Расчетные и экспериментальные доказательства проницаемости гематоэнцефалического барьера методами in silico, in vitro и in vivo

Полный текст

Введение

Проникновение фармакологических агентов через гематоэнцефалический барьер – важнейший фармакокинетический процесс, оказывающий решающее влияние на эффективность, способ применения и безопасность действия вещества. Существуют различные методы оценки проникновения веществ через гематоэнцефалический барьер. Методы анализа in silico обладают большим количеством преимуществ: быстрота получения результатов, не требует значительных вложений и затрат времени, снижение вреда для человека и животных при тестировании, возможность предварительного скрининга. К популярным методам анализа in silico относятся веб-платформа Way2Drug и ПО VEGA ZZ. Way2Drug- это быстро развивающийся веб-портал, ориентированный на интеграцию востребованных вычислительных инструментов для поиска, анализа и разработки фармакологических веществ с использованием методов машинного обучения и искусственного интеллекта [1]. В настоящее время Way2Drug предоставляет возможность оценки многих видов биологической активности, токсичности, метаболизма и физико-химических характеристик для анализа химических соединений. [2]. VEGA ZZ- Это программное обеспечение, которое содержит все необходимые инструменты для создания сложных молекулярных структур в режиме реального времени. Одной из ключевых особенностей VEGA ZZ является использование алгоритмов машинного обучения с помощью количественных методов для моделирования взаимодействия молекул с биологическими системами [3]. Обе программы работаю по методу структура-активность (QSAR) для прогнозирования физическо-химических свойств [4]. В основе метода QSAR лежит понимание того, что биологическая активность соединения тесно связана с его молекулярной структурой. Благодаря использованию числовых дескрипторов данные математические модели включают различные измерения химической информации для прогнозирования [5]. Для лечения нейродегенеративных заболеваний Парком и др. использовали модели 3D-QSAR, чтобы получить информацию о разработке новых ингибиторов агрегации тау с улучшенной активностью и сниженной цитотоксичностью [6]. Низкая проницаемость ГЭБ является ключевой проблемой для лечения большинства нейродегенеративных заболеваний. К свойствам соединений, влияющим на прохождение через ГЭБ, можно отнести: липофильность (параметр LogP), растворимость в воде (LogS), полярная площадь поверхности и тoпологический индекс полярной площади поверхности (PSA и TPSA), Межмолекулярные взаимодействия: Силы Ван-дер-Ваальса, доступность областей молекулы для взаимодействий (DEEP), уровень взаимодействие молекулы с полярными и заряженными компонентами ГЭБ (MEP), молекулярный липофильный потенциал (MLP), способность образовывать водородные связи, донорно-акцепторные свойства (HBACC и HBDON) и др. Некоторые химические вещества (боскалид, этоксазол) имеют различия до четырех порядков величины при сравнении параметров in silico и in vitro [7]. Прогнозирование физико-химических свойств потенциальных препаратов для понимания отношения к ГЭБ при лечении заболеваний ЦНС- одна из современных задач, которая стоит перед фармакологией.

Целью работы было определить и сравнить значения параметров, которые могут выступать предикторами для преодоления ГЭБ in silico, in vitro и проверить полученные данные в экспериментах in vivo.

Материалы и методы

Определение in silico

Свойства для прогнозирования преодоления ГЭБ (DEEP, MEP, MLP, PSA, LogS, LogP и LogBB) рассчитываются для каждой точки с помощью соответствующего алгоритма. Алгоритм DEEP: для каждой точки вычисляется расстояние от геометрического центра молекулы. Это свойство полезно для окрашивания поверхности по градиенту, чтобы выделить глубокие карманы и полости молекулы. Поверхность молекулярного электростатического потенциала (MEP) рассчитывается путем проецирования атомных зарядов на поверхность молекулы. Молекулярный потенциал липофильности (MLP) рассчитывается путем проецирования атомных констант липофильности Брото-Моро на молекулярную поверхность [8]. Площадь полярной поверхности (PSA) рассчитывается с учетом полярных и неполярных атомных поверхностей. Эти свойства проецируются на поверхности с помощью двух цветовых кодов: Синий (неполярная поверхность) и красный (полярная поверхность) [9]. Для расчетов логарифмов P и S, применяется ALogPS 2.1, которая использует комбинацию атомных и фрагментных вкладов с коррекциями на основе молекулярной структуры, разбивает молекулу на составляющие части (атомы, функциональные группы, связи) и присваивает каждой части определенный вклад в LogS и LogP, вклады суммируются, а затем применяются специфические поправки (в зависимости от молекулы). Расчет LogBB осуществлялся по отношению концентрации соединения в мозге к коннцентрации соединения в плазме [10].

