Level of mRNA of orexin receptors of second type (ORXR2) in conditions of chronic alcoholation in structures of the rat brain

Cover Page


Cite item

Full Text

Open Access Open Access
Restricted Access Access granted
Restricted Access Subscription or Fee Access

Abstract

BACKGROUND: Orexin and its receptors are involved in the mechanisms of pathological craving for alcohol, but there is no unambiguous answer about the expression of the OX2R gene in the rat brain under conditions of alcohol addiction.

AIM: The aim of this study was to determine the level of OX2R mRNA in brain structures in rats under conditions of prolonged alcoholization and during the period of abstinence.

MATERIALS AND METHODS: Adult male Wistar rats were alcoholized with 15% ethanol as the only source of liquid for 6 months. The rats were decapitated after chronic alcoholization, as well as on the 1st and 7th days of alcohol withdrawal. Samples of brain structures (prefrontal cortex, hippocampus, ventral tegmental area) were frozen in liquid nitrogen and stored at –80°C. Determination of the level of OX2R mRNA was carried out using the method of PCR-analysis.

RESULTS: The level of ORXR2 gene expression significantly increased in the hippocampus on the 7th day of abstinence in relation to the group of intact animals and in relation to the group of chronically alcoholized rats. The level of OX2R mRNA in the prefrontal cortex and ventral tegmental area in animal groups of abstinence (1st and 7th days) did not change in relation to both alcohol and the intact animals.

CONCLUSIONS: It is concluded that the orexin brain system may represent a new potential therapeutic target for the prevention of relapse in alcohol withdrawal. Together with the previously obtained data it was concluded that orexin receptor antagonists can be used to reduce the pathological craving for alcohol.

Full Text

АКТУАЛЬНОСТЬ

Значительное число исследований подтверждает вклад орексинов в развитие патологического влечения к алкоголю, но особая роль каждого подтипа рецептора остается спорной [1, 10, 12, 23]. Селективные антагонисты рецепторов орексина в исследованиях показывают перспективы их применения для лечения патологического влечения к алкоголю [3, 24]. Орексины были первоначально описаны как модуляторы пищевого поведения в связи с локализацией продуцирующих орексин нейронов в ограниченной области латерального гипоталамуса [22]. Дальнейшие исследования показали участие орексинов в регуляции цикла сон – бодрствование [13], механизмах стресса [6–8] и зависимости [4, 5, 11, 17]. Нейроны, экспрессирующие орексины А и B, посылают свои проекции практически ко всем структурам мозга. Высвобождаясь из нервных волокон, орексины связываются с двумя орексиновыми рецепторами: ORXR1 и ORXR2 [14]. Экспрессия генов рецепторов, как ORXR1, так и ORXR2, наблюдается во всех регионах мозга и на периферии, хотя и с разной плотностью. При этом известно, что OX2R экспрессируются в вентральной области покрышки и в гиппокампе [18]. Для OX2R характерна гетеродимеризация между двумя вариациями рецептора [25].

Известно, что орексин и его рецепторы вовлечены в механизмы алкогольной абстиненции и патологического влечения к алкоголю [2, 15, 16], однако об экспрессии гена OX2R в исследованиях нет однозначного ответа, что и послужило целью исследования.

Цель работы заключалась в определении уровня экспрессии гена OX2R в условиях длительной алкоголизации и в период абстиненции в структурах мозга крыс.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе были использованы 48 самцов крыс линии Wistar, полученных из питомника лабораторных животных «Рапполово» (Ленинградская область). Животных содержали по 8–10 особей в клетке. В экспериментах с хронической алкоголизацией взрослых крыс подвергали полунасильственной алкоголизации 15 % раствором этанола в качестве единственного источника жидкости в течение 6 мес. В контрольной группе крысы в качестве источника жидкости получали воду. Взрослых животных декапитировали через 6 мес. после хронической алкоголизации, а также на 1-й и 7-й дни после отмены алкоголя. Образцы необходимых структур мозга (префронтальная кора, гиппокамп, вентральная область покрышки) немедленно замораживали в жидком азоте и хранили при температуре –80 °C до проведения анализа методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Выделение тотальной РНК проводили из 20 мг пробы мозга с использованием реагента TRIzol (Ambion, США) в полном соответствии с инструкцией производителя. Синтез кДНК проводили методом обратной транскрипции в 25 мкл реакционной смеси с использованием РНК-зависимой ДНК-полимеразы вируса лейкемии мышей Молони (M-MuLV обратной транскриптазы, Promega, США); мультиплексную ПЦР с детекцией — в режиме реального времени (Mx3005P, Stratagene, США) в 20 мкл реакционной смеси, содержащей SYBR Green, ROX, смесь специфических прямых и обратных праймеров, подобранных и синтезированных в компании «Beagle» (Россия).

Для статистической обработки полученных количественных данных и построения графиков применяли пакеты программ GraphPadPrizm v.4, SPSS SigmaStat 3,0 и Minitab 14. Использовали непараметрический критерий Краскела – Уоллиса для сравнения групп. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В ходе проведенного исследования выявлено, что уровень экспрессии гена ORXR2 достоверно увеличился в гиппокампе на 7-й день абстиненции по отношению как к группе интактных животных, так и к группе хронически алкоголизированных крыс. В области префронтальной коры и вентральной области покрышки (VTA) уровень мРНК OX2R на 1-й и 7-й день как в группе хронической алкоголизации, так и в группе интактных животных не изменялся см. рисунок.

 

Рис. 1. Влияние алкоголизации и отмены алкоголя на уровень экспрессии гена ORXR2 в структурах мозга крыс. *р < 0,05 по отношению к группе интактных животных; #р < 0,05 по отношению к группе алкоголизированных крыс. Данные нормированы к уровню экспрессии гена глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и рассчитаны в относительных единицах по отношению к величине экспрессии гена ORXR2

 

В литературе имеются краткие сведения о функциях и дисрегуляции рецепторов орексина в гиппокампе, однако известно, что оба типа рецепторов здесь присутствуют, хотя и с разной плотностью [18]. OX2R обнаружены в CA1- и CA3-зоне гиппокампа [15]. Исследования показывают, что OX2R в области CA1 гиппокампа участвуют в развитии условного предпочтения места морфина. При этом блокада OX2R может снизить активность его рецепторов, что подразумевает вероятность рассмотрения антагониста OX2R как благоприятного терапевтического агента для подавления поведения, связанного с наркотиками [21]. Результаты показали, что введение антагонистов SB334867 и TCSOX229 для OX1R и OX2R соответственно в CA1 гиппокампа ослабляет развитие условного предпочтения места, вызванного химической стимуляцией латерального гипоталамуса. Однако у животных это снижение было более значительным при использовании антагониста OX1R, чем при введении антагониста OX2R [9, 20].

Известно, что в гиппокампе находятся гены, которые играют роль в развитии алкогольной зависимости, активность которых изменяется при систематическом потреблении алкоголя. Идентифицировано более 600 таких генов, активность которых различается между алкоголиками и группой контроля. К таким генам относятся: FKBP5, UGT8, переносчик мочевины (SLC14A1), транспортер цинка (SLC39A10), рецептор интерлейкина-1 первого типа (IL1R1), TXNIP, гены глюкокортикоидных рецепторов, гены рецепторов грелина, кортиколиберина [12, 19]. Более 20 генов были исследованы на моделях хронической алкогольной зависимости, в результате получены данные об изменении активности генов при алкоголизме. В связи с этим интерес к изучению функциональной активности генов растет [19].

Система орексина представляет новую потенциальную терапевтическую цель для предотвращения рецидива при синдроме отмены алкоголя. Антагонисты рецепторов орексина в перспективе могут применяться для снижения патологического влечения к алкоголю [14, 15].

Разнообразные антагонисты OX2R демонстрировали снижение уровня потребления этанола и снижение условного предпочтения места этанола [7]. В соответствии с доклиническими данными, недавние исследования выявили у пациентов, страдающих алкоголизмом, некоторую корреляцию между уровнем концентрации орексина в плазме крови и уровнем тяги к алкоголю, предполагая роль орексинов в дисрегуляции молекулярно-генетических механизмов, которая появляется на этих этапах [14].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение роли нейропептидов в формировании аддиктивных состояний и возможность использования фармакологических препаратов на их основе в терапии наркотической и алкогольной зависимости является одним из актуальных направлений медико-биологических исследований. Известно, что система орексина участвует в механизмах алкогольной зависимости, способствуя активации систем, направленных на поиск алкоголя в период абстиненции [16], но особая роль каждого подтипа рецептора остается до сих пор спорной [14]. В нашем исследовании уровень экспрессии гена ORXR2 достоверно увеличился в гиппокампе на 7-й день абстиненции по отношению как к группе интактных животных, так и к группе хронически алкоголизированных крыс. Таким образом, система орексина может представлять новую потенциальную терапевтическую цель для предотвращения рецидива при синдроме отмены алкоголя. Вместе с ранее полученными данными можно сделать вывод, что антагонисты рецепторов орексина в перспективе могут применяться для снижения патологического влечения к алкоголю.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Этический комитет. Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» (№ 10 от 12.10.2020).

×

About the authors

Edgard A. Sekste

Institute of Experimental Medicine

Author for correspondence.
Email: sekste_edgar@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9753-8303

Cand. Sci. (Biol.), Researcher

Russian Federation, Saint Petersburg

Marat I. Airapetov

Institute of Experimental Medicine; St. Petersburg State Pediatric Medical University

Email: interleukin1b@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-8318-9069
SPIN-code: 5982-4075

Cand. Sci. Med. (Pharmacology), Senior Researcher

Russian Federation, Saint Petersburg; Saint Petersburg

Sergei O. Eresko

Saint Petersburg State University

Email: erescko.sergei@yandex.ru

Postgraduate student

Russian Federation, Saint Petersburg

Eugeny R. Bychkov

Institute of Experimental Medicine

Email: bychkov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8911-6805
SPIN-code: 9408-0799

Cand. Sci. Med. (Pathophysiology)

Russian Federation, Saint Petersburg

Andrei A. Lebedev

Institute of Experimental Medicine

Email: aalebedev-iem@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0003-0297-0425
SPIN-code: 4998-5204

Dr. Biol. Sci. (Pharmacology), Professor, Head of the Laboratory

Russian Federation, Saint Petersburg

Galina P. Kosyakova

Institute of Experimental Medicine

Email: galkos1@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7211-7839

Cand. Sci. (Biol.), Researcher

Russian Federation, Saint Petersburg

Petr D. Shabanov

Institute of Experimental Medicine

Email: pdshabanov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1464-1127
SPIN-code: 8974-7477

Dr. Med. Sci. (Pharmacology), Professor and Head of the Department

Russian Federation, Saint Petersburg

References

  1. Airapetov MI, Sekste EA, Eresko SO, et al. Chronic alcoholism influences the mRNA level of the orexin receptor type 1 (OX1R) in emotiogenic structures of the rat brain. Biomed Khimiya. 2018;64(5):451–454. (In Russ.) doi: 10.18097/PBMC20186405451
  2. Airapetov MI, Sekste EA, Eresko SO, et al. Orexin receptor type 1 (OX1R) mRNA level in emotiogenic structures of the brain under chronic alcoholization. Journal of Addiction Problems. 2018;(8):18–25. (In Russ.)
  3. Lebedev AA, Shumilov EG, Smirnov AA, et al. Neuropeptide orexin A participates in psychostimulant-induced mechanisms of reinforcement. Narcology. 2015;14(2(158):12–18. (In Russ.)
  4. Thyssen IYu, Vinogradov PM, Khokhlov PP, et al. The role of the orexin system in the mechanisms of conditional preference. Reviews on Clinical Pharmacology and Drug Therapy. 2015;139(S1):166–167 (In Russ.)
  5. Thyssen IYu, Vinogradov PM, Khokhlov PP, et al. Involvement of orexin in the organization of emotional and exploratory behavior. Reviews on Clinical Pharmacology and Drug Therapy. 2015;13(S1):168–169. (In Russ.)
  6. Thyssen IYu, Yakushina ND, Lebedev AA, et al. Effect of SB-408124, an orexin A OX1R receptor antagonist, on the compulsive behavior and the level of anxiety after the vital stress in rats. Reviews on Clinical Pharmacology and Drug Therapy. 2018;16(1):34–42. (In Russ.) doi: 10.17816/RCF16134-42
  7. Thyssen IYu, Lebedev AA, Bychkov ER, et al. Orexins and the brain reinforcing systems. Reviews on Clinical Pharmacology and Drug Therapy. 2019;17(4):5–18. (In Russ.) doi: 10.17816/RCF1745-18
  8. Khokhlov PP, Thyssen IYu, Lebedev AA, et al. Orexin A content in rat brain structures correlates with behavioral patterns in stressed rats. Reviews on Clinical Pharmacology and Drug Therapy. 2018;16(4):45–48. (In Russ.) doi: 10.17816/RCF16445-48
  9. Shabanov PD, Azarenko SV, Morozov VI, et al. Inhibitory effects of orexin antagonists on the reinforcing properties of phenamine in brain self-stimulation and conditional site preference in rats. Reviews on Clinical Pharmacology and Drug Therapy. 2019;17(4): 57–64. (In Russ.) doi: 10.17816/RCF17457-64
  10. Shabanov PD, Lebedev AA, Azarenko SV. Interaction of dopaminergic and orexin mechanisms of unconditioned and conditioned reinforcement. Journal of Addiction Problems. 2020;3(186):53–66. (In Russ.) doi: 10.47877/0234-0623_2020_3_53
  11. Shumilov EG, Lebedev AA, Bukinich AA, et al. Orexins of the enlarged amygdala, when injected into the core of the bed of the final strip, act on the reinforcing properties of addictive drugs. Reviews on Clinical Pharmacology and Drug Therapy. 2015;13(S1):203–204. (In Russ.)
  12. Airapetov MI, Sekste EA, Eresko SO, et al. Chronic alcoholism influences the mRNA level of the orexin receptor type 1 (OX1R) in emotiogenic structures of the rat brain. Biochemistry (Moscow) Supplement. Series B: Biomed Khim. 2019;13(1):93–96. doi: 10.1134/S1990750819010025
  13. de Lecea L. Hypocretins and the neurobiology of sleep-wake mechanisms. Prog Brain Res. 2012;198:15–24. doi: 10.1016/B978-0-444-59489-1.00003-3
  14. Díaz FB, López RM. Orexin receptors as therapeutic targets for addiction and anxiety disorders. Barcelona: Universitat Pompeu Fabra; 2016. 428 p.
  15. Haghparast A, Shafiei I, Alizadeh AM, et al. Blockade of the orexin receptors in the CA1 region of hippocampus decreased the lateral hypothalamic-induced antinociceptive responses in the model of orofacial formalin test in the rats. Peptides. 2018;99:217–222. doi: 10.1016/j.peptides.2017.10.006
  16. Lawrence AJ, Michael SC, Hong-Ju Y, et al. The orexin system regulates alcohol-seeking in rats. Br J Pharmacol. 2006;148(6): 752–759. doi: 10.1038/sj.bjp.0706789
  17. Lebedev AA, Bessolova YuN, Efimov NS, et al. Role of orexin peptide system in emotional overeating induced by brain reward stimulation in fed rats. Research Results in Pharmacology. 2020;6(1):81–91. doi: 10.3897/rrpharmacology6.52180
  18. Marcus N, Aschkenasi CG, Lee CE, et al. Differential expressiοn οf οrexin receptοrs 1 and 2 in the rat brain. J Cοmp Neurοl. 2001;435(1):6–25. doi: 10.1002/cne.1190
  19. Matsumoto I. Proteomics approach in the study of the pathophysiology of alcohol-related brain damage. Alcohol Alcohol. 2009;44:171–176. doi: 10.1093/alcalc/agn104
  20. Rashidy-Pour A, Moradi M, Fatahi Z, et al. Role of intra-hippocampal orexin 1 and orexin 2 receptors in conditioned place preference induced by chemical stimulation of the lateral hypothalamus. Behav Brain Res. 2015;279:106–111. doi: 10.1016/j.bbr.2014.10.051
  21. Sadeghi B, Ezzatpanah S, Haghparast B, et al. Effects of dorsal hippocampal orexin-2 receptor antagonism on the acquisition, expression, and extinction of morphine-induced place preference in rats. Psychopharmacology (Berl). 2016;233(12):2329–2341. doi: 10.1007/s00213-016-4280-3
  22. Sakurai T, Amemiya A, Ishii M, et al. Orexins and orexin receptors: a family of hypothalamic neuropeptides and G protein-coupled receptors that regulate feeding behavior. Cell. 1998;92(4):573–585. doi: 10.1016/s0092-8674(00)80949-6
  23. Sharf R, Maysa S, Ralph J, et al. Role of orexin/hypocretin in dependence and addiction. Brain Res. 2010;1314:130–138. doi: 10.1016/j.brainres.2009.08.028
  24. Tissen I, Vinogradov PM, Khokhlov PP, et al. Orexin receptor type 1 (OX1R) are involved in the formation and reinstatement of conditioned place preference. European Neuropsychopharmacology. 2015;25(Suppl 2):269–270. doi: 10.1016/S0924-977X(15)30313-8
  25. Wang C, Wang Q, Ji B, et al. The orexin/receptor system: molecular mechanism and therapeutic potential for neurological diseases. Front Mol Neurosci. 2018;11:220. doi: 10.3389/fnmol.2018.00220

Copyright (c) 2022 Sekste E.A., Airapetov M.I., Eresko S.O., Bychkov E.R., Lebedev A.A., Kosyakova G.P., Shabanov P.D.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 65565 от 04.05.2016 г.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies