Сравнительное исследование влияния экстрактов тимьяна Маршалла на когнитивные функции мышей в радиальном лабиринте

Полный текст

АКТУАЛЬНОСТЬ

Когнитивные нарушения — актуальная проблема современной медицины, связанная с ростом психических и неврологических расстройств, проводящая к трудностям в бытовой, социальной, профессиональной деятельности и снижению качества жизни [1].

В коррекции нарушений когнитивных функций основными лекарственными препаратами являются ноотропы, которые представлены разными фармакологическими группами с различным механизмом действия. Однако они обладают рядом отрицательных свойств: недостаточная эффективность, токсическое воздействие, побочные реакции [2–3], что делает актуальным поиск профилактических и лечебно-восстановительных средств, эффективных при патологиях данного типа. В том числе, интерес представляет поиск и изучение средств растительного происхождения, обладающих наряду с широким спектром активности безопасностью и малой токсичностью.

Так, например, ранее было изучено влияние на когнитивные функции экстрактов центеллы азиатской [4], сельдерея пахучего [5], жимолости голубой [6], растений рода Шалфей [7], комбинированного экстракта из шалфея, розмарина и мелиссы [8]. Для экстрактов тимьяна Маршалла выявлены разнообразные биологические свойства, такие как отхаркивающие, ангиопротекторные, противовоспалительные, антиоксидантные [9], антимикробные [9, 10]. В отношении поведенческих реакций активность экстрактов изучена недостаточно, был установлен только анксиолитический эффект [11], влияние на когнитивные функции исследовано не было.

Целью исследования стало изучение рабочей и долговременной пространственной памяти мышей в тесте «восьмирукавный радиальный лабиринт» под влиянием многократного введения экстрактов тимьяна Маршалла.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектами исследования стали 24 нелинейные мыши-самца (возрастом 8–15 нед. и массой 35–40 г). Животные содержались в условиях вивария в индивидуальных клетках, по 6 животных в каждой, с постоянной влажностью и температурой воздуха 24 ± 2 °C, при 12 ч день / 12 ч ночь световом цикле, со свободным доступом к воде и сниженным пищевым рационом.

Все эксперименты были выполнены в соответствии с правилами, указанными в Директиве Европейского сообщества (2010/63/ЕС), Хельсинкской декларацией о гуманном отношении к животным (редакция 2000 г.), Женевской конвенцией «Internetional Guiding Principals for Biomedical Involving Animals» (Geneva, 1990) и с одобрения комитета по этике СГМУ им. Разумовского (протокол № 4 от 1 декабря 2020 г.).

Лабораторные животные были разделены на 4 группы — группу контроля и 3 опытные. Исследуемые группы на протяжение 7 сут эксперимента ежедневно внутрижелудочно получали следующие вещества: 1-я группа — раствор кофеина в дозе 40 мг/кг («Белорусский завод медицинских препаратов», Беларусь), 2-я группа — спиртовой экстракт тимьяна Маршалла в дозе 100 мг/кг, 3-я группа — водный экстракт тимьяна Маршалла в дозе 100 мг/кг. Группе контроля вводили питьевую воду по массе.

Для исследования использовали измельченную траву тимьяна Маршалла, собранную около Саратова в июне–июле 2020 г. в фазе цветения. Определение вида проводили по ключу В.Н. Гладковой и Ю.Л. Меницкого из справочника «Флора европейской части СССР» [12]. Сырье сушили в сухом, хорошо проветриваемом помещении, затем измельчали до частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 2 мм.

Экстракты из указанного растительного материала были приготовлены двумя способами: 1) по требованиям ГФ XIV ОФС.1.4.1.0018.15 «Настои и отвары» (экстрагент — вода) [13]; 2) согласно методике двукратную экстракцию проводили 95 % этиловым спиртом, упаривали и очищали хлороформом, затем полученную водную фракцию снова упаривали до получения густого экстракта [14].

Для оценки когнитивных функций (память, обучение) животных проводили тест «радиальный лабиринт» (radial maze) (Open Science, Россия) [15]. Использовался восьмирукавный радиальный лабиринт с равными по длине рукавами, расходившимися из круглого центра. В конце каждого рукава размещалось пищевое подкрепление (морковь), которое было невидимо из центра лабиринта. На 2–6-е сутки осуществляли видеорегистрацию поведения (1-е сутки не фиксировали).

Тестирование экспериментальных животных проводили со вторых суток введения исследуемых веществ на протяжении 5 дней с перерывом в течение 24 ч после четвертого дня тестирования для оценки долговременной пространственной памяти (табл. 1) [16]. В первый день тестирования проводили тренировку животных для ознакомления с условиями теста.

 

Таблица 1. Модель эксперимента

Дни введения веществ	1-е сутки	2-е сутки	3-е сутки	4-е сутки	5-е сутки	6-е сутки	7-е сутки
Дни тестирования	–	1-й (тренировка)	2-й	3-й	4-й	5-й	6-й
		+	+	+	+	–	+

Примечание. В описании результатов эксперимента указаны сутки тестирования.