Определение in vitro

Для расчета коэффициентов распределения использовали значения оптической плотности растворов, полученные методом ультрафиолетовой спектроскопии. Измерения проводили на ультрафиолетовом спектрофотометре Beckman Coulter DU 800 UV/Visible и хроматографической системе высокого давления BioLogic DuoFlow. Расчет практического LogP осуществляли по формуле: P= lg (Dисх.-Dконечн /(Dконечн.), где Dконечн. – значение оптической плотности водного раствора после встряхивания с октанолом. Dисх.- оптическая плотность исходного водного раствора до встряхивания с октанолом.

Фармакологический анализ действия веществ у экспериментальных животных.

В работе использовано 120 беспородных белых мышей-самцов: 125 мышей на исследование с галоперидолом, 140- на 6-ГДА, 45- кисспетин-10, 60- окситоцин. В исследовании 6-ГДА использовали 30 мышей. Мыши были разделены на 3 равные группы: группа 1- контроль, группа, не подвергавшаяся воздействию; группа 2- группа мышей, которым внутрибрюшинно вводили 6-ГДА (100 мг или 4 мкг/мкл), 3 группа мышей, которым внутрибрюшинно вводили физиологический раствор 300 мкл. Через 21 день после введения нейротоксина в дозе 100 мкг оценивали поведение животных в тесте «открытое поле», Ротарод, Pole test. В исследовании окситоцина использованы 40 беспородных мышей, разделенных на 4 групп. Первая группа мышей была интактной и не подвергалась введению окситоцина или физиологического раствора. Вторая и третья группы получали однократное внутрибрюшинное введение 20 и 300 мкл окситоцина 5 МЕ соответственно. четвертая группа — 300 мкл физиологического раствора внутрибрюшинно. Поведенческие эффекты регистрировали в приподнятом крестообразном лабиринте в течение 5 мин и тесте темная и светлая камера. В исследовании Галоперидола использовали 25 беспородных мышей, разделенных на следующие группы: Первая группа мышей была интактной и не подвергалась введению галоперидола или физиологического раствора. Вторая, третья и четвертая группы мышей получали однократное введение 0,1, 0,5 и 1 мг/кг галоперидола внутрибрюшинно 300 мкл. Пятая группа мышей получала 300 мкл физиологического раствора внутрибрюшинно. Через 30, 60 и 120 минут после введения оценивали поведение животных в тесте «Открытое поле», «Поза лектора» и «Pole test». В исследовании кисспептина-10 использовали 25 беспородных мышей, разделенных на группы: первая группа не подвергалась никакому введению. Вторая, третья и четвертая группы мышей подвергались однократному введению 1, 10 и 100 мг/кг кисспептина-10 внутрибрюшинно соответственно. Пятая группа мышей получала 300 мкл физиологического раствора внутрибрюшинно. Затем проводили тесты половая мотивация, открытое поле и приподнятый крестообразный лабиринт.

Методы исследования поведения.

Исследование поведения мышей в тесте «открытое поле». Данным тестом исследовали свободную двигательную активность животных. Продолжительность одного опыта составляла 5 мин. Для определения ориентировочной реакции мышь помещали в открытое поле, пол которого разделен на секторы. Подсчитывали число вставаний на задние лапы (вертикальная составляющая ориентировочной реакции), число пересеченных квадратов (горизонтальная компонента), количество обнюхиваний (исследовательская компонента), груминг, фризинг и болюсные выделения, а также число заглядываний в отверстия в полу (норковое поведение, отражающее исследовательскую активность) за 5 мин наблюдения.

