Гиполипидемическое и антиатеросклеротическое действие отечественного оригинального ферментного препарата в эксперименте
- Авторы: Окуневич И.В.1, Клюева Н.Н.1, Парфёнова Н.С.1, Белова Е.В.1
-
Учреждения:
- ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»
- Выпуск: Том 17, № 3 (2019)
- Страницы: 79-84
- Раздел: Оригинальные исследования
- Статья получена: 21.09.2019
- Статья одобрена: 21.09.2019
- Статья опубликована: 21.09.2019
- URL: https://journals.eco-vector.com/RCF/article/view/16206
- DOI: https://doi.org/10.17816/RCF17379-84
- ID: 16206
Цитировать
Полный текст
Аннотация
Экспериментальное масштабное исследование посвящено результатам многолетнего изучения биологической, гиполипидемической и антиатеросклеротической активности оригинального отечественного ферментного препарата микробного происхождения холестериноксидазы (ХСО). В опытах in vitro была выявлена способность ХСО снижать содержание холестерина в пищевых продуктах (молоко и яичные желтки). Данный способ перспективен для использования в пищевой промышленности при получении диетических продуктов, обедненных холестерином. Для возможного применения ферментного препарата ХСО в медицинской практике в качестве гиполипидемического и антиатеросклеротического средства были проведены доклинические исследования. В хронических опытах in vivo (крысы, кролики, собаки) была установлена низкая токсичность, хорошая переносимость и антиатеросклеротическое действие препарата ХСО. Для оценки действия ХСО в условиях умеренной алиментарной дислипопротеинемии проведены эксперименты на трех видах животных (крысы, морские свинки, кролики). Было показано, что при пероральном введении в дозах от 0,16 до 2–20 единиц активности ферментный препарат ХСО оказывает выраженное гиполипидемическое действие. Отмечено, что в результате применения ХСО значительно улучшается липидный спектр сыворотки крови, нарушенный при моделировании дислипопротеинемии, при этом снижается содержание холестерина атерогенных липопротеинов низкой и промежуточной плотности и увеличивается концентрация холестерина антиатерогенных липопротеинов высокой плотности. Обнаруженные ценные свойства ферментного препарата ХСО представляют интерес для будущего внедрения в качестве липидснижающего средства.
Ключевые слова
Полный текст
ВВЕДЕНИЕ
Известно, что развитие атеросклероза (АС) вызывает появление наиболее серьезных клинических осложнений (ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда, инсульт), которые приводят к инвалидности и высокой смертности больных сердечно-сосудистыми заболеваниями [3, 5]. Одной из причин коморбидного патогенеза АС является накопление в организме человека избыточного количества холестерина (ХС) в артериальной стенке (атеросклеротические повреждения) и в крови — в виде атерогенной дислипопротеинемии (ДЛП). Известно, что атерогенная ДЛП относится к ведущему, но модифицируемому фактору риска АС. Для лечения АС и ДЛП применяются немногочисленные гиполипидемические препараты, имеющие серьезные побочные эффекты. Помимо использования липидснижающих средств профилактики АС необходимо сокращать поступление ХС с пищей, то есть больным рекомендуется употреблять продукты с низким содержанием ХС. Данные ряда популяционных исследований показывают, что существует прямая корреляционная связь между количеством ХС в пище и уровнем ХС в крови, поэтому ограничение приема пищевого ХС — необходимый шаг перед началом интенсивной фармакотерапии АС. Следует подчеркнуть, что уменьшать количество ХС можно и путем его повышенного выведения из организма. Это происходит после длительного приема синтетического сорбента холестирамина в дозе 18–24 г в день, но это крайне неудобно для пациента, так как вызывает выраженные нарушения деятельности желудочно-кишечного тракта. Следовательно, по-прежнему актуален направленный поиск биологически активных веществ различного происхождения, которые корректируют нарушение липидного обмена, особенно среди соединений, близких естественным метаболитам организма. С этой целью применяются как природные ферменты, так и препараты, полученные биотехнологическим путем. Препараты ферментов — амилазы, липоксигеназы, липазы, галактозидазы, пектиназы, пепсина и многих других — находят широкое применение в пищевой промышленности и медицинской практике. Эти ферменты являются действительно высоко активными, а главное, нетоксичными катализаторами, которые обладают исключительной субстратной специфичностью, без них в организме невозможны многие жизненно важные биохимические процессы. Например, при инфаркте миокарда весьма информативны диагностические пробы с ферментами аланинаминотрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза (АСТ), лактатдегидрогеназа (ЛДГ) и КФ (креатинфосфат). Лактат и глюкозооксидаза используются для определения концентрации глюкозы в крови и моче. Липазы требуются для гидролиза жиров и эфиров жирных кислот. Препарат фермента супероксиддисмутазы применяют в качестве метаболического средства для лечения гипоксии, болезней сердца, при трансплантации почек. Протеолитические ферменты (стрептокиназа, урокиназа) необходимы для растворения тромбов, удаления из организма токсических веществ [1, 2].
Источником фермента холестериноксидазы (ХСО) [EC1. 1. 3. 6. ] являются бактерии Streptomices lavendulae. ХСО относится к классу оксидоредуктаз, имеет молекулярную массу 55 кДа и катализирует окислительно-восстановительные реакции, в частности окисление гидроксильного радикала ХС в положении С3 с образованием кетона (холест-4-ен-3-он) и перекиси водорода. ХСО применяют в лабораторной диагностике для определения в сыворотке крови уровня общего ХС и ХС липопротеинов высокой плотности (ЛПВП). В научной литературе отмечен значительный интерес к проблемам, связанным с изучением модификаций ХСО. Современное биотехнологическое применение ХСО, получаемой из различных источников, ее новые физико-химические, биологические и физиологические свойства активно изучаются во многих зарубежных лабораториях [2, 4, 6, 8].
Наше внимание привлек оригинальный отечественный препарат фермента ХСО природного происхождения. Технология получения субстрации ХСО из Streptomices lavendulae штамм ВКМА-5921 почвенного происхождения была разработана в Институте антибиотиков и ферментов медицинского назначения (Санкт-Петербург).
Цель исследования — выявить биологическую активность, гиполипидемическое и антиатеросклеротическое действие бактериального ферментного препарата ХСО из источника (Streptomices lavendulae штамм ВКМА-5921) в модельных опытах in vitro и in vivo.
МЕТОДИКА
Экспериментальные исследования проведены в два этапа. Первый, начальный этап был необходим для выявления специфического действия ХСО. Второй этап посвящен задаче определения влияния ХСО на развитие умеренно высокой ДЛП в модельных опытах на трех видах экспериментальных животных.
В начале первого этапа изучали способность препарата ХСО связывать ХС из пищевых продуктов в опытах in vitro, затем исследовали биологическую активность in vivo (острую и хроническую токсичность на мышах и крысах) и антиатеросклеротическое действие на кроликах. Всего было использовано следующее количество половозрелых экспериментальных животных (самцов): 100 мышей (18–20 г), 350 крыс (180–200 г), 30 кроликов (2,5–2,7 кг), 5 собак (15–18 кг). Эксперименты выполнены в соответствии с Правилами работы с лабораторными животными, которых содержались в условиях искусственного освещения в помещении со свободным доступом к воде и корму.
Во втором этапе серия опытов проведена на более взрослых самцах животных: 155 крысах (250–300 г), 20 морских свинках (360–380 г) и 18 кроликах (3,0–3,5 кг), которых содержались в тех же стандартных условиях вивария. Опытные образцы ферментного препарата ХСО вводили ежедневно, перорально, в дозах, рассчитанных в единицах активности (от 0,16 до 10 ЕД).
Экспериментальную, алиментарную ДЛП (гиперлипидемию) у крыс, морских свинок и кроликов вызывали в соответствии с «Методическими рекомендациями по доклиническому изучению новых гиполипидемических и антиатеросклеротических средств» (2012). Для этого использовали атерогенный рацион — гиперхолестериновую (ГХС) диету. У крыс умеренно высокую гиперлипидемию вызывали применением специальной ГХС диеты, скармливая опытный рацион, обогащенный пищевым холестерином (ХС) в виде 5 % прогретой смеси с подсолнечным маслом и повреждающим тиреоидсупрессорным агентом — метилтиоурацилом (МТУ 0,12 %) в течение 20 дней. Гиперлипидемию у морских свинок создавали кормлением ГХС диетой, содержащей избыточное количество пищевого ХС (0,5 г/кг) и смесью жиров (подсолнечное масло / свиной жир 3 : 1) в течение 20 дней. Умеренно высокую гиперлипидемию у кроликов моделировали, используя пищевой ХС (0,5 г/кг), перемешанный вместе с небольшим количеством капусты, в течение 12–24 дней. Перед окончанием опытов всех подопытных животных отсаживали на голод в течение 18 ч. Крыс и морских свинок забивали быстрой декапитацией, кроликов — мгновенной воздушной эмболией. В полученной крови и печени определяли содержание общего ХС (ОХС), триглицеридов (ТГ), ХС липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) с помощью наборов реактивов Ranbaxy (Великобритания). По общепринятой формуле А.Н. Климова рассчитывали важный коэффициент — индекс атерогенности крови (ИА):
ОХС – ХС ЛПВП / ХС ЛПВП.
