре NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific, США).

Далее выполняли обратную матричной РНК (мРНК) в комплементарную ДНК (кДНК) с помощью набора для обратной транскрипции (Vazyme, R232-01, Китай). Полученные образцы кДНК использовали для проведения реакций ПЦР в реальном времени (термоциклер CFX384 Touch, Biorad-Laboratories, США) с использованием флуоресцентного количественного ПЦР-инструмента Agilent Real-time (AriaMx) и SYBR Green (New England Biolabs, e3005l, США). Амплификацию выполняли на приборе ДТ-Прайм (ДНК-Технология, Россия). Праймеры (таблица 1) для количественного определения уровней экспрессии исследуемых генов синтезировали на твердофазном олигонуклеотидом автоматическом ДНК/РНК синтезаторе Spectronika H-28 (K&A Laborgeraete, Германия) 4-стадийный фосфорамидитным методом синтеза на пористом стекле (CPG). Очистку синтезированных праймеров осуществляли на гель-фильтрующей системе Р-8 (K&A Laborgeraete, Германия). Реакцию производили с обязательным присутствием отрицательных контролей. Относительная экспрессия генов была рассчитана с использованием метода 2^(−ΔΔCt). Так как количество материала в биоптатах было отличным друг от друга для оценки экспрессии генов использовали алгоритм post-hoc сопоставления относительных величин экспрессии генов с идентификацией/значимостью количества мРНК, усредненному по уровню мРНК референсного гена домашнего хозяйства ‒ глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH), при этом с целью упрощения вычислительных операций результатов амплификации выражали в логарифмическом масштабе в виде десятичного логарифма от количества копий мРНК в 1 мл.

Таблица 1. Последовательности праймеров для ПЦР.

Table 1. Sequence of primers for PCR.

	Прямой праймер	Обратный праймер
Исследуемые гены
HOXA10	5′-TCACCAAGGCCAGCACATAG-3′	5′-TTAACTCAAGCTGCCTCGCC-3′
VEGF	5′-TACCTCCACCATGCCAAGT-3′	5’-TAGCTGCGCTGATAGACAT-3′
Референсный ген
GAPDH	5'-AGACAGCCGCATCTTCTTGT-3'	5'-TACTGAGATGGGTGCCGTTC-3'

Примечание. HOXA10 – белок гомеобокса Hox-A10; VEGF – фактор роста эндотелия сосудов; GAPDH – глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа

 

Иммуноферментный анализ

Концентрацию VEGF в среде для культивирования определяли на многофункциональном планшетном анализаторе Victor X5 (PerkinElmer Inc., США) с использование тест-систем для ИФА (Thermo Fisher Scientific, США).

 

Статистический анализ результатов исследования

Количественные признаки представлены в виде среднего ± стандартная ошибка.

Нормальность распределения данных проверяли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Во всех группах p > 0.05, что свидетельствует о нормальности распределения данных.

Значимость различий между группами определяли с помощью дисперсионного анализа ANOVA и теста Тьюки, при p < 0.05 считали, что наблюдаемые различия являются статистически значимыми.

 

Этические правила и нормы

Исследование выполнено в полном соответствии с принципами Хельсинской декларации Всемирной ассоциации «Этические принципы научных и медицинских исследований с участием человека», действующими порядками и стандартами оказания медицинской помощи, а также другими регуляторными требованиями к проведению клинических исследований и наблюдательных программ в Российской Федерации. Проведение исследования одобрено на заседании локального этического комитета ФГБНУ «НИИ Акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта» – протокол №125 от 12.05.2023.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ

Общая характеристика пациентов, включенных в исследование, представлена в таблице 2. Средний возраст пациенток составил 31±2 лет, наиболее частой причиной бесплодия послужил мужской фактор (37.5%). У 75% пациентов страдали первичным бесплодием.

Таблица 2. Общая характеристика пациенток.

Table 2. General characteristics of patients.

