Метод анализа принадлежности лекарственных веществ к субстратам и ингибиторам белка-транспортера гликопротеина-Р in vitro
- Авторы: Якушева Е.Н.1, Щулькин А.В.1, Черных И.В.1, Попова Н.М.1, Котлярова А.А.1, Слепнев А.А.1
-
Учреждения:
- ФГБНУ ВО «Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» Минздрава России
- Выпуск: Том 17, № 1 (2019)
- Страницы: 71-78
- Раздел: Оригинальные исследования
- Статья получена: 30.05.2019
- Статья одобрена: 30.05.2019
- Статья опубликована: 30.05.2019
- URL: https://journals.eco-vector.com/RCF/article/view/12969
- DOI: https://doi.org/10.17816/RCF17171-78
- ID: 12969
Цитировать
Полный текст
Аннотация
В статье описаны современные подходы к тестированию лекарственных веществ на принадлежность к субстратам и ингибиторам белка-транспортера гликопротеина-P (Pgp, ABCB1-белок, MDR1-белок) согласно рекомендациям Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (США) и Европейского агентства лекарственных средств. Представлены методики исследований in vitro на клеточных линиях, гиперэкспрессирующих транспортер. Апробирована методика подобного исследования на линии клеток аденокарциномы ободочной кишки человека (Caco-2).
Ключевые слова
Полный текст
Нежелательные лекарственные реакции являются одной из основных причин госпитализаций, особенно у пожилых пациентов и лиц с полипрагмазией. По данным систематического обзора 45 исследований, в 2000–2013 гг., госпитализация в результате нежелательных лекарственных реакций встречалась в 7 % (2,4–14,9 %) случаев [7]. В развитии нежелательных лекарственных реакций важную роль играют межлекарственные взаимодействия на этапе фармакокинетики, в частности на уровне цитохромов Р450 и белков-транспортеров.
Учитывая данные обстоятельства, c 1997 г. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (Food and Drug Administration, FDA (США)) рекомендует все новые лекарственные средства тестировать на принадлежность к субстратам и ингибиторам семейств цитохромов P450, а с 2006 г. — к субстратам и ингибиторам белков-транспортеров [12]. Аналогичные рекомендации в Европейском агентстве лекарственных средств (European Medicines Agency, ЕМА) появились в 2013 г. [5].
Гликопротеин-Р (P-glycoprotein, Pgp, ABCB 1-белок, MDR 1-белок) — АТФ-зависимый мембранный белок-транспортер, удаляющий из клеток широкий спектр лекарственных веществ — его субстратов [1]. По данным FDA, Pgp участвует в фармакокинетике около 50 % современных лекарственных средств [12], препятствуя их энтеральной абсорбции и проникновению в органы, защищенные гистогематическими барьерами, а также способствуя их экскреции [2].
Согласно современным подходам [12], тестирование лекарственных средств на принадлежность к субстратам и ингибиторам Pgp осуществляется следующим образом. Первоначально исследования проводятся in vitro на клеточных линиях, гиперэкспрессирующих Pgp [12]. Если в опытах in vitro устанавливают, что новое лекарственное средство является ингибитором белка-транспортера, то в дальнейшем его изучают в исследованиях in vivo. Если в опытах in vitro выявляют, что тестируемое вещество не влияет на активность Pgp, то дальнейшие исследования in vivo не требуются [12].
В настоящей статье описаны подходы для оценки принадлежности лекарственных средств к субстратам и ингибиторам Pgp in vitro.
Общие подходы к тестированию лекарственных средств на принадлежность к субстратам гликопротеина-Р in vitro
Исследования in vitro проводятся на клеточных линиях, гиперэкспрессирующих Pgp [12].
Клетки высеивают в специальную трансвелл-систему (transwell), состоящую из двух камер: апикальной и базолатеральной (рис. 1). Дно апикальной камеры представлено полупроницаемой мембраной, на которую высеивают используемые клетки. В дальнейшем клетки культивируют до образования монослоя. В ходе культивирования клетки полярно дифференцируются: на их апикальной мембране синтезируется Pgp, а базальная мембрана, контактирующая с мембраной трансвелл-системы, транспортер не содержит.
Рис. 1. Схематичное изображение трансвелл-системы
При оценке принадлежности тестируемого вещества к субстратам Pgp сначала оценивается его транспорт из апикальной камеры (камера — донор) в базолатеральную (камера — реципиент) — a – b транспорт. Для этого его добавляют в апикальную камеру, а затем через определенные временные интервалы забирают образцы из базолатеральной камеры для определения концентрации вещества. Этот транспорт происходит с помощью пассивной диффузии против работы Pgp.
Затем оценивают транспорт тестируемого вещества из базолатеральной камеры в апикальную (b – a транспорт). Для этого его добавляют в базолатеральную камеру (камера — донор), а затем через определенные временные интервалы забирают образцы из апикальной камеры (камера-реципиент) для определения концентрации субстрата. Данный транспорт происходит как путем пассивной диффузии, так и с помощью белка-транспортера [4].
Транспорт вещества как из камеры a в камеру b, так и обратно оценивают по формуле [4]
где Рарр — коэффициент кажущейся проницаемости (apparent permeability coefficient), dQ/dt — изменение концентрации вещества в камере реципиенте за время инкубации (мкмоль/л · с · см3), A — площадь полупроницаемой мембраны лунки в трансвелл-системе, на которой культивируются клетки (см2), C 0 — начальная концентрация субстрата в камере-доноре (мкмоль/л).
Далее рассчитывается отношение коэффициентов кажущейся проницаемости: Papp b — a к Papp a — b.
Отношение коэффициентов =
Данный параметр является интегральным и оценивает общий вклад Pgp в транспорт веществ через билипидную мембрану (т. к. используется клеточная линия, гиперэкспрессирующая именно данный белок-транспортер).
При отношении коэффициентов более 2 можно говорить об участии Pgp в транспорте. В противном случае транспорт вещества происходит преимущественно путем пассивной диффузии (рис. 2).
Рис. 2. Схема тестирования веществ на принадлежность к субстратам Pgp по Giacomini K.M. et al., 2010 [6].
Примечание. * снижение эффлюкса на 50 % и более; ** дополнительные данные и роли Pgp в общем клиренсе препарата; *** исследования c селективными ингибиторами Pgp (например, верапамилом, итраконазолом); **** BCRP — Breast Cancer Resistance Protein; Pgp — P-glycoprotein, гликопротеин-Р
Для окончательного подтверждения роли Pgp в транспорте изучаемого вещества (при значении отношения коэффициентов кажущейся проницаемости, превышающем 2), выполняют транспортные эксперименты с добавлением специфического ингибитора транспортера с расчетом коэффициентов кажущейся проницаемости Papp b — a, Papp a — b и их отношения. Если на фоне добавления известного ингибитора Pgp происходит снижение коэффициентов кажущейся проницаемости Papp b — a и отношение коэффициентов Papp b — a к Pappb — a, делают заключение о принадлежности тестируемого вещества к субстратам транспортера. Если на фоне добавления ингибитора Pgp эти показатели не изменяются, данный белок-транспортер не играет существенной роли в транспорте тестируемого вещества, а его перемещение осуществляется другими транспортерами, например белок устойчивости к раку молочной железы (BCRP, ABCG2) (рис. 2).
Общие подходы к тестированию лекарственных средств на принадлежность к ингибиторам гликопротеина-Р in vitro
В ходе тестирования лекарственных веществ на принадлежность к ингибиторам Pgp первоначально оценивается транспорт известного субстрата данного белка-транспортера из апикальной камеры в базолатеральную (a — b транспорт). Для этого субстрат добавляется в апикальную камеру, а затем через определенные временные интервалы образцы забираются из базолатеральной камеры для определения концентрации субстрата.
На следующем этапе оценивается транспорт субстрата Pgp из базолатеральной камеры в апикальную (b — a транспорт). Для этого субстрат добавляется в базолатеральную камеру, а затем через определенные временные интервалы образцы забираются из апикальной камеры для определения концентрации субстрата [4].
Коэффициенты кажущейся проницаемости Рарр b — a, Рарр a — b и их отношение рассчитываются по представленным выше формулам [4].
В дальнейшем проводят аналогичные эксперименты с добавлением различных концентраций тестируемого вещества в апикальную и базолатеральную камеры. Оценивают Рарр b — a, Рарр a — b и отношение Рарр b — a к Рарр a — b для субстрата Pgp в присутствии тестируемого вещества.
На основе полученных данных рассчитывают IC50 (концентрацию полумаксимального ингибирования) или константу ингибирования (Ki) для тестируемого вещества.
Для прогнозирования клинической значимости полученных значений IC 50 и Ki используются следующие формулы [3]:
[I]1/IC 50 (или Ki) или [I]2/IC 50 (или Ki),
где [I]1 — среднее арифметическое Сmax (свободная и связанная фракция) после введения тестируемого вещества в максимальной разовой дозе, [I]2 — доза ингибитора в моль/250 мл (где 250 мл — стандартный объем воды, используемый в фармакокинетических исследованиях).
При этом первая формула применяется для прогнозирования ингибирования Pgp на уровне целостного организма (в печени, желудочно-кишечном тракте, почках, гистогематических барьерах), а вторая — для прогнозирования ингибирования транспортера локально в желудочно-кишечном тракте при пероральном приеме тестируемого вещества.
Значения [I]1/IC 50 (или Ki) ≥ 0,1 и [I]2/IC 50 (или Ki) ≥ 10 свидетельствуют о клинической значимости ингибирования активности Pgp и необходимости проведения исследований in vivo на людях (Рис. 3).
Рис. 3. Схема тестирования веществ на принадлежность к субстратам Pgp по Giacomini K.M. et al., 2010 [6].
Примечание. Pgp — гликопротеин-P, IC50 — концентрация полумаксимального ингибирования, Ki — константа ингибирования, [I]1 — среднее арифметическое Сmax (свободная и связанная фракция) после введения тестируемого вещества в максимальной разовой дозе, [I]2 — доза ингибитора в моль/250 мл
Значения [I]1/IC 50 (или Ki) < 0,1 и [I]2/IC 50 (или Ki) < 10 свидетельствуют об отсутствии клинической значимости ингибирования Pgp и не требуют дальнейших исследований in vivo (рис. 3) [9].
При этом стоит обратить внимание на тот факт, что в ходе тестирования in vitro можно обнаружить только прямые ингибиторы Pgp, т. е. вещества, снижающие активность белка-транспортера за счет непосредственного взаимодействия с его молекулой. В то же время если вещество воздействует на активность Pgp опосредованно (косвенно), например, изменяя гормональный фон человека или животного, то данное влияние можно обнаружить только в опытах in vivo, что в настоящее время не учитывается в международных рекомендациях (рис. 3).
Использование линии клеток Caco-2 для тестирования лекарственных средств на принадлежность к субстратам и ингибиторам Pgp in vitro
В наших исследованиях для тестирования лекарственных веществ на принадлежность к субстратам и ингибиторам Pgp in vitro мы используем линию клеток Caco-2 (клетки аденокарциномы ободочной кишки человека). Данная клеточная линия закуплена в ФГБУН «Институт цитологии» РАН (Санкт-Петербург) а им была получена из АТСС (American Type Culture Collection, США). Клетки линии Caco-2 обладают высоким морфологическим и функциональным сходством с кишечными (абсорбирующими) энтероцитами человека [8].
Для подтверждения наличия Pgp в клетках линии Caco-2 выполнено иммуноцитохимическое исследование с помощью первичных и вторичных антител. Выявлено иммунопозитивное окрашивание мембран клеток, что подтверждает наличие данного белка-транспортера в клетках используемой клеточной линии (рис. 4).
Рис. 4. Иммуноцитохимическое окрашивание Pgp-позитивных мембран клеток линии Caco-2 на 22-е сутки культивирования, увеличение 400 раз: a — с использованием первичных антител; b — негатив, без первичных антител.
Примечание. Pgp — P-glycoprotein, гликопротеин-Р
Клетки культивируются при 37 °C и 5 % содержании СО2 в Дульбекко модифицированной среде Игла (Dulbecco’s Modified Eagle Medium, DMEM), содержащей глюкозу (4500 мг/л), L-глутамин (4 ммоль/л), 15 % бычьей сыворотки и по 100 ЕД/мл и 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина соответственно. По достижении 70–90 % конфлюентности клетки пересеиваются (обработка раствором трипсин-ЭДТА — 0,25 % трипсин и 0,2 % ЭДТА) на полупроницаемую мембрану лунок трансвелл-системы, состоящую из двух камер: апикальной и базолатеральной (рис. 1) с плотностью 105/см2 (или 33 000 клеток/ячейка). Дно апикальной камеры представляет собой полупроницаемую мембрану, на которую высеиваются клетки. В работе использовался 24-луночный планшет с полупроницаемой мембраной диаметром 0,33 см и диаметром пор 0,4 мкм (24 mm Transwell®-COL Collagen-Coated 0.4 µm Pore PTFE Membrane Insert, Sterile).
После засеивания клеток на полупроницаемую мембрану трансвелл-системы их культивируют в течение 21 суток, поскольку именно на данном сроке происходит их спонтанная дифференцировка в структуру, подобную кишечному эпителию [8]. Следует отметить, что клетки также приобретают полярную ориентацию: поверхность, обращенная в сторону апикальной камеры, соответствует апикальной поверхности энтероцитов, а поверхность, обращенная к базолатеральной камере, — базальной.
Через 21 сутки при формировании монослоя с плотными клеточными контактами трансвелл-система, содержащая клетки линии Caco-2, используется для проведения транспортных экспериментов.
Целостность монослоя и плотность межклеточных контактов оценивается по уровню трансэпителиального сопротивления (trans epithelial electrical resistance, TEER). По достижении трансэпителиального сопротивления выше 500 мОм · см2 (рис. 5), которое происходит обычно через 21 день, на клетках можно выполнять транспортные эксперименты [11].
Рис. 5. Изменение трансэпителиального сопротивления (trans epithelial electrical resistance, TEER) монослоя клеток линии Caco-2, мОм · см2
Для оценки адекватности используемой клеточной линии проведены транспортные эксперименты с классическим субстратом Pgp — фексофенадином и его ингибиторами — верапамилом и хинидином.
Для выполнения транспортных экспериментов питательная среда заменялась транспортной средой, представляющей собой раствор Хэнкса с добавлением 25 ммоль/л Хепес при рН 7,4 и 1 % диметилсульфоксида.
На первом этапе проведено контрольное исследование: оценивался транспорт классического субстрата Pgp — фексофенадина (Sigma, США) без добавления верапамила и хинидина на 22-е и 90-е сутки культивирования клеток.
Для этого фексофенадин добавлялся в апикальную камеру (камера-донор) в концентрации 150 мкмоль/л [10], затем через 1, 2 и 3 часа производился забор по 50 мкл образцов транспортной среды из базолатеральной камеры (камера-реципиент) с последующим определением концентрации маркерного субстрата (a – b транспорт).
Затем оценивался транспорт фексофенадина из базолатеральной в апикальную камеру (b-a транспорт). Для этого субстрат в аналогичной концентрации добавлялся в базолатеральную камеру, а через 1, 2 и 3 часа по 50 мкл образцов среды забирались из апикальной камеры.
На следующем этапе оценивалось влияние классических ингибиторов Pgp — верапамила (Sigma, США) и хинидина (Sigma, США) на транспорт фексофенадина. Для этого ингибиторы в различных концентрациях добавлялись за 30 мин до начала эксперимента в обе камеры (апикальную и базолатеральную) независимо от направления транспорта фексофенадина, который в дальнейшем анализировался.
Концентрации фексофенадина в транспортной среде определялись методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектированием при длине волны 220 нм. Исследование выполнялось на ВЭЖХ хроматографе «Стайер» (Россия)по оригинальной методике.
Полученная проба транспортной среды (50 мкл), содержащая фексофенадин, разводилась в 150 мкл подвижной фазы, и 100 мкл полученного раствора вводились в хроматограф.
При анализе использовалась хроматографическая колонка Phenomenex Synergi 4u Polar-RP 80A (250 × 4,6) с зернением 4 мкм. Температура разделения — 45 °С. Скорость потока — 1 мл/мин. Состав подвижной фазы: ацетонитрил (128 мл), вода деионизированная (267,4 мл), кислота уксусная ледяная (6,33 мл), триэтиламин до pH = 6,7. Время удерживания фексофенадина в данных условиях составляло 12,8 мин. Количественное определение проводилось методом абсолютной калибровки по площади пиков. Аналитический диапазон методики составлял 1,2–57,4 мкмоль/л.
В ходе выполнения исследования были получены следующие результаты.
Коэффициент кажущейся проницаемости фексофенадина b – а на 22-е сутки культивирования составил 3,79 · 10–6 ± 0,34 · 10–6 см/с, коэффициент кажущейся проницаемости фексофенадина а – b равнялся 0,64 · 10–6 ± 0,21 · 10–6 см/с, а их отношение — 6,27 ± 1,70 (табл. 1). Полученное отношение коэффициентов составило более 2, что свидетельствует об активном транспорте вещества с участием Pgp и согласуется с литературными данными.
Таблица 1. Транспорт фексофенадина в концентрации 150 мкмоль/л через билипидную мембрану клеток линии Caco-2 в норме и при добавлении хинидина 10 мкмоль/л и верапамила 10 мкмоль/л (M ± SD, см/с)
Рарр b – a | Рарр a – b | Рарр (b – a) /Рарр (a – b) | |
Контроль 22-е сутки (n = 3) | 3,79 · 10–6 ± 0,34 · 10–6 | 0,64 · 10–6 ± 0,21 · 10–6 | 6,27 ± 1,70 |
Контроль 90-е сутки (n = 3) | 4,99 · 10–6 ± 1,03 · 10–6 | 0,99 · 10–6 ± 0,19 · 10–6 | 5,03 ± 0,36 |
Хинидин (n = 3) | 3,18 · 10–6 ± 0,23 · 10–6* | 0,96 · 10–6 ± 0,03 · 10–6 | 3,51 ± 0,86* |
Верапамил (n = 3) | 3,86 · 10–6 ± 0,20 · 10–6 | 0,92 · 10–6 ± 0,14 · 10–6 | 4,26 ± 0,44* |
Примечание. * p < 0,05 – достоверные различия с показателями контроля на 22-е и 90-е сутки. |
На 90-е сутки культивирования клеток при выполнении транспортных экспериментов без добавления ингибиторов изучаемые показатели достоверно не отличались от значений на 22-е сутки, что свидетельствует об отсутствии изменений активности изучаемого белка-транспортера при данном сроке эксперимента и возможности использования клеточной линии Caco-2 для транспортных экспериментов на протяжении всего срока.
Добавление в транспортную среду хинидина (ингибитор Pgp) в концентрации 10 мкмоль/л приводило к снижению коэффициента кажущейся проницаемости фексофенадина b – а на 27,6 % (p = 0,026) и отношения коэффициентов b – а к a — b на 37,9 % (p = 0,025) по сравнению с показателями контроля на 22-е и 90-е сутки (табл. 1).
Верапамил (ингибитор Pgp) в концентрации 10 мкмоль/л снижал отношение коэффициентов b – а к а – b на 24,6 % (p = 0,05) по сравнению со значениями без добавления ингибитора (табл. 1).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что хинидин и верапамил снижают активность Pgp, что согласуется с литературными данными.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, проанализированы зарубежные рекомендации по анализу принадлежности лекарственных веществ к субстратам и ингибиторам белка-транспортера — гликопротеина-P in vitro и апробирована методика подобного исследования на линии клеток Caco-2, полученной из ФГБУН ИНЦ РАН (Санкт-Петербург) с использованием фексофенадина в качестве субстрата, хинидина и верапамила в качестве ингибитора и индуктора транспортера соответственно.
Работа поддержана грантами РФФИ № 18-315-00159 мол_а и № 18-415-623001 р_мол_а.
Об авторах
Елена Николаевна Якушева
ФГБНУ ВО «Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» Минздрава России
Автор, ответственный за переписку.
Email: e.yakusheva@rzgmu.ru
д-р мед. наук, профессор, заведующая кафедрой фармакологии с курсом фармации
Россия, РязаньАлексей Владимирович Щулькин
ФГБНУ ВО «Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» Минздрава России
Email: alekseyshulkin@rambler.ru
канд. мед. наук, доцент кафедры фармакологии с курсом фармации ФДПО
Россия, РязаньИван Владимирович Черных
ФГБНУ ВО «Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» Минздрава России
Email: ivchernykh88@mail.ru
канд. биол. наук, ассистент кафедры общей и фармацевтической химии
Россия, РязаньНаталья Михайловна Попова
ФГБНУ ВО «Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» Минздрава России
Email: p34-66@yandex.ru
канд. мед. наук, старший преподаватель кафедры фармакологии с курсом фармации ФДПО
Россия, РязаньАнна Анатольевна Котлярова
ФГБНУ ВО «Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» Минздрава России
Email: kaa.rz@yandex.ru
ассистент кафедры фармакологии с курсом фармации ФДПО
Россия, РязаньАлександр Александрович Слепнев
ФГБНУ ВО «Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» Минздрава России
Email: a.slepnev@rzgmu.ru
канд. биол. наук, доцент кафедры фармакологии с курсом фармации ФДПО
Россия, РязаньСписок литературы
- Якушева Е.Н., Титов Д.С. Структура и функционирование белка множественной лекарственной устойчивости 1 // Биохимия. – 2018. – Т. 83. – № 8. – С. 1148–1172. [Yakusheva EN, Titov DS. Structure and Function of Multidrug Resistance Protein 1. Biochemistry. 2018;83(8):1148–1172. (In Russ.)] https://doi.org/10.1134/S 0320972518080043.
- Якушева Е.Н., Щулькин А.В., Попова Н.М., и др. Структура, функции гликопротеина-Р и его значение для рациональной фармакотерапии // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. – 2014. – Т. 12. – № 2. – С. 3–11. [Yakusheva EN, Shulkin AV, Popova NM, et al. Structure, functions of P-glycoprotein and its role in rational pharmacotherapy. Reviews on clinical pharmacology and drug therapy. 2014;12(2):3-11. (In Russ.)]. https://doi.org/10.17816/RCF1223-11.
- Agarwal S, Arya V, Zhang L. Review of P-gp inhibition data in recently approved new drug applications: utility of the proposed [I(1)]/IC(50) and [I(2)]/IC(50) criteria in the P-gp decision tree. J Clin Pharmacol. 2013;53(2):228-233. https://doi.org/10.1177/0091270011436344.
- Elsby R, Surry DD, Smith VN, Gray AJ. Validation and application of Caco-2 assays for the in vitro evaluation of development candidate drugs as substrates or inhibitors of P-glycoprotein to support regulatory submissions. Xenobiotica. 2008;38(7-8):1140-1164.https://doi.org/10.1080/00498250802050880.
- European medicines agency. Guideline on the investigation of drug interactions [Internet]. 2012 [cited 2019 Mar 20]. Available from: https://www.ema.europa.eu/documents/scientific-guideline/guideline-investigation-drug-interactions_en.pdf.
- Giacomini KM, Huang SM, Tweedie DJ, et al. Membrane transporters in drug development. Nat Rev Drug Discov. 2010;9(3):215-236. https://doi.org/10.1038/nrd3028.
- Al Hamid A, Ghaleb M, Aljadhey H, Aslanpour Z. A systematic review of hospitalization resulting from medicine-related problems in adult patients. Br J Clin Pharmacol. 2014;78(2):202-217. https://doi.org/10.1111/bcp.12293.
- Hilgers AR, Conradi RA, Burton PS. Caco-2 Cell Monolayers as a Model for Drug Transport Across the Intestinal Mucosa. Pharm Res. 1990;7(9):902-910. https://doi.org/10.1023/a:1015937605100.
- Huang SM, Zhang L, Giacomini KM. The International Transporter Consortium: a collaborative group of scientists from academia, industry, and the FDA. Clin Pharmacol Ther. 2010;87(1):32-36. https://doi.org/10.1038/clpt.2009.236.
- Petri N, Tannergren C, Rungstad D, Lennernäs H. Transport Characteristics of Fexofenadine in the Caco-2 Cell Model. Pharm Res. 2004;21(8):1398-1404. https://doi.org/10.1023/B: PHAM.0000036913.90332.b1.
- Srinivasan B, Kolli AR, Esch MB, et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J Lab Autom. 2015;20(2):107-126. https://doi.org/10.1177/2211068214561025.
- U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research. In Vitro Metabolism and Transporter-Mediated Drug-Drug Interaction Studies Guidance for Industry [Internet]. 2017 [cited 2019 Mar 20]. Available from: https://www.fda.gov/downloads/Drugs/Guidances/UCM581965.pdf.