Кроме того, сыворотку крови крыс, морских свинок и кроликов исследовали, используя метод ультрацентрифугирования в градиенте плотности калия бромида (KBr) для анализа распределения спектра липопротеинов: ЛП промежуточной плотности (ЛППП), ЛП очень низкой плотности (ЛПОНП), ЛП низкой плотности (ЛПНП), ЛПВП. Статистическую обработку данных производили, сравнивая средние значения величин, с помощью однофакторного ANOVA теста при p < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Изучение биологической активности препарата ХСО для коррекции экспериментального АС в опытах in vitro и in vivo коллектив авторов проводил в течение трех лет в четырех сериях исследований комплексно — в лаборатории экспериментальной фармакотерапии и отделе биохимии Института экспериментальной медицины (Санкт-Петербург).
Первый, начальный этап исследований выявил отчетливую специфическую активность тестируемого препарата — микробного ферментного препарата ХСО. Согласно протоколам опытов были получены следующие результаты.
В первой серии исследований в опытах in vitro было показано, что микробный препарат фермента ХСО в суммарной дозе 300–400 ЕД проявляет специфическую биологическую активность в уменьшении концентрации ХС в натуральных пищевых продуктах. Так, после добавления препарата ХСО с исходной концентрацией 0,16 ЕД/мл активности к 1 л цельного 6 % молока было обнаружено, что после инкубации в термостате при 37 оС в течение 3 ч наблюдалось снижение уровня общего ХС на 48 % (p < 0,05). После аналогичной инкубации пяти яичных желтков (с исходным содержанием ХС 15,64 мг/мл) концентрация ХС в них уменьшилась на 51 % (p < 0,05). Кроме того, при инкубации смешанных образцов в течение 3 ч при комнатной температуре концентрация в яичных желтках была в 1,5 раза ниже, чем в исходном продукте. Важно подчеркнуть, что при этом способе пищевые продукты не потеряли своих вкусовых и естественных качеств.
Во второй серии исследований в опытах in vivo у мышей и крыс определяли острую токсичность ХСО. Хроническую токсичность препарата изучали в длительных экспериментах (крысы — 3 месяца) и (собаки — 5 месяцев). Острую токсичность ХСО у мышей и крыс определить не удалось, так как даже большие дозы ХСО не оказывали патологического действия. Обнаружено, что пероральное введение препарата ХСО в опытах в дозах 300–400 ЕД животные переносили без осложнений. Кроме того, для выяснения влияния на жизненно важные системы и органы были проведены хронические опыты на крысах и собаках. Установлено, что ежедневное применение ХСО пероральной дозы с исходной активностью от 0,16 до 1,0–20,0 ЕД/мг не оказывает токсического действия на организмы крыс и собак при длительном применении (3 и 5 месяцев соответственно). Анализ деятельности желудочно-кишечного тракта, крови по форменным элементам и морфологии органов (сердце, печень, почки, надпочечники, селезенка) не выявил серьезных патологических изменений у опытных животных.
В третьей серии опытов моделирования на кроликах алиментарного АС (3 месяца) без использования ферментного препарата ХС было отмечено появление и развитие выраженных атеросклеротических повреждений в аортах опытных животных при ежедневном скармливании яичных желтков. В то же время в аортах группы кроликов, получавших в тех же условиях в качестве препарата сравнения гиполипидемический препарат клофибрат, наблюдались начальные диффузные поражения стенки аорты.
В четвертой серии опытов при изучении переносимости ХСО в эффективной дозе 20 ЕД у кроликов (3 месяца) и собак (5 месяцев) обнаружено, что ежедневное пероральное введение тестируемого препарата в разных дозах и яичных желтков не вызывало никаких поражений в аортах экспериментальных животных.
Таким образом, в опытах in vitro и in vivo была установлена низкая токсичность, биологическая активность и антиатеросклеротическое действие изучаемого микробного препарата ХСО.
На втором этапе исследований была поставлена задача — выяснить, в какой степени препарат ХСО может влиять на развитие умеренно высокой алиментарной ДЛП у крыс, морских свинок и кроликов. Использование в опытах трех видов экспериментальных животных (грызунов) обусловлено особенностями липидного спектра их крови, который различается следующим образом. У кроликов основное количество ХС распределено по фракциям атерогенных липопротеинов (ЛПОНП, ЛППП и ЛПНП) и антиатерогенных ЛПВП равномерно. У крыс основной пул ХС находится в антиатерогенных ЛПВП, а у морских свинок — в атерогенных фракциях ЛПОНП и ЛПНП. Следует отметить, что морские свинки более чувствительны к созданию моделируемой ДЛП, чем кролики и крысы. Моделирование алиментарной ДЛП (гиперлипидемии) у морских свинок осуществляли пероральным введением с помощью зонда прогретой смеси жиров и избытка пищевого ХС в течение 20 дней. Крысы менее чувствительны к воздействию скармливания атерогенного рациона, поэтому им необходимо длительно вводить ГХС диету не только со смесью жиров и избыточным количеством ХС, но и использовать в высоких дозах такие повреждающие агенты, как МТУ, холевая кислота, витамин D2 в течение 21–30 дней. Разработкой и внедрением алиментарных моделей ДЛП для экспериментальной работы занималась одна из авторов данной статьи — И.В. Окуневич [7].
Таблица 1. Влияние препарата холестериноксидазы на показатели липидного обмена в сыворотке крови и печени морских свинок при пероральном введении в течение 20 дней
Группа животных | ХС сыворотки | ТГ сыворотки | ХС печени | ТГ печени |
1. Интактные морские свинки | 1,19 ± 0,13 | 0,61 ± 0,14 | 2,5 ± 0,07 | 5,8 ± 0,4 |
2. ГХС диета | 6,49 ± 0,72* | 18,0 ± 0,36* | 13,8 ± 0,09* | 26,5 ± 3,2* |
3. ГХС диета + ХСО | 4,14 ± 0,54# | 14,3 ± 0,27# | 10,5 ± 0,08# | 20,0 ± 1,7# |
Примечание: * различия достоверны в сравнении групп 1 и 2 при p < 0,05; # различия достоверны в сравнении групп 2 и 3, при p < 0,05. ХС — холестерин, ХСО — холестериноксидаза, ТГ — триглицериды, ГХС — гиперхолестериновая. |
Таблица 2. Влияние препарата разных доз холестериноксидазы на показатели липидного обмена в сыворотке крови крыс при пероральном введении в течение 30 дней
Группа животных | ХС сыворотки | ТГ сыворотки | ХС ЛПВП | Индекс атерогенности |
1. Интактные крысы | 1,40 ± 0,03 | 0,78 ± 0,02 | 0,93 ± 0,07 | 0,50 |
2. ГХС диета | 4,69 ± 0,13* | 0,42 ± 0,05* | 0,55 ± 0,06* | 7,43 |
3. ГХС диета + ХСО 2 ЕД | 4,01 ± 0,15*, # | 0,56 ± 0,07* | 0,64 ± 0,08*, # | 5,26 |
4. ГХС диета + ХСО 4 ЕД | 3,96 ± 0,17*, # | 0,52 ± 0,04* | 0,73 ± 0,06*, # | 4,43 |
5. ГХС диета + ХСО 8 ЕД | 3,78 ± 0,31*, # | 0,50 ± 0,03* | 0,81 ± 0,09*, # | 3,66 |
6. ГХС диета + ХСО 10 ЕД | 2,92 ± 0,18*, # | 0,51 ± 0,08* | 0,96 ± 0,08*, # | 2,04 |
7. ГХС диета + ХСО 20 ЕД | 2,79 ± 0,27*, # | 0,49 ± 0,06* | 0,97 ± 0,05*, # | 1,74 |
Примечание: * различия достоверны в сравнении групп 1 и 2 при p < 0,05; # различия достоверны в сравнении групп 2 (ГХС диета) и 3, 4, 5, 6, 7, при p < 0,05. ХС — холестерин, ХСО — холестериноксидаза, ТГ — триглицериды, ЛПВП — липопротеины высокой плотности, ГХС — гиперхолестериновая. |
Таблица 3. Влияние препарата холестериноксидазы на показатели липидного обмена в сыворотке крови и печени крыс при пероральном введении в течение 13 дней (диета — 22 дня)
Группа животных | ХС сыворотки | ТГ сыворотки | ХС печени | ТГ печени |
1. Интактные крысы | 1,32 ± 0,08 | 0,73 ± 0,06 | 4,45 ± 0,38 | 7,53 ± 0,91 |
2. ГХС диета | 3,17 ± 0,13* | 0,42 ± 0,05* | 21,15 ± 0,96* | 23,4 ± 1,03* |
3. ГХС диета + ХСО 2 ЕД | 1,71 ± 0,05*, # | 0,32 ± 0,07* | 14,48 ± 1,03*, # | 12,0 ± 1,13*, # |
Примечание: * различия достоверны в сравнении групп 1 и 2 при p < 0,05; # различия достоверны в сравнении групп 2 и 3 при p < 0,05. ХС — холестерин, ХСО — холестериноксидаза, ТГ — триглицериды, ГХС — гиперхолестериновая. |
Таблица 4. Влияние препарата холестериноксидазы, вводимой перорально в течение 12 и 24 дней, на изменение уровня липидов сыворотки крови у кроликов с дислипопротеинемией
Группа животных | n | ХС сыворотки крови (ммоль/л) | ТГ сыворотки (ммоль/л) | Индекс атерогенности, ЕД | ||||
Начало опыта | Через 12 дней | Через 24 дня | Начало опыта | Через 12 дней | Через 24 дня | 24 дня | ||
1. Интактные морские свинки | 5 | 1,1 ± 0,21 | 2,0 ± 0,44 | 1,4 ± 0,10 | 0,94 ± 0,10 | 0,90 ± 0,28 | 1,04 ± 0,08 | 1,0 |
2. ГХС диета | 5 | 1,2 ± 0,16 | 29,7 ± 3,80* | 45,0 ± 2,82* | 0,62 ± 0,11* | 1,67 ± 0,32* | 2,45 ± 0,24* | 149,0 |
3. ГХС диета + + ХСО | 8 | 1,2 ± 0,05 | 24,5 ± 2,70*, # | 11,7 ± 2,64*, # | 0,91 ± 0,15*, # | 0,42 ± 0,11*, # | 0,97 ± 0,21*, # | 12,0 |
Примечание: n — число животных в группе, * различия достоверны в сравнении групп 1 и 2, *, # различия достоверны в сравнении с группами 2 и 3, при p < 0,05. ХС — холестерин, ХСО — холестериноксидаза, ТГ — триглицериды. |
Полученные во втором этапе результаты опытов по изучению влияния ХСО на развитие умеренной алиментарной ДЛП представлены в табл. 1–4. Введение препарата ХСО морским свинкам способствовало снижению уровня липидов в сыворотке крови и в печени данных животных (см. табл. 1). Так, уровень ХС в крови снизился на 49 %, в печени — на 26 %, содержание в сыворотке крови уменьшилось на 21 %, в печени — на 25 %, что свидетельствовало о выраженном гиполипидемическом действии изучаемого препарата. При тестировании влияния разных доз ХСО на модели алиментарной ДЛП у крыс (см. табл. 2) обнаружено, что при увеличении дозирования препарата наблюдалось достоверное снижение общего ХС сыворотки крови (группы 3–7 в сравнении с группой 2). Отмечено также позитивное увеличение концентрации ХС антиатерогенных ЛП — ХС ЛПВП (сниженной в результате моделирования ДЛП). При этом при анализе степени атерогенности сыворотки крови обнаружено снижение величины расчетного коэффициента: ИА составляет от 5,26 до 1,74 (группа 2 и опытные группы 3–7). В следующем эксперименте на модели ДЛП у крыс на ГХС диете было показано гиполипидемическое действие ХСО у крыс, получавших тестируемый препарат ХСО: ХС в сыворотке крови снижался на 47 %, в печени — на 34 %. Из-за использования в атерогенном рационе тиреоид-супрессорного агента МТУ уровень ТГ сыворотки крови не увеличивался. Липидснижающий эффект ХСО — снижение ТГ под влиянием препарата — наблюдался только в печени (см. табл. 3, группы 3 и 2). В табл. 4 приведены результаты, полученные после перорального введения ХСО кроликам. Из данных видно, что через 12 дней и, в большей степени, через 24 дня кормления животных гиперхолестериновой диетой значительно увеличилось содержание ХС в сыворотке крови и величина ИА (более чем в 12 раз) по сравнению с нормальными животными (группы 3 и 2). Результаты опытов, проведенных на трех видах экспериментальных животных (грызунов), свидетельствуют об имеющемся у препарата ХСО гиполипидемическом действии в условиях моделирования алиментарной ДЛП.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, в двухэтапном экспериментальном исследовании установлены биологическая активность, гиполипидемическое и антиатеросклеротическое действия ферментного препарата микробного происхождения холестериноксидазы. Полученные данные расширяют наше представление о фармакологическом действии фермента холестериноксидазы, что может иметь перспективу его внедрения в практику.
Об авторах
Ирина Викторовна Окуневич
ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»
Автор, ответственный за переписку.
Email: irina_okunevich@mail.ru
канд. биол. наук, старший научный сотрудник отдела нейрофармакологии им. С.В. Аничкова
Россия, Санкт-ПетербургНаталия Николаевна Клюева
ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»
Email: nnklyueva@gmail.com
канд. биол. наук, научный сотрудник отдела биохимии
Россия, Санкт-ПетербургНина Соломоновна Парфёнова
ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»
Email: nina.parf@mail.ru
канд. мед. наук, старший научный сотрудник отдела биохимии
Россия, Санкт-ПетербургЕлена Владимировна Белова
ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»
Email: irina_okunevich@mail.ru
канд. биол. наук, научный сотрудник отдела биохимии
Россия, Санкт-ПетербургСписок литературы
- Безбородов А.М., Загустина Н.А. Ферментативные реакции в химикоэнзиматическом синтезе лекарственных препаратов // Прикладная биохимия и микробиология. – 2016. – Т. 52. – № 3. – С. 257–271. [Bezborodov AM, Zagustina NA. Fermentativnye reaktsii v khimikoenzimaticheskom sinteze lekarstvennykh preparatov. Prikladnaja biohimija i mikrobiologija. 2016;52(3):257-271. (In Russ.)]. https://doi.org/10. 7868/S055510991603003X.
- Bogdanov M. Mapping of membrane protein topology by substituted cystein accessibility method (SCAM™). Methods Mol Biol. 2017;1615:105-128. https://doi.org/10. 1007/978-1-4939-7033-9_9.
- Catapano AL, Lautsch D, Tokgözoglu L, et al. Prevalence of potential familial hypercholesteremia (FH) in 54,811 statin-treated patients in clinical practice. Atherosclerosis. 2016;252:1-8. https://doi.org/10. 1016/j.atherosclerosis.2016. 07. 007.
- Gadbery JE, Sampson NS. Use of an Isotope-Coded Mass Tag (ICMT) method to determine the orientation of cholesterol oxidase on model membrances. Biochemistry. 2018;57(36):5370-5378. https://doi.org/10. 1021/acs.biochem. 8b00788.
- Khatib R, Mckee M, Shannon H, et al. Availalibity and affordability of cardiovascular disease medicines and their effect on use in high-income, middle-income and low-income countries: an analysis of PURE study data. Lancet. 2016;387(10013):61-9. https://doi.org/10. 1016/s0140-6736(15)00469-9.
- Kreit I, Sampson NS. Cholesterol oxidase: biochemistry and structure features: Review. FEBS J. 2009;276(23):6844-56. https://doi.org/10. 1111/j.1742-4658. 2009. 07378. x
- Okunevich IV, Knychenko LK, Sapronov NS. Pharmacological activity of sulfobisanion in models of experimental dyslipoproteinemia Pharm Chem J. 2013;47(7):374-377. https://doi.org/10. 1007/s11094-013-0962-x.
- Vrilink A, Ghisla S. Cholesterol oxidase: biochemistry and features. FEBS J. 2009;276(23):6826-6843. https://doi.org/10. 1111/j. 1742-4658. 2009. 07377. x.
![](/img/style/loading.gif)