Номер пациента	Возраст, лет	Длительность бесплодия, лет	Причина бесплодия	Сопутствующие гинекологические заболевания	Особенности репродуктивного анамнеза
1	29	3	Ановуляция	Синдром поликистозных яичников	Первичное бесплодие
2	33	3	Мужской фактор	Миома матки	Первичное бесплодие; 2 неудачные попытки ЭКО/ИКСИ
3	30	3	Неясного генеза	-	Первичное бесплодие
4	32	6	Мужской фактор	-	Самостоятельная беременность в предыдущем браке
5	34	5	Сочетанное (трубный + мужской фактор)	Миома матки	Первичное бесплодие 3 неудачные попытки ЭКО/ИКСИ
6	29	3	Ановуляция	Синдром поликистозных яичников	Первичное бесплодие
7	27	3	Сочетанное (трубный + мужской фактор)	-	2 тубэктомии по поводу внематочных беременностей с интервалом в 2 года
8	33	4	Мужской фактор	Миома матки	Первичное бесплодие

 

При анализе уровней экспрессии исследуемых генов в клеточных культурах эндометрия с поправкой по количеству копий референсного гена до и после культивирования в присутствии различных концентраций Г-КСФ был установлен дозозависимый стимулирующий экспрессию генов VEGF (ANOVA, F(2, 21) = 31.55, p < 0.001) и HOXA-10 (ANOVA, F(2, 21) = 14.31, p < 0.001) эффект Г-КСФ (Рисунок 1). Тенденция к повышению экспрессии была получена уже для концентрации Г-КСФ 1 мг/мл, в то время как статистически значимое повышение экспрессии было получено при концентрации Г-КСФ 100 мг/мл.

Рисунок 1. Уровни экспрессии генов VEGF и HOXA10 в клеточных культурах эндометрия после культивирования в присутствии различных концентраций Г-КСФ.

Figure 1.
 VEGF and HOXA10 gene expression levels in endometrial cell cultures after cultivation in the presence of different concentrations of G-CSF.

Примечание. HOXA10 – белок гомеобокса Hox-A10; VEGF – фактор роста эндотелия сосудов; Г-КСФ – гранулоцитарный колониестимулирующий фактор. Данные представлены в виде уровней мРНК (log-трансформированное количество копий на 1 мл) с поправкой по среднему геометрическому референсных генов

 

Далее было изучено влияние различных концентраций Г-КСФ на концентрацию VEGF(Рисунок 2). Было так же установлено дозозависимое стимулирующей воздействие Г-КСФ (ANOVA, F(2, 21) = 109.4, p < 0.001), при этом статистически значимые различия были получены уже для концентрации Г-КСФ 1 мг/мл.

Рисунок 2. Концентрация VEGF в культуральной среде после культивирования клеточных культур эндометрия в присутствии различных концентраций Г-КСФ.

Figure 2. VEGF concentration in culture medium after culturing endometrial cell cultures in the presence of different concentrations of G-CSF.

 

Примечание. VEGF – фактор роста эндотелия сосудов; Г-КСФ – гранулоцитарный колониестимулирующий фактор. Данные представлены в виде уровней мРНК (log-трансформированное количество копий на 1 мл) с поправкой по среднему геометрическому референсных генов

Уровни экспрессии VEGF в клеточных культурах эндометрия до и после культивирования в присутствии Г-КСФ в концентрации 100 мг/мл для отдельных пациентов представлены на рисунке 3. Стимулирующий эффект Г-КСФ был обнаружен во всех исследуемых образцах эндометрия.

 

Рисунок 3. Уровни экспрессии VEGF в клеточных культурах эндометрия до и после культивирования при концентрации 100 мг/мл.

Figure 3. VEGF expression levels in endometrial cell cultures before and after cultivation at a concentration of 100 mg/ml.

 

 

Примечание. VEGF – фактор роста эндотелия сосудов; Г-КСФ – гранулоцитарный колониестимулирующий фактор. Данные представлены в виде уровней мРНК (log-трансформированное количество копий на 1 мл) с поправкой по среднему геометрическому референсных генов

 

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Максимальная экспрессия VEGF в тканях эндометрия отмечается в пролиферативную фазу менструального цикла [6], при этом его экспрессию стимулируют гестагены, простагландин PGF2α, индуцируемый гипоксией фактор 1α (HIF-1α), фибулин-1, интерлейкины (ИЛ) 11 и 15 типов [8], тромбоцитарный фактор роста (PDGF) [9], в то время как внегипоталамический соматостатин подавляет экспрессию VEGF [7].

В эндометриальной ткани ангиогенез стимулируется гипоксией посредством HIF-1α и секретируемыми полипотентными клетками базального слоя эндометрия SDF-1/CXCL12, ИЛ-8 и ангиогенином [10] (Таблица 3). В эндометрии VEGF стимулирует пролиферацию эндотелиальных клеток, их проницаемость, миграцию и формирование капилляров, однако основная функция VEGF связана с постменструальной регенерацией эндометрия, при этом максимальная экспрессия данного фактора отмечается в раннюю фолликулярную фазу и сопровождается быстрым всплеском ангиогенеза с целью постменструального восстановления эндометриальной ткани и реэпителизации эндометрия [8]. Как эстрогены, так и гестагены по-разному активируют ангиогенез в эндометрии [11]. Нами установлено, что Г-КСФ способен дозозависимо стимулировать экспрессию VEGF, что является механизмом стимуляции ангиогенеза и согласуется с данными других авторов [12].

Транскрипционный фактор HOXA10 является важным регулятором рецептивности эндометрия [13], показано, что его ингибирование путем сумоилирования и гиперметилирования приводит к снижению частоты наступления беременности in vivo. Нами установлено, что Г-КСФ способен дозозависимо повышать экспрессию HOXA10 in vitro, что вероятно нормализует рецептивность эндометрия и является одним из механизмов повышения частоты наступления беременности при лечении пациенток с повторными неудачами имплантации с помощью Г-КСФ.

 

Таблица 3. Регуляция ангиогенеза в эндометрии

Table 3. Regulation of angiogenesis in the endometrium

	Гипоксия	E2	E2+P	Г-КСФ
VEGF	↑↑	↑↑	0	↑
ANGPT1	↓	↓	0	н.д.
ANGPT2	0	0	↓↓	н.д.
SDF-1		↑↑	0	н.д.
ИЛ-8	0	0	↓	↑
Ангиогенин	↑	0	↑↑	н.д.

Примечание: «↑» - повышение, «↓» - снижение, «0» - отсутствие эффекта,  E2 – эстрадиол, P – прогестерон, VEGF – фактор роста эндотелия сосудов ANGPT – ангиопоэтин; SDF-1 ‒ стромально-клеточный фактор 1, ИЛ-8 ‒ интерлейкин 8 типа, н.д. – нет данных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные нами данные четко демонстрируют плейотропный эффект Г-КСФ. Дозозависимая стимуляция экспрессии VEGF и HOXA10 вероятно лежит в основе стимуляции Г-КСФ регенерации эндометрия у пациенток с синдромом рефрактерного эндометрия и повторными неудачами программ ВРТ посредством активации ангиогенеза и нормализации рецептивности эндометрия.

About the authors

Vladislava Khalenko

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта»

Author for correspondence.
Email: vkhalenko@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-5313-2259

мнс отдела репродуктологии

Russian Federation

Julian R. Ryzhov

D.O. Ott Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproduction

Email: julian.ryzhov@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-5073-8279

к.м.н., н.с. отдела репродуктологии

Russian Federation, 199034, Saint-Petersburg, Mendeleevskaya line, 3

Ksenia V. Ob’edkova

The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D. O. Ott

Email: obedkova_ks@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2056-7907
SPIN-code: 2709-2890

MD, Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation, Saint Petersburg

Natalya I. Tapilskaya

D.O. Ott Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproduction; St. Petersburg State Pediatric Medical University, Ministry of Health of Russia

Email: alexander.swidsinski@charite.de
ORCID iD: 0000-0001-5309-0087

Dr. Med. Sci., Professor, Head of the Department of Reproductology, D.O. Ott Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology; Professor, Department of Obstetrics and Gynecology, St. Petersburg State Pediatric Medical University, Ministry of Health of Russia

Russian Federation, St. Petersburg; St. Petersburg

References