Исследование поведения мышей в тесте «Pole test»

Мышь помещали на вершину деревянного стержня (50 см высотой и 1 см в диаметре, обернутого бинтом, и замеряли время, необходимое животному для ориентирования — поворота головой вниз (t-поворота) и спуска вниз по стержню (t-спуска). Стержень крепился к основе, которая устанавливается в «домашнем» боксе животного. Наблюдения продолжали в течении 2 минут.

Исследование поведения мышей в тесте «Темная и светлая камеры»

Тест светлая и темная камеры использует естественное стремление грызунов избегать ярко освещенных мест. Животных помещали в ярко освещенный отсек двухкамерной светлой/темной установки и регистрировали число переходов между светлым и темным отсеками за 5 минут, длительность пребывания в светлом и темном отсеках. Анксиолитический эффект проявляется в увеличении числа переходов из одного отсека в другой и время нахождения в светлом отсеке.

Исследование поведения мышей в тесте «Поза лектора»

Для оценки каталептогенного действия вещества используют несколько разновидностей методов, позволяющих оценить способность животного сохранять искусственно приданную позу. Мышь располагают у горизонтального стержня, закрепленного на высоте 4 см диаметром 0,5 см так, чтобы она опиралась на обе передние лапки (поза лектора). Попытки придать животному нужную позу не продолжали более 1 мин. Фиксировали время пребывания животного в неподвижном состоянии в течении 2 мин. Оценивали общую продолжительность каталепсии.

Исследование поведения мышей в тесте «Ротарод»

Тест «Ротарод» предназначен для оценки моторной функции животного, проводится в установке «Ротарод» (Panlab, Harvard Apparatus, США). За неделю и за 30 мин до теста каждое животное обучалось удержанию на вращающемся стержне — с 4 до 40 об/мин в течение 1 мин. После обучения проводился тест, где измерялась длительность удержания при возрастающей скорости (от 4 до 40 об/мин). Максимальное фиксируемое время — 120 с. Латентный период выпадения является мерой работы мышц и моторных навыков мышей.

Исследования поведения крыс в приподнятом крестообразном лабиринте

Беспородных мышей помещали в центр экспериментальной камеры — крестообразного лабиринта, который состоит из 4 рукавов длиной 30 см и шириной 6 см, соединенных под прямым углом. Два рукава имеют с 2 сторон стенки высотой 30 см, а 2 других открыты и освещены рассеянным искусственным светом. Лабиринт расположен на подставке высотой 40 см над уровнем пола. В течение 5 мин систематически проводили визуальную регистрацию следующих параметров: время нахождения в освещенных рукавах; количество выходов из темных рукавов в освещенные; время, которое мыши проводили на центральной площадке; количество свешиваний с открытых рукавов.

Исследование на половую мотивацию

Для оценки аппетентного полового поведения использовалась камера близости вознаграждения на открытом поле из оргстекла [9]. Открытое поле (85×35×50 см) оборудовалось камерой с прозрачной перфорированной стенкой (15 × 35 × 50 см), установленной на одном конце. Передняя перфорированная стенка позволяет испытуемым подходить и исследовать (обнюхивать) животное (самку в стадии эструса) в камере, но предотвращает тактильный контакт или копуляцию. В день перед тестированием аппетентного поведения все испытуемые были адаптированы в установке в течение 30 мин. Поведение самцов регистрировали на видео в темной комнате с красным светом в течение 10 мин. Открытое поле и клетку со стимулом протирали 3 % перекисью водорода в промежутках между опытами, чтобы устранить обонятельные раздражители. Для измерения половой мотивации для каждого животного фиксировали число попыток достичь самки, время, проведенное вблизи перегородки и латентное время до начала реакции на самку.

Методы статистической обработки данных

Оценку статистической достоверности различий проводили при помощи пакета программ GraphPad Prism 8.4.3 с использованием однофакторного дисперсионного анализа. Для сравнения интактной и экспериментальной групп применяли однофакторный дисперсионный анализ ANOVA. Из непараметрических критериев использовали критерий Краскела-Уоллиса для сравнения групп. Различия считали статистически значимыми при p≤0,05. Для представления полученных данных применяли такие показатели описательной статистика, как среднеарифметическое значение и ошибка среднего.