 

Сам тест проходил в два этапа длительностью по 3 мин каждый, с 30-секундным перерывом между ними. В ходе первого этапа были открыты четыре рукава напротив друг друга, тогда как четыре других закрыты. На втором этапе теста ранее открытые рукава закрывали на конце, изолируя пищевое подкрепление, но при этом открывали прежде закрытые.

После проведения тестирования подсчитывали баллы памяти (memory score) по формуле: MS = (верный вход – неверный вход) / (верный вход + неверный вход). При этом верным входом считали однократное посещение рукава, тогда как неверным — повторное.

Из эксперимента мышей выводили передозировкой препаратов для наркоза [внутрибрюшинная комбинация Золетила (Virbac, Франция) и Ксиланита (Нита-Фарм, Россия) в дозе 0,1 мг/кг].

Обработку полученных данных проводили при помощи программы Statistica 12 (StatSoft^®, США) c проверкой на нормальность распределения по методу Колмогорова – Смирнова. Для каждой выборки вычисляли среднее арифметическое и стандартную ошибку среднего. При сравнении показателей применяли t-критерий Стьюдента. Значимыми считались результаты при р < 0,05 (p₁ — по сравнению с контролем, р₂ — со второй опытной группой, р₃ — с третьей опытной группой).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

По результатам проведенного исследования установлено, что животные 1-й опытной группы (кофеин 40 мг/кг) показали более высокий балл памяти по сравнению с другими исследуемыми группами (см. рисунок). У 2-й опытной группы изменений баллов памяти в зависимости от введения спиртового экстракта тимьяна Маршалла (100 мг/кг) не отмечалось. У 3-й опытной группы, получавшей водный экстракт тимьяна Маршалла (100 мг/кг), к 4-м суткам отмечалось увеличение баллов памяти.

 

Рисунок. Динамика изменений баллов памяти на 2–6-е сутки эксперимента у исследуемых групп. Значимость (p < 0,05) обозначена символами

 

На 2-е сутки тестирования, после предварительной тренировки, животные группы контроля показали средний балл памяти (0,63 ± 0,17), который снизился к 3-м и 4-м суткам эксперимента (0,41 ± 0,19 и –0,02 ± 0,26 соответственно). При перерыве на 5-й день тестирования от 4-х суток к 6-м наблюдалось увеличение балла памяти (0,26 ± 0,16). Группа, получавшая кофеин в дозе 40 мг/кг, на 2-е и 3-и сутки эксперимента демонстрировала снижение баллов памяти по сравнению с контролем (–0,41 ± 0,19, p₁ = 0,002 и 0,02 ± 0,12, p₁ = 0,12 соответственно). Однако к 4-м и 6-м суткам наблюдалось увеличение баллов памяти (0,13 ± 0,11, p₁ = 0,60 и 2,79 ± 1,84, p₁ = 0,19 соответственно).

На протяжении всех дней наблюдения у данной группы отмечался рост баллов памяти (от –0,41 ± 0,19 до 2,79 ± 1,84). Указанные изменения показателей на фоне введения кофеина (в дозе 40 мг/кг) связаны со снижением количества ошибок при повторных заходах в рукава и обусловлены активацией когнитивных функций — кратковременной и долговременной памяти [17, 18].

Группа, получавшая спиртовой экстракт тимьяна Маршалла в дозе 100 мг/кг, на протяжении всех дней тестирования показала следующие баллы: на 2-е сутки — –0,02 ± 0,09, на 3-и отмечалось увеличение до 0,18 ± 0,09, на 4-е и 6-е снижение до 0,08 ± 0,05 и –0,25 ± 0,16.

При сравнении 2-й опытной группы с контролем на 2-е и 3-и сутки наблюдалось снижение баллов памяти (p₁ = 0,006; p₁ = 0,31 соответственно), на 4-е сутки увеличение (p₁ = 0,71), к 6-м — снижение (p₁ = 0,05). По отношению к группе с введение кофеина в дозе 40 мг/кг на 2-е и 3-и сутки было установлено увеличение баллов памяти (p₂ = 0,09; p₂ = 0,32), на 4-е и 6-е — снижение (p₂ = 0,69; p₂ = 0,13).

Следует отметить отсутствие закономерностей в поведении мышей при введении спиртового экстракта, что говорит о минимальном специфическом влиянии на формирование рабочей и долговременной пространственной памяти мышей.

При введении водного экстракта тимьяна Маршалла в дозе 100 мг/кг животным 3-й опытной группы наблюдались следующие изменения в баллах памяти: на 2-е сутки — 0,09 ± 0,11, на 3-и сутки снижение до –0,01 ± 0,12, на 4-е — увеличение (0,22 ± 0,19), на 6-е — снижение (0,002 ± 0,09). При сравнении с контролем на 2-е и 3-и сутки отмечалось снижение (p₁ = 0,02; p₁ = 0,08), на 4-е — увеличение (p₁ = 0,48), на 6-е — снижение (p₁ = 0,18).

По отношению к 1-й опытной группе на 2-е сутки эксперимента было установлено увеличение баллов памяти (p₂ = 0,05), на 3-и — снижение (p₂ = 0,85), на 4-е — увеличение (p₂ = 0,72), на 6-е — снижение (p₂ = 0,16). При сравнении 2-й и 3-й опытных групп на 2-е сутки исследования отмечалось увеличение баллов памяти (p₃ = 0,47), на 3-и — снижение (p₃ = 0,23), на 4-е и 6-е увеличение (p₃ = 0,51; p₃ = 0,18).

Изменение указанных показателей говорит о том, что водный экстракт тимьяна Маршалла приводит к позитивной динамике в процессе обучения мышей и влияет на активацию рабочей памяти, но не оказывает воздействия на формирование долгосрочной памяти животных при продолжительности введения в течении 7 сут. Результаты эксперимента обусловливают необходимость более продолжительного исследования эффектов вводимых веществ для оценки их активности при хроническом введении.

При анализе баллов памяти у животных опытных групп была установлена разная степень выраженности двигательной активности (общее количество заходов в рукава лабиринта) (табл. 2).

 

Таблица 2. Изменение двигательной активности у животных опытных групп

Группы животных	Общее количество заходов
	2-е сутки	3-е сутки	4-е сутки	6-е сутки
Контроль	4 ± 0,95	4 ± 0,76	5 ± 1,43	5 ± 1,26
Кофеин 40 мг/кг (1-я)	8 ± 2,8	12 ± 1,34*	14 ± 1,67*	14 ± 1,23*
Спиртовой экстракт тимьяна Маршалла 100 мг/кг (2-я)	9 ± 1,98*	10 ± 1,91*	13 ± 2,25*	13 ± 3,22*
Водный экстракт тимьяна Маршалла 100 мг/кг (3-я)	6 ± 0,84	9 ± 1,28*	11 ± 0,48*	11,25 ± 2,06*

*Значимость по сравнению с контролем (p < 0,05).

Примечание. В каждом случае приведено среднее арифметическое и стандартная ошибка среднего. В описании результатов эксперимента указаны сутки тестирования.

 

Так, в 1-й опытной группе (кофеин 40 мг/кг) со 2-х по 6-е сутки эксперимента количество заходов увеличилось на 75 %. По сравнению с контролем данный показатель достоверно увеличился в 2,8 раз. Отмеченные изменения значений согласуются с ранее проведенными исследованиями, в которых данная доза вещества также приводила к повышению активности животных (увеличивалась продолжительность активного плавания мышей) [17, 19].

У 2-й опытной группы (спиртовой экстракт тимьяна Маршалла 100 мг/кг) наблюдалось увеличение двигательной активности на протяжении всех дней исследования (на 44 %), по отношению к контролю к 6-м суткам эксперимента общее количество заходов достоверно увеличилось в 2,6 раз. У 3-й опытной группы (водный экстракт тимьяна Маршалла 100 мг/кг) так же отмечалось увеличение двигательной активности на 87,5 %, по сравнению с контролем показатель на 6-е сутки тестирования достоверно повысился в 2,25 раз.

Повышение двигательной активности при введении экстрактов тимьяна Маршалла также было продемонстрировано в тесте «крестообразный лабиринт» — происходило увеличение пройденного расстояния и времени пребывания в открытых рукавах [11].

ВЫВОДЫ

1. Введение кофеина в дозе 40 мг/кг увеличивало баллы памяти и вызывало активацию когнитивных функций (кратковременной и долговременной памяти).
2. Применение водного экстракта тимьяна Маршалла (100 мг/кг) воздействовало на рабочую память и не вызывало формирования долговременной пространственной памяти.
3. Спиртовой экстракт тимьяна Маршалла (100 мг/кг) показал минимальное влияние на формирование рабочей и долговременной пространственной памяти мышей.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Об авторах

Анна Сергеевна Шереметьева

Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского

Автор, ответственный за переписку.
Email: anna-sheremetyewa@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-0022-8318
SPIN-код: 3755-4410

старший преподаватель 

Россия, 410012, Саратов, ул. Большая Казачья, д. 112

Алена Юрьевна Каретникова

Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского

Email: alyona.karetnikova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8043-3142
SPIN-код: 1374-9994

студент

Россия, 410012, Саратов, ул. Большая Казачья, д. 112

Наталья Анатольевна Дурнова

Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского

Email: ndurnova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4628-9519
SPIN-код: 3348-2957

декан

Россия, 410012, Саратов, ул. Большая Казачья, д. 112

Анжелика Сергеевна Дердюк

Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского

Email: aderdyuk00@gmail.com

студент

Россия, 410012, Саратов, ул. Большая Казачья, д. 112

Виктория Ильинична Скиба

Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского

Email: skiba.victorya@yandex.ru

студент

Россия, 410012, Саратов, ул. Большая Казачья, д. 112

Список литературы