Assessment of drugs belonging to inhibitors and inductors of p-glycoprotein in vitro

Elena N. Yakusheva; Якушева Елена Николаевна; Aleksey V. Shchulkin; Щулькин Алексей Владимирович; Ivan V. Chernykh; Черных Иван Владимирович; Natalia M. Popova; Попова Наталья Михайловна; Anna A. Kotlyarova; Котлярова Анна Анатольевна; Alexandr A. Slepnev; Слепнев Александр Александрович

doi:10.17816/RCF17171-78

Assessment of drugs belonging to inhibitors and inductors of p-glycoprotein in vitro

Authors: Yakusheva E.N.¹, Shchulkin A.V.¹, Chernykh I.V.¹, Popova N.M.¹, Kotlyarova A.A.¹, Slepnev A.A.¹
Affiliations:
1. Ryazan State Medical University
Issue: Vol 17, No 1 (2019)
Pages: 71-78
Section: Original articles
URL: https://journals.eco-vector.com/RCF/article/view/12969
DOI: https://doi.org/10.17816/RCF17171-78
ID: 12969

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Statistics

Abstract

The article describes modern approaches for testing of drugs belonging to substrates and inhibitors of P-glycoprotein (Pgp, ABCB1-protein, MDR1-protein) according to the recommendations of Food and Drug Administration (United States) and European Medicines Agency. In vitro methods on cell lines with hyperexpression of the transporter are presented. The same analysis was done on human colon adenocarcinoma cell line (Caco-2).

Keywords

P-glycoprotein, ABCB1 protein, substrates, inhibitors, in vitro testing, Caco-2 cell line

Full Text

Нежелательные лекарственные реакции являются одной из основных причин госпитализаций, особенно у пожилых пациентов и лиц с полипрагмазией. По данным систематического обзора 45 исследований, в 2000–2013 гг., госпитализация в результате нежелательных лекарственных реакций встречалась в 7 % (2,4–14,9 %) случаев [7]. В развитии нежелательных лекарственных реакций важную роль играют межлекарственные взаимодействия на этапе фармакокинетики, в частности на уровне цитохромов Р450 и белков-транспортеров.

Учитывая данные обстоятельства, c 1997 г. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (Food and Drug Administration, FDA (США)) рекомендует все новые лекарственные средства тестировать на принадлежность к субстратам и ингибиторам семейств цитохромов P450, а с 2006 г. — к субстратам и ингибиторам белков-транспортеров [12]. Аналогичные рекомендации в Европейском агентстве лекарственных средств (European Medicines Agency, ЕМА) появились в 2013 г. [5].

Гликопротеин-Р (P-glycoprotein, Pgp, ABCB 1-белок, MDR 1-белок) — АТФ-зависимый мембранный белок-транспортер, удаляющий из клеток широкий спектр лекарственных веществ — его субстратов [1]. По данным FDA, Pgp участвует в фармакокинетике около 50 % современных лекарственных средств [12], препятствуя их энтеральной абсорбции и проникновению в органы, защищенные гистогематическими барьерами, а также способствуя их экскреции [2].

Согласно современным подходам [12], тестирование лекарственных средств на принадлежность к субстратам и ингибиторам Pgp осуществляется следующим образом. Первоначально исследования проводятся in vitro на клеточных линиях, гиперэкспрессирующих Pgp [12]. Если в опытах in vitro устанавливают, что новое лекарственное средство является ингибитором белка-транспортера, то в дальнейшем его изучают в исследованиях in vivo. Если в опытах in vitro выявляют, что тестируемое вещество не влияет на активность Pgp, то дальнейшие исследования in vivo не требуются [12].

В настоящей статье описаны подходы для оценки принадлежности лекарственных средств к субстратам и ингибиторам Pgp in vitro.

Общие подходы к тестированию лекарственных средств на принадлежность к субстратам гликопротеина-Р in vitro

Исследования in vitro проводятся на клеточных линиях, гиперэкспрессирующих Pgp [12].

Клетки высеивают в специальную трансвелл-систему (transwell), состоящую из двух камер: апикальной и базолатеральной (рис. 1). Дно апикальной камеры представлено полупроницаемой мембраной, на которую высеивают используемые клетки. В дальнейшем клетки культивируют до образования монослоя. В ходе культивирования клетки полярно дифференцируются: на их апикальной мембране синтезируется Pgp, а базальная мембрана, контактирующая с мембраной трансвелл-системы, транспортер не содержит.

Рис. 1. Схематичное изображение трансвелл-системы

При оценке принадлежности тестируемого вещества к субстратам Pgp сначала оценивается его транспорт из апикальной камеры (камера — донор) в базолатеральную (камера — реципиент) — a – b транспорт. Для этого его добавляют в апикальную камеру, а затем через определенные временные интервалы забирают образцы из базолатеральной камеры для определения концентрации вещества. Этот транспорт происходит с помощью пассивной диффузии против работы Pgp.

Затем оценивают транспорт тестируемого вещества из базолатеральной камеры в апикальную (b – a транспорт). Для этого его добавляют в базолатеральную камеру (камера — донор), а затем через определенные временные интервалы забирают образцы из апикальной камеры (камера-реципиент) для определения концентрации субстрата. Данный транспорт происходит как путем пассивной диффузии, так и с помощью белка-транспортера [4].

Транспорт вещества как из камеры a в камеру b, так и обратно оценивают по формуле [4]

$P a p p = \frac{d Q}{d t} \cdot \frac{1}{(A \cdot C_{0})}$

где Рарр — коэффициент кажущейся проницаемости (apparent permeability coefficient), dQ/dt — изменение концентрации вещества в камере реципиенте за время инкубации (мкмоль/л · с · см³), A — площадь полупроницаемой мембраны лунки в трансвелл-системе, на которой культивируются клетки (см²), C 0 — начальная концентрация субстрата в камере-доноре (мкмоль/л).

Далее рассчитывается отношение коэффициентов кажущейся проницаемости: Papp b — a к Papp a — b.

Отношение коэффициентов = $\frac{P a p p b - a}{P a p p a - b}$

Данный параметр является интегральным и оценивает общий вклад Pgp в транспорт веществ через билипидную мембрану (т. к. используется клеточная линия, гиперэкспрессирующая именно данный белок-транспортер).

При отношении коэффициентов более 2 можно говорить об участии Pgp в транспорте. В противном случае транспорт вещества происходит преимущественно путем пассивной диффузии (рис. 2).

Рис. 2. Схема тестирования веществ на принадлежность к субстратам Pgp по Giacomini K.M. et al., 2010 [6].

Примечание. * снижение эффлюкса на 50 % и более; ** дополнительные данные и роли Pgp в общем клиренсе препарата; *** исследования c селективными ингибиторами Pgp (например, верапамилом, итраконазолом); **** BCRP — Breast Cancer Resistance Protein; Pgp — P-glycoprotein, гликопротеин-Р

Для окончательного подтверждения роли Pgp в транспорте изучаемого вещества (при значении отношения коэффициентов кажущейся проницаемости, превышающем 2), выполняют транспортные эксперименты с добавлением специфического ингибитора транспортера с расчетом коэффициентов кажущейся проницаемости Papp b — a, Papp a — b и их отношения. Если на фоне добавления известного ингибитора Pgp происходит снижение коэффициентов кажущейся проницаемости Papp b — a и отношение коэффициентов Papp b — a к Pappb — a, делают заключение о принадлежности тестируемого вещества к субстратам транспортера. Если на фоне добавления ингибитора Pgp эти показатели не изменяются, данный белок-транспортер не играет существенной роли в транспорте тестируемого вещества, а его перемещение осуществляется другими транспортерами, например белок устойчивости к раку молочной железы (BCRP, ABCG2) (рис. 2).

Общие подходы к тестированию лекарственных средств на принадлежность к ингибиторам гликопротеина-Р in vitro

В ходе тестирования лекарственных веществ на принадлежность к ингибиторам Pgp первоначально оценивается транспорт известного субстрата данного белка-транспортера из апикальной камеры в базолатеральную (a — b транспорт). Для этого субстрат добавляется в апикальную камеру, а затем через определенные временные интервалы образцы забираются из базолатеральной камеры для определения концентрации субстрата.

На следующем этапе оценивается транспорт субстрата Pgp из базолатеральной камеры в апикальную (b — a транспорт). Для этого субстрат добавляется в базолатеральную камеру, а затем через определенные временные интервалы образцы забираются из апикальной камеры для определения концентрации субстрата [4].

Коэффициенты кажущейся проницаемости Рарр b — a, Рарр a — b и их отношение рассчитываются по представленным выше формулам [4].

В дальнейшем проводят аналогичные эксперименты с добавлением различных концентраций тестируемого вещества в апикальную и базолатеральную камеры. Оценивают Рарр b — a, Рарр a — b и отношение Рарр b — a к Рарр a — b для субстрата Pgp в присутствии тестируемого вещества.

На основе полученных данных рассчитывают IC₅₀ (концентрацию полумаксимального ингибирования) или константу ингибирования (Ki) для тестируемого вещества.

Для прогнозирования клинической значимости полученных значений IC₅₀ и Ki используются следующие формулы [3]:

[I]₁/IC₅₀ (или Ki) или [I]₂/IC₅₀ (или Ki),

где [I]₁ — среднее арифметическое С_max (свободная и связанная фракция) после введения тестируемого вещества в максимальной разовой дозе, [I]₂ — доза ингибитора в моль/250 мл (где 250 мл — стандартный объем воды, используемый в фармакокинетических исследованиях).

При этом первая формула применяется для прогнозирования ингибирования Pgp на уровне целостного организма (в печени, желудочно-кишечном тракте, почках, гистогематических барьерах), а вторая — для прогнозирования ингибирования транспортера локально в желудочно-кишечном тракте при пероральном приеме тестируемого вещества.

Значения [I]₁/IC₅₀ (или Ki) ≥ 0,1 и [I]₂/IC₅₀ (или Ki) ≥ 10 свидетельствуют о клинической значимости ингибирования активности Pgp и необходимости проведения исследований in vivo на людях (Рис. 3).

Рис. 3. Схема тестирования веществ на принадлежность к субстратам Pgp по Giacomini K.M. et al., 2010 [6].

Примечание. Pgp — гликопротеин-P, IC50 — концентрация полумаксимального ингибирования, Ki — константа ингибирования, [I]₁ — среднее арифметическое Сmax (свободная и связанная фракция) после введения тестируемого вещества в максимальной разовой дозе, [I]₂ — доза ингибитора в моль/250 мл

Значения [I]₁/IC₅₀ (или Ki) < 0,1 и [I]₂/IC₅₀ (или Ki) < 10 свидетельствуют об отсутствии клинической значимости ингибирования Pgp и не требуют дальнейших исследований in vivo (рис. 3) [9].

При этом стоит обратить внимание на тот факт, что в ходе тестирования in vitro можно обнаружить только прямые ингибиторы Pgp, т. е. вещества, снижающие активность белка-транспортера за счет непосредственного взаимодействия с его молекулой. В то же время если вещество воздействует на активность Pgp опосредованно (косвенно), например, изменяя гормональный фон человека или животного, то данное влияние можно обнаружить только в опытах in vivo, что в настоящее время не учитывается в международных рекомендациях (рис. 3).

Использование линии клеток Caco-2 для тестирования лекарственных средств на принадлежность к субстратам и ингибиторам Pgp in vitro

В наших исследованиях для тестирования лекарственных веществ на принадлежность к субстратам и ингибиторам Pgp in vitro мы используем линию клеток Caco-2 (клетки аденокарциномы ободочной кишки человека). Данная клеточная линия закуплена в ФГБУН «Институт цитологии» РАН (Санкт-Петербург) а им была получена из АТСС (American Type Culture Collection, США). Клетки линии Caco-2 обладают высоким морфологическим и функциональным сходством с кишечными (абсорбирующими) энтероцитами человека [8].

Для подтверждения наличия Pgp в клетках линии Caco-2 выполнено иммуноцитохимическое исследование с помощью первичных и вторичных антител. Выявлено иммунопозитивное окрашивание мембран клеток, что подтверждает наличие данного белка-транспортера в клетках используемой клеточной линии (рис. 4).

Рис. 4. Иммуноцитохимическое окрашивание Pgp-позитивных мембран клеток линии Caco-2 на 22-е сутки культивирования, увеличение 400 раз: a — с использованием первичных антител; b — негатив, без первичных антител.

Примечание. Pgp — P-glycoprotein, гликопротеин-Р

Клетки культивируются при 37 °C и 5 % содержании СО₂ в Дульбекко модифицированной среде Игла (Dulbecco’s Modified Eagle Medium, DMEM), содержащей глюкозу (4500 мг/л), L-глутамин (4 ммоль/л), 15 % бычьей сыворотки и по 100 ЕД/мл и 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина соответственно. По достижении 70–90 % конфлюентности клетки пересеиваются (обработка раствором трипсин-ЭДТА — 0,25 % трипсин и 0,2 % ЭДТА) на полупроницаемую мембрану лунок трансвелл-системы, состоящую из двух камер: апикальной и базолатеральной (рис. 1) с плотностью 10⁵/см² (или 33 000 клеток/ячейка). Дно апикальной камеры представляет собой полупроницаемую мембрану, на которую высеиваются клетки. В работе использовался 24-луночный планшет с полупроницаемой мембраной диаметром 0,33 см и диаметром пор 0,4 мкм (24 mm Transwell®-COL Collagen-Coated 0.4 µm Pore PTFE Membrane Insert, Sterile).

После засеивания клеток на полупроницаемую мембрану трансвелл-системы их культивируют в течение 21 суток, поскольку именно на данном сроке происходит их спонтанная дифференцировка в структуру, подобную кишечному эпителию [8]. Следует отметить, что клетки также приобретают полярную ориентацию: поверхность, обращенная в сторону апикальной камеры, соответствует апикальной поверхности энтероцитов, а поверхность, обращенная к базолатеральной камере, — базальной.

Через 21 сутки при формировании монослоя с плотными клеточными контактами трансвелл-система, содержащая клетки линии Caco-2, используется для проведения транспортных экспериментов.

Целостность монослоя и плотность межклеточных контактов оценивается по уровню трансэпителиального сопротивления (trans epithelial electrical resistance, TEER). По достижении трансэпителиального сопротивления выше 500 мОм · см²(рис. 5), которое происходит обычно через 21 день, на клетках можно выполнять транспортные эксперименты [11].

Рис. 5. Изменение трансэпителиального сопротивления (trans epithelial electrical resistance, TEER) монослоя клеток линии Caco-2, мОм · см2

Для оценки адекватности используемой клеточной линии проведены транспортные эксперименты с классическим субстратом Pgp — фексофенадином и его ингибиторами — верапамилом и хинидином.

Для выполнения транспортных экспериментов питательная среда заменялась транспортной средой, представляющей собой раствор Хэнкса с добавлением 25 ммоль/л Хепес при рН 7,4 и 1 % диметилсульфоксида.

На первом этапе проведено контрольное исследование: оценивался транспорт классического субстрата Pgp — фексофенадина (Sigma, США) без добавления верапамила и хинидина на 22-е и 90-е сутки культивирования клеток.

Для этого фексофенадин добавлялся в апикальную камеру (камера-донор) в концентрации 150 мкмоль/л [10], затем через 1, 2 и 3 часа производился забор по 50 мкл образцов транспортной среды из базолатеральной камеры (камера-реципиент) с последующим определением концентрации маркерного субстрата (a – b транспорт).

Затем оценивался транспорт фексофенадина из базолатеральной в апикальную камеру (b-a транспорт). Для этого субстрат в аналогичной концентрации добавлялся в базолатеральную камеру, а через 1, 2 и 3 часа по 50 мкл образцов среды забирались из апикальной камеры.

На следующем этапе оценивалось влияние классических ингибиторов Pgp — верапамила (Sigma, США) и хинидина (Sigma, США) на транспорт фексофенадина. Для этого ингибиторы в различных концентрациях добавлялись за 30 мин до начала эксперимента в обе камеры (апикальную и базолатеральную) независимо от направления транспорта фексофенадина, который в дальнейшем анализировался.

Концентрации фексофенадина в транспортной среде определялись методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектированием при длине волны 220 нм. Исследование выполнялось на ВЭЖХ хроматографе «Стайер» (Россия)по оригинальной методике.

Полученная проба транспортной среды (50 мкл), содержащая фексофенадин, разводилась в 150 мкл подвижной фазы, и 100 мкл полученного раствора вводились в хроматограф.

При анализе использовалась хроматографическая колонка Phenomenex Synergi 4u Polar-RP 80A (250 × 4,6) с зернением 4 мкм. Температура разделения — 45 °С. Скорость потока — 1 мл/мин. Состав подвижной фазы: ацетонитрил (128 мл), вода деионизированная (267,4 мл), кислота уксусная ледяная (6,33 мл), триэтиламин до pH = 6,7. Время удерживания фексофенадина в данных условиях составляло 12,8 мин. Количественное определение проводилось методом абсолютной калибровки по площади пиков. Аналитический диапазон методики составлял 1,2–57,4 мкмоль/л.

В ходе выполнения исследования были получены следующие результаты.

Коэффициент кажущейся проницаемости фексофенадина b – а на 22-е сутки культивирования составил 3,79 · 10^–6 ± 0,34 · 10^–6 см/с, коэффициент кажущейся проницаемости фексофенадина а – b равнялся 0,64 · 10^–6± 0,21 · 10^–6см/с, а их отношение — 6,27 ± 1,70 (табл. 1). Полученное отношение коэффициентов составило более 2, что свидетельствует об активном транспорте вещества с участием Pgp и согласуется с литературными данными.

Таблица 1. Транспорт фексофенадина в концентрации 150 мкмоль/л через билипидную мембрану клеток линии Caco-2 в норме и при добавлении хинидина 10 мкмоль/л и верапамила 10 мкмоль/л (M ± SD, см/с)

	Рарр b – a	Рарр a – b	Рарр (b – a) /Рарр (a – b)
Контроль 22-е сутки (n = 3)	3,79 · 10^–6 ± 0,34 · 10^–6	0,64 · 10^–6 ± 0,21 · 10^–6	6,27 ± 1,70
Контроль 90-е сутки (n = 3)	4,99 · 10^–6 ± 1,03 · 10^–6	0,99 · 10^–6 ± 0,19 · 10^–6	5,03 ± 0,36
Хинидин (n = 3)	3,18 · 10^–6 ± 0,23 · 10^–6*	0,96 · 10^–6 ± 0,03 · 10^–6	3,51 ± 0,86*
Верапамил (n = 3)	3,86 · 10^–6 ± 0,20 · 10^–6	0,92 · 10^–6 ± 0,14 · 10^–6	4,26 ± 0,44*
Примечание. * p < 0,05 – достоверные различия с показателями контроля на 22-е и 90-е сутки.

На 90-е сутки культивирования клеток при выполнении транспортных экспериментов без добавления ингибиторов изучаемые показатели достоверно не отличались от значений на 22-е сутки, что свидетельствует об отсутствии изменений активности изучаемого белка-транспортера при данном сроке эксперимента и возможности использования клеточной линии Caco-2 для транспортных экспериментов на протяжении всего срока.

Добавление в транспортную среду хинидина (ингибитор Pgp) в концентрации 10 мкмоль/л приводило к снижению коэффициента кажущейся проницаемости фексофенадина b – а на 27,6 % (p = 0,026) и отношения коэффициентов b – а к a — b на 37,9 % (p = 0,025) по сравнению с показателями контроля на 22-е и 90-е сутки (табл. 1).

Верапамил (ингибитор Pgp) в концентрации 10 мкмоль/л снижал отношение коэффициентов b – а к а – b на 24,6 % (p = 0,05) по сравнению со значениями без добавления ингибитора (табл. 1).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что хинидин и верапамил снижают активность Pgp, что согласуется с литературными данными.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, проанализированы зарубежные рекомендации по анализу принадлежности лекарственных веществ к субстратам и ингибиторам белка-транспортера — гликопротеина-P in vitro и апробирована методика подобного исследования на линии клеток Caco-2, полученной из ФГБУН ИНЦ РАН (Санкт-Петербург) с использованием фексофенадина в качестве субстрата, хинидина и верапамила в качестве ингибитора и индуктора транспортера соответственно.

Работа поддержана грантами РФФИ № 18-315-00159 мол_а и № 18-415-623001 р_мол_а.