 

Результаты

1. Результаты после анализа in silico и in vitro

Мы проанализировали способность исследуемых веществ с различной химической структурой (6-ГДА, галоперидол, окситоцин, кисспептин-10) проникать через ГЭБ. Большинство времени молекула проводит в конформации, близкой к той, у которой общая энергия минимальна. 1.VDW (объем Ван дер Ваальса)- является показателем размера молекулы. Наибольший объем наблюдается у окситоцина (1088,5 ЕІ) и кисспептина (1405,4 ЕІ), средний у галоперидола (640 EI) и наименьший у 6-гидроксидофамина. У галоперидола наиболее оптимальное значение Объем Ван дер Ваальса для прохождения через ГЭБ (Табл. 1-2).

Таблица 1. Результаты анализа in silico на физико-химические свойства исследуемых веществ.

Table 1. Results of in silico analysis of the physicochemical properties of the studied substances.

Вещество	VDW, EI		DEEP, Å	MEP, кДж/моль	MLP	HBACC, Number of H-bond acceptors	HBDON, Number of H-bond donors	PSA, Polar surface area (Å2)
6-Гидроксидофамина гидрохлорид	318.3		5.0383 ±0.6632	0.0264 ±0.3931	-0.0022 ±0.2236	-1.8674 ±0.5971	-0.0134 ±0.0116	-1.0107 ±0.3237
Кисспептин-10	1405.4		10.0646 ±3.2874	-0.1208 ±0.0980	-0.1477 ±0.5024	-1.6896 ±1.0534	-0.1734 ±0.1694	7.1711 ±1.3258
Окситоцин	1088.5	8.7035 ±2.2878		0.0385 ±0.2286	-0.3052 ±0.4836	-1.7882 ±0.9240	-0.1572 ±0.2693	-0.1572 ±0.2693
Галоперидол	640.4	7.0310 ±2.3630		0.0359 ±0.1181	0.2181 ±0.3249	-0.7460 ±0.6166	-0.0095 ±0.0196	-6.1498 ±0.8931

 

Таблица 2. Результаты анализа, полученные in silico (LogP теор, LogS, LogBB) и in vitro (спектрофотометрия, logP).

Table 2. Results of analysis obtained in silico (LogP theor, LogS, LogBB) and in vitro (spectrophotometry, logP).

	LogP теор	LogP практ	LogS	LogBB
6-Гидроксидофамина гидрохлорид	-0,91	-1,01	-1,44	-0,790
Кисспептин-10	0,27	-0,79	-5,15	-1,125
Окситоцин	-0,69	-0,816	-4,26	-0,904
Галоперидол	3,70	-0,2	-4,93	0,488

 

2. DEEP- характеризует доступность определенных областей молекулы для взаимодействий. Наибольшее значение наблюдается у кисспептина (10.0646), далее у окситоцина (8.7035) и галоперидола (7.0310). Самое маленькое значение у 6-ГДА, которое наиболее оптимально для преодоления ГЭБ (5.0383). 3. MEP (максимальная энергия по поляризации): Молекулы с положительными значениями MEP: 6-ГДА- 0.0264 ±0.3931, окситоцин- 0.0385 ±0.2286, галоперидол- 0.0359 ±0.1181. Молекулы с отрицательными значениями MEP: Кисспептин- -0.1208 ±0.0980. 4. MLP (минимальная энергия по поляризации): Высокие значения MLP указывают на относительную стабильность молекулы. Низкое значение у 6-гидроксидофамина, кисспептина, окситоцина может указывать на потенциальные трудности с прохождением через ГЭБ или непредсказуемое поведение молекул. Высокое значение наблюдается только у галоперидола. 5. HBACC (степень основности/кислотности): 6-гидроксидофамин, кисспептин и окситоцин с более низким (отрицательным) значением HBACC (-1.9), что указывает на меньшее количество акцепторов водородных связей, что может способствовать его более легкой проницаемости через ГЭБ по данному параметру. Галоперидол является более полярным и имеет некоторое количество акцепторов водородных связей, что может снижать его проницаемость. 6. HBDON (донор водорода): Значение HBDON отрицательное у всех исследуемых веществ, что говорит о том, что молекула содержит относительно меньшее количество доноров водородных связей. Наиболее гидрофильное значение у 6-гидроксидофамина и галоперидола, что делает их худшими для прохождения через гэб среди 4х веществ по данному показателю. 7. PSA (поверхностная площадь полярной области): Наиболее низкой полярностью обладает галоперидол (-6.1498 ±0.8931), затем 6-гидроксидофамин (-1.0107 ±0.3237) и окситоцин (-0.1572 ±0.2693), и наиболее полярным оказался кисспептин (7.1711 ±1.3258). 8. LogP теор и LogP практ – наиболее низкое значение у 6-ГДА (-0,91), затем окситоцина (-0,69); у кисспептина-10 значение, близкое к нулю (0,27) и самое большое значение у галоперидола (3,70). 9. LogP практ определяли с помощью СФМ, в ходе чего было установлено, что наименьшее значение у 6-ГДА, как у самого гидрофильного соединения (-1,01), затем окситоцин (-0,816) и кисспептин (-0,79) и самое большое значение, как у самого липофильного соединения у галоперидола (-0,2). 10.Растворимость в воде (LogS) является важным фактором, влияющим на проницаемость ГЭБ, хотя и не является определяющим. Анализ показал, что умеренной растворимостью обладает только 6-ГДА (-1,44), остальные исследуемые соединения практически нерастворимы. 11. LogBB: Значение logBB, равное -0,3 или менее говорит о низкой способности проникать через ГЭБ, согласно полученным данным, наилучшим показателем обладает галоперидол (0,488), наихудшим- кисспептин-10 (-1,125).
3. Результаты исследований экспериментов in vivo
4. Исследования действия 6-Гидроксидофамина

При исследовании поведения у животных в тесте «открытое поле» по показателям: горизонтальная двигательная активность, принюхивание, стойка на стенку, стойка на задних лапах, исследование норок и количество болюсов, в тесте ротарод, показатель: временя удерживания и пол тест, показатель: время переворота и спуска, достоверных различий между эксперименитальной группой, группой физиологического раствора и контролем установлено не было (Табл. 3).

Таблица 3. Результаты поведенческих тестов после введения 6-ГДА в тестах открытое поле, (уровень горизонтальной двигательной активности, принюхивание, стойки на стенке), Ротарод (время удерживания на ротароде), Пол тест (время переворота и спуска).

Table 3. Results of behavioral tests after the introduction of 6-GDA in the open field tests (level of horizontal motor activity, sniffing, wall stand), rotarod (time of holding on the rotarod), Pol test (time of turning over and descent).

	Контроль	Физ.р. ВБ	Внутрибрюшинное введение 6-ГДА
Открытое поле
Горизонтальная двигательная активность (кол-во пересеченных квадратов)	53,90±6,05	49,79±5,50	46,00±3,34
Принюхивание	11,90±0,83	10,95±0,9	9,0±0,73
Стойки на стенку	14,10±2,26	14,50±2,52	10,10±1,79
Ротарод
Время удерживания,с	60,04±5,39	62,78±5,12	76,81±12,22
Пол тест
Время переворота, с	2,67±0,50	4,00±0,50	3,67±0,41
Время спуска, с	14,55±1,48	12,73±1,82	12,36±1,04

Сокращения: Физ.р. ВБ- шруппа мыщей после внутрибрюшинного введения физиологического раствора 300мкл

 

2. Исследования действия Кисспептина-10

Тест «Половая мотивация»

Контрольное латентное время до начала реакции самца на самку составило 9,1±1,0 сек. Внутрибрюшинное введение кисспептина-10 только в максимальной дозировке достоверно сократило латентное время (р≤0,05) по сравнению с интактной группой и составило 4,1±0,5 сек (Рис. 1). Остальные дозировки внутрибрюшинного введения кисспептина-10 (1 и 10 мкг) достоверно не изменяли контрольное латентное время. Внутрибрюшинное введение физиологического раствора достоверных изменений по сравнению с интактной группой не показало, что говорит о том, что уровень тревожности у животных значительно не повысился и манипуляции проведены правильно. Вторым оцениваемым параметром эксперимента определение количества попыток достижения самки самцом у перегородки Количество попыток достижения самки самцом у перегородки в интактной группе составило 13,5±1,0. Внутрибрюшинное введение кисспептина-10 в дозировке 100 мкг недостоверно увеличило количество попыток достижения самки самцом у перегородки по сравнению с интактной группой и составило 15,7±2,1 сек, а внутрибрюшинное введение кисспептина-10 в дозировках 1 и 10 мкг не повлияло на количество попыток достижения самки самцом у перегородки по сравнению с интактной группой. Внутрибрюшинное введение физиологического раствора достоверных изменений по сравнению с интактной группой не показало и составило 14,0±1,2. Таким образом, внутрибрюшинное введение кисспептина-10 почти не изменяло поведение животных.

 

Рис 1. Поведение животных в тесте «Половая мотивация» после внутрибрюшинного введения физиологического раствора и кисспептина-10, а- показатель «Латентный период», б- показатель «Количество подходов к самке».

Fig. 1. Animal behavior in the “Sexual motivation” test after intraperitoneal administration of saline and kisspeptin-10, a - “Latent period” indicator, b - “Number of approaches to the female” indicator.

1. Интактные – Интактная группа животных без воздействия,
   2. Кисспептин ВБ 1 – внутрибрюшинное введение кисспептина-10 в дозировке 1 мкг
   3. Кисспептин ВБ 10 – внутрибрюшинное введение кисспептина-10 в дозировке 1 мкг
   4. Кисспептин ВБ 100 – внутрибрюшинное введение кисспептина-10 в дозировке 1 мкг
   5. Физ.р. ВБ – внутрибрюшинное введение физиологического раствора
   Примечание: результаты исследования представлены в виде M±m;
   * – р≤0,05, ** – р≤0,01- различие между группой с введением кисспептина-10 и интактной группой;
2. Intact - an intact group of animals without influence,
   2. Kisspeptin IP 1-intraperitoneal introduction of Kisspeptin-10 in a dosage of 1 μg
   3. Kisspeptin IP 10- intraperitoneal introduction of Kisspeptin-10 in a dosage of 1 μg
   4. Kisspeptin IP 100- intraperitoneal Introduction of Kisspeptin-10 in a dosage of 1 μg
   5. Saline. IP- intraperitoneal administration of a physiological solution
   Note: The results of the study are presented in the form of M ± M;
   *- p≤0.05- The difference between the group with the introduction of Kisspeptin-10 and the intact group;

Тест «приподнятый крестообразный лабиринт». 

 Различий в количестве перебежек у группы внутрибрюшинного введения кисспептина-10 в дозировках 1 и 10 мкг (2,33±0,4; 2,67±0,5), физиологического раствора (2,4±0,3) и интактной группой (2,2±0,3) обнаружено не было (Табл. 4). При повышении дозировки до 100 мкг внутрибрюшинно наблюдалось достоверное увеличение перебежек до 5,1±1,1 по сравнению с интактной группой. Следующими оцениваемыми показателями было время, проведенное в открытых рукавах и количество свешиваний с рукавов.

При внутрибрюшинном введении кисспептина достоверные изменения по обоим параметрам наблюдались только при максимальной дозировке, показав увеличение времени в открытых рукавах до 32,5±2,5 по сравнению с интактной группой 15,1±2,1 с и с 1,7±0,2 у интактной группы по количеству свешиваний до 4,4±0,5. Остальные группы - внутрибрюшинного введения физиологического раствора, внутрибрюшинного введения 1 и 10 мкг кисспептина, достоверных изменений по сравнению с интактной группой не показало.

Таблица 4. Результаты поведенческого теста «Приподнятый крестообразный лабиринт» после введения кисспептина-10.

Table 4. Results of the behavioral test "Elevated plus maze" after the administration of kisspeptin-10.

			Внутрибрюшинное
	Интактные	Физ.р. ВБ	1	10	100
Количество перебежек между рукавами	2,22±0,32	2,4±0,3	2,33±0,4	2,67±0,5	5,1±1,1*
Время в открытых рукавах	15,1±2,1	12,44±2,26	12,56±2,30	11,44± 2,07	32,5±2,5 * =
Количество свешиваний с рукава	1,7±0,2	2,0 ±0,23	1,6±0,23	1,5±0,24	4,4±0,5*=

 

Примечание: результаты исследования представлены в виде M±m;
* – р≤0,05, ** – р≤0,01- различие между группой с введением кисспептина-10 и интактной группой; =- p ≤ 0,05- различия между группами введений физиологического раствора и экспериментальной группы соответствующего введения.

Тест «Открытое поле»

У группы животных внутрибрюшинного введения физиологического раствора достоверных различий с интактной группой ни по одному параметру обнаружено не было.

Поведение животных, которым вводили кисспептин-10 в дозах 1 и 10 мкг внутрибрюшинно достоверно не изменялось ни по одному параметру (Табл. 5). Внутрибрюшинное введение 100 мкг кисспептина-10 характеризуется достоверным увеличением горизонтальной активности, вертикальных стоек, исследований норок и пересеченных квадратов (р≤0,05), по сравнению с интактными мышами. Остальные показатели (обнюхивание, стойка с упором, груминг и количества болюсов) достоверных различий экспериментальные группы не показали не показали достоверных отличий от интактной группы.

Таким образом, эмоционально-исследовательское и двигательное поведения после внутрибрюшинного введения кисспептина-10 изменялись достоверно, по сравнению с интактной группой только в максимальной дозировке 100 мкг.

Таблица 5. Результаты теста «Открытое поле» после введения кисспептина-10.

Table 5. Results of the Open Field test after administration of kisspeptin-10.

			Внутрибрюшинное
	Интактные	Физ.р. ВБ	1	10	100
Обнюхивание	32,89±3,21	40,89±8,36	30,56±4,25	38,67± 4,16	35,67±6,2
Стойки с упором	3,88±0,96	3,22 ±0,49	2,7±0,52	2,22±0,49	2,56±0,50
Вертикальные стойки	1,55±0,24	2,22±0,40	1,44±0,24	3,11±0,51	1,22±0,14*
Норки	6,00±1,26	7,44±1,51	4,22±0,96	7,00±1,09		13,22±1,09*
Пересеченные квадраты	24,22±4,51	22,22±3,40	23,89±3,90	21,67±2,94		42,89±2,18*

 

Примечание: результаты исследования представлены в виде M±m;
* – р≤0,05, ** – р≤0,01- различие между группой с введением кисспептина-10 и интактной группой; =- p ≤ 0,05- различия между группами введений физиологического раствора и экспериментальной группы соответствующего введения.

Физ.р. ВБ- шруппа мыщей после внутрибрюшинного введения физиологического раствора 300мкл

 

3. Исследования действия окситоцина

По показателям количество перебежек между рукавами и время, проведенное в открытых рукавах достоверных различий установлено не было ни при одной дозировке внутрибрюшинного введения окситоцина, а также введения физиологического раствора (Табл. 6). Было выявлено достоверное различие при оценке показателя частоты свешиваний с рукавов. У группы мышей после внутрибрюшинного (9,10 ± 0,83) введения 300 мкл окситоцина 5 МЕ количество свешиваний увеличивалось по сравнению с КГ, не получавшей препарат и физиологический раствор (3,77 ± 0,98, p ≤ 0,05).

Таблица 6. Результаты анализа в тесте приподнятый крестообразный лабиринт после введения окситоцина

Table 6. Results of the elevated plus maze test analysis after oxytocin administration

			Внутрибрюшинное
	Интактные	Физ.р. ВБ	20 мкл	300 мкл
Количество перебежек между рукавами	1,10 ± 0,10	1,30 ± 0,15	1,30 ± 0,15	1,50 ± 0,22
Время в открытых рукавах	5,67±1,96	6,40±1,78	5,50±1,94	10,50±2,76
Количество свешиваний с рