Уровень мРНК рецепторов орексина второго типа (ORXR2) в условиях хронической алкоголизации в структурах мозга крыс

Обложка


Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Доступ платный или только для подписчиков

Аннотация

Актуальность. Орексин и его рецепторы вовлечены в механизмы патологического влечения к алкоголю, однако об экспрессии гена OX2R в мозге в условиях алкогольной зависимости нет однозначного ответа.

Целью настоящего исследования было определение уровня мРНК OX2R в эмоциогенных структурах мозга у крыс в условиях длительной алкоголизации и в период абстиненции.

Материалы и методы. Взрослых самцов крыс Вистар подвергали полунасильственной алкоголизации 15 % раствором этанола в качестве единственного источника жидкости в течение 6 мес. Крыс декапитировали после хронической алкоголизации, а также на 1-й и 7-й дни после отмены алкоголя. Образцы структур мозга (префронтальная кора, гиппокамп, вентральная область покрышки) замораживали в жидком азоте и хранили при температуре –80 °C. Определение уровня мРНК OX2R производили с помощью метода ПЦР-анализа.

Результаты. Уровень экспрессии гена ORXR2 достоверно повышался в гиппокампе на 7-й день абстиненции по отношению как к группе интактных животных, так и к группе хронически алкоголизированных крыс. В префронтальной коре и вентральной области покрышки уровень мРНК OX2R не изменялся на 1-й и 7-й дни после отмены алкоголя по отношению как к группе алкоголизации, так и к группе интактных животных.

Выводы. Система орексина может представлять новую потенциальную терапевтическую цель для предотвращения рецидива при синдроме отмены алкоголя. Вместе с ранее полученными данными сделано заключение, что антагонисты рецепторов орексина в перспективе могут применяться для снижения патологического влечения к алкоголю.

Полный текст

АКТУАЛЬНОСТЬ

Значительное число исследований подтверждает вклад орексинов в развитие патологического влечения к алкоголю, но особая роль каждого подтипа рецептора остается спорной [1, 10, 12, 23]. Селективные антагонисты рецепторов орексина в исследованиях показывают перспективы их применения для лечения патологического влечения к алкоголю [3, 24]. Орексины были первоначально описаны как модуляторы пищевого поведения в связи с локализацией продуцирующих орексин нейронов в ограниченной области латерального гипоталамуса [22]. Дальнейшие исследования показали участие орексинов в регуляции цикла сон – бодрствование [13], механизмах стресса [6–8] и зависимости [4, 5, 11, 17]. Нейроны, экспрессирующие орексины А и B, посылают свои проекции практически ко всем структурам мозга. Высвобождаясь из нервных волокон, орексины связываются с двумя орексиновыми рецепторами: ORXR1 и ORXR2 [14]. Экспрессия генов рецепторов, как ORXR1, так и ORXR2, наблюдается во всех регионах мозга и на периферии, хотя и с разной плотностью. При этом известно, что OX2R экспрессируются в вентральной области покрышки и в гиппокампе [18]. Для OX2R характерна гетеродимеризация между двумя вариациями рецептора [25].

Известно, что орексин и его рецепторы вовлечены в механизмы алкогольной абстиненции и патологического влечения к алкоголю [2, 15, 16], однако об экспрессии гена OX2R в исследованиях нет однозначного ответа, что и послужило целью исследования.

Цель работы заключалась в определении уровня экспрессии гена OX2R в условиях длительной алкоголизации и в период абстиненции в структурах мозга крыс.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе были использованы 48 самцов крыс линии Wistar, полученных из питомника лабораторных животных «Рапполово» (Ленинградская область). Животных содержали по 8–10 особей в клетке. В экспериментах с хронической алкоголизацией взрослых крыс подвергали полунасильственной алкоголизации 15 % раствором этанола в качестве единственного источника жидкости в течение 6 мес. В контрольной группе крысы в качестве источника жидкости получали воду. Взрослых животных декапитировали через 6 мес. после хронической алкоголизации, а также на 1-й и 7-й дни после отмены алкоголя. Образцы необходимых структур мозга (префронтальная кора, гиппокамп, вентральная область покрышки) немедленно замораживали в жидком азоте и хранили при температуре –80 °C до проведения анализа методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Выделение тотальной РНК проводили из 20 мг пробы мозга с использованием реагента TRIzol (Ambion, США) в полном соответствии с инструкцией производителя. Синтез кДНК проводили методом обратной транскрипции в 25 мкл реакционной смеси с использованием РНК-зависимой ДНК-полимеразы вируса лейкемии мышей Молони (M-MuLV обратной транскриптазы, Promega, США); мультиплексную ПЦР с детекцией — в режиме реального времени (Mx3005P, Stratagene, США) в 20 мкл реакционной смеси, содержащей SYBR Green, ROX, смесь специфических прямых и обратных праймеров, подобранных и синтезированных в компании «Beagle» (Россия).

Для статистической обработки полученных количественных данных и построения графиков применяли пакеты программ GraphPadPrizm v.4, SPSS SigmaStat 3,0 и Minitab 14. Использовали непараметрический критерий Краскела – Уоллиса для сравнения групп. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В ходе проведенного исследования выявлено, что уровень экспрессии гена ORXR2 достоверно увеличился в гиппокампе на 7-й день абстиненции по отношению как к группе интактных животных, так и к группе хронически алкоголизированных крыс. В области префронтальной коры и вентральной области покрышки (VTA) уровень мРНК OX2R на 1-й и 7-й день как в группе хронической алкоголизации, так и в группе интактных животных не изменялся см. рисунок.

 

Рис. 1. Влияние алкоголизации и отмены алкоголя на уровень экспрессии гена ORXR2 в структурах мозга крыс. *р < 0,05 по отношению к группе интактных животных; #р < 0,05 по отношению к группе алкоголизированных крыс. Данные нормированы к уровню экспрессии гена глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и рассчитаны в относительных единицах по отношению к величине экспрессии гена ORXR2

 

В литературе имеются краткие сведения о функциях и дисрегуляции рецепторов орексина в гиппокампе, однако известно, что оба типа рецепторов здесь присутствуют, хотя и с разной плотностью [18]. OX2R обнаружены в CA1- и CA3-зоне гиппокампа [15]. Исследования показывают, что OX2R в области CA1 гиппокампа участвуют в развитии условного предпочтения места морфина. При этом блокада OX2R может снизить активность его рецепторов, что подразумевает вероятность рассмотрения антагониста OX2R как благоприятного терапевтического агента для подавления поведения, связанного с наркотиками [21]. Результаты показали, что введение антагонистов SB334867 и TCSOX229 для OX1R и OX2R соответственно в CA1 гиппокампа ослабляет развитие условного предпочтения места, вызванного химической стимуляцией латерального гипоталамуса. Однако у животных это снижение было более значительным при использовании антагониста OX1R, чем при введении антагониста OX2R [9, 20].

Известно, что в гиппокампе находятся гены, которые играют роль в развитии алкогольной зависимости, активность которых изменяется при систематическом потреблении алкоголя. Идентифицировано более 600 таких генов, активность которых различается между алкоголиками и группой контроля. К таким генам относятся: FKBP5, UGT8, переносчик мочевины (SLC14A1), транспортер цинка (SLC39A10), рецептор интерлейкина-1 первого типа (IL1R1), TXNIP, гены глюкокортикоидных рецепторов, гены рецепторов грелина, кортиколиберина [12, 19]. Более 20 генов были исследованы на моделях хронической алкогольной зависимости, в результате получены данные об изменении активности генов при алкоголизме. В связи с этим интерес к изучению функциональной активности генов растет [19].

Система орексина представляет новую потенциальную терапевтическую цель для предотвращения рецидива при синдроме отмены алкоголя. Антагонисты рецепторов орексина в перспективе могут применяться для снижения патологического влечения к алкоголю [14, 15].

Разнообразные антагонисты OX2R демонстрировали снижение уровня потребления этанола и снижение условного предпочтения места этанола [7]. В соответствии с доклиническими данными, недавние исследования выявили у пациентов, страдающих алкоголизмом, некоторую корреляцию между уровнем концентрации орексина в плазме крови и уровнем тяги к алкоголю, предполагая роль орексинов в дисрегуляции молекулярно-генетических механизмов, которая появляется на этих этапах [14].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение роли нейропептидов в формировании аддиктивных состояний и возможность использования фармакологических препаратов на их основе в терапии наркотической и алкогольной зависимости является одним из актуальных направлений медико-биологических исследований. Известно, что система орексина участвует в механизмах алкогольной зависимости, способствуя активации систем, направленных на поиск алкоголя в период абстиненции [16], но особая роль каждого подтипа рецептора остается до сих пор спорной [14]. В нашем исследовании уровень экспрессии гена ORXR2 достоверно увеличился в гиппокампе на 7-й день абстиненции по отношению как к группе интактных животных, так и к группе хронически алкоголизированных крыс. Таким образом, система орексина может представлять новую потенциальную терапевтическую цель для предотвращения рецидива при синдроме отмены алкоголя. Вместе с ранее полученными данными можно сделать вывод, что антагонисты рецепторов орексина в перспективе могут применяться для снижения патологического влечения к алкоголю.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Этический комитет. Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» (№ 10 от 12.10.2020).

×

Об авторах

Эдгар Артурович Сексте

Институт экспериментальной медицины

Автор, ответственный за переписку.
Email: sekste_edgar@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9753-8303

канд. биол. наук, старший научный сотрудник

Россия, Санкт-Петербург

Марат Игоревич Айрапетов

Институт экспериментальной медицины; Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет

Email: interleukin1b@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-8318-9069
SPIN-код: 5982-4075

канд. мед. наук, старший научный сотрудник

Россия, Санкт-Петербург; Санкт-Петербург

Сергей Олегович Ереско

Санкт-Петербургский государственный университет

Email: erescko.sergei@yandex.ru

аспирант

Россия, Санкт-Петербург

Евгений Рудольфович Бычков

Институт экспериментальной медицины

Email: bychkov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8911-6805
SPIN-код: 9408-0799

канд. мед. наук, заведующий лабораторией

Россия, Санкт-Петербург

Андрей Андреевич Лебедев

Институт экспериментальной медицины

Email: aalebedev-iem@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0003-0297-0425
SPIN-код: 4998-5204

д-р биол. наук, профессор, заведующий лабораторией

Россия, Санкт-Петербург

Галина Павловна Косякова

Институт экспериментальной медицины

Email: galkos1@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7211-7839

канд. биол. наук, научный сотрудник

Россия, Санкт-Петербург

Петр Дмитриевич Шабанов

Институт экспериментальной медицины

Email: pdshabanov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1464-1127
SPIN-код: 8974-7477

д-р мед. наук, профессор, заведующий отделом

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

  1. Айрапетов М.И., Сексте Э.А., Ереско С.О., и др. Хроническая алкоголизация приводит к изменению уровня мРНК рецептора орексина первого типа (OX1R) в эмоциогенных структурах мозга крыс // Биомедицинская химия. 2018. Т. 64, № 5. С. 451–454. doi: 10.18097/PBMC20186405451
  2. Айрапетов М.И., Сексте Э.А., Ереско С.О., и др. Уровень мРНК рецепторов орексина первого типа (OX1R) в эмоциогенных структурах мозга крыс при их хронической алкоголизации // Вопросы наркологии. 2018. № 8. С. 18–25.
  3. Лебедев А.А., Шумилов Е.Г., Смирнов А.А., и др. Участие нейропептида орексина A в механизмах подкрепления, активируемых психостимуляторами // Наркология. 2015. Т. 14, № 2(158). С. 12–18.
  4. Тиссен И.Ю., Виноградов П.М., Хохлов П.П., и др. Роль орексиновой системы в механизмах условного предпочтения // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. 2015. Т. 13, № S1. С. 166–167.
  5. Тиссен И.Ю., Виноградов П.М., Хохлов П.П., и др. Участие орексина в организации эмоционального и исследовательского поведения // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. 2015. Т. 13, № S1. С. 168–169.
  6. Тиссен И.Ю., Якушина Н.Д., Лебедев А.А., и др. Эффекты антагониста OX1R рецепторов орексина А SB-408124 на компульсивное поведение и уровень тревожности после витального стресса у крыс // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. 2018. Т. 16, № 1. С. 34–42. doi: 10.17816/RCF16134-42
  7. Тиссен И.Ю., Лебедев А.А., Бычков Е.Р., и др. Орексины и подкрепляюшие системы мозга // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. 2019. Т. 17, № 4. С. 5–18. doi: 10.17816/RCF1745-18
  8. Хохлов П.П., Тиссен И.Ю., Лебедев А.А., и др. Содержание орексина А в структурах головного мозга крыс коррелирует с паттернами поведения у стрессированных крыс // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. 2018. Т. 16, № 4. С. 45–48. doi: 10.17816/RCF16445-48
  9. Шабанов П.Д., Азаренко С.В., Морозов В.И., и др. Тормозящие эффекты антагонистов орексина на подкрепляющие свойства фенамина при самостимуляции мозга и выработке условного предпочтения места у крыс // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. 2019. Т. 17, № 4. С. 57–64. doi: 10.17816/RCF17457-64
  10. Шабанов П.Д., Лебедев А.А., Азаренко С.В. Взаимодействие дофаминергических и орексиновых механизмов безусловного и условного подкрепления // Вопросы наркологии. 2020. № 3(186). С. 53–66. doi: 10.47877/0234-0623_2020_3_53
  11. Шумилов Е.Г., Лебедев А.А., Букинич А.А., и др. Орексины системы расширенной миндалины при введении в ядро ложа конечной полоски действуют на подкрепляющие свойства аддиктивных средств // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. 2015. Т. 13, № S1. С. 203–204.
  12. Airapetov M.I., Sekste E.A., Eresko S.O., et al. Chronic alcoholism influences the mRNA level of the orexin receptor type 1 (OX1R) in emotiogenic structures of the rat brain // Biochemistry (Moscow), Supplement Series B: Biomedical Chemistry. 2019. Vol. 13, No. 1. P. 93–96. doi: 10.1134/S1990750819010025
  13. de Lecea L. Hypocretins and the neurobiology of sleep-wake mechanisms // Prog Brain Res. 2012. Vol. 198. P. 15–24. doi: 10.1016/B978-0-444-59489-1.00003-3
  14. Díaz F.B., López R.M. Orexin receptors as therapeutic targets for addiction and anxiety disorders. Barcelona: Universitat Pompeu Fabra, 2016. 428 p.
  15. Haghparast A., Shafiei I., Alizadeh A.M., et al. Blockade of the orexin receptors in the CA1 region of hippocampus decreased the lateral hypothalamic-induced antinociceptive responses in the model of orofacial formalin test in the rats // Peptides. 2018. Vol. 99. P. 217–222. doi: 10.1016/j.peptides.2017.10.006
  16. Lawrence A.J., Michael S.C., Hong-Ju Y., et al. The orexin system regulates alcohol-seeking in rats // Br J Pharmacol. 2006. Vol. 148, No. 6. P. 752–759. doi: 10.1038/sj.bjp.0706789
  17. Lebedev A.A., Bessolova Yu.N., Efimov N.S., et al. Role of orexin peptide system in emotional overeating induced by brain reward stimulation in fed rats // Research Results in Pharmacology. 2020. Vol. 6, No. 1. P. 81–91 doi: 10.3897/rrpharmacology6.52180
  18. Marcus N., Aschkenasi C.G., Lee C.E., et al. Differential expressiοn οf οrexin receptοrs 1 and 2 in the rat brain // J Cοmp Neurοl. 2001. Vol. 435, No. 1. P. 6–25. doi: 10.1002/cne.1190
  19. Matsumoto I. Proteomics approach in the study of the pathophysiology of alcohol-related brain damage // Alcohol Alcohol. 2009. Vol. 44, No. 2. P. 171–176. doi: 10.1093/alcalc/agn104
  20. Rashidy-Pour A., Moradi M., Fatahi Z., et al. Role of intra-hippocampal orexin 1 and orexin 2 receptors in conditioned place preference induced by chemical stimulation of the lateral hypothalamus // Behav Brain Res. 2015. Vol. 279. P. 106–111. doi: 10.1016/j.bbr.2014.10.051
  21. Sadeghi B., Ezzatpanah S., Haghparast B., et al. Effects of dorsal hippocampal orexin-2 receptor antagonism on the acquisition, expression, and extinction of morphine-induced place preference in rats // Psychopharmacology (Berl). 2016. Vol. 233, No. 12. P. 2329–2341. doi: 10.1007/s00213-016-4280-3
  22. Sakurai T., Amemiya A., Ishii M., et al. Orexins and orexin receptors: a family of hypothalamic neuropeptides and G protein-coupled receptors that regulate feeding behavior // Cell. 1998. Vol. 92, No. 4. P. 573–585. doi: 10.1016/s0092-8674(00)80949-6
  23. Sharf R., Maysa S., Ralph J., et al. Role of orexin/hypocretin in dependence and addiction // Brain Res. 2010. Vol. 1314. P. 30–138. doi: 10.1016/j.brainres.2009.08.028
  24. Tissen I., Vinogradov P.M., Khokhlov P.P., et al. Orexin receptor type 1 (OX1R) are involved in the formation and reinstatement of conditioned place preference // European Neuropsychopharmacology. 2015. Vol. 25, Suppl 2. P. S269–S270. doi: 10.1016/S0924-977X(15)30313-8
  25. Wang C., Wang Q., Ji B., et al. The orexin/receptor system: molecular mechanism and therapeutic potential for neurological diseases // Front Mol Neurosci. 2018. Vol. 11. P. 220. doi: 10.3389/fnmol.2018.00220

© Сексте Э.А., Айрапетов М.И., Ереско С.О., Бычков Е.Р., Лебедев А.А., Косякова Г.П., Шабанов П.Д., 2022

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 65565 от 04.05.2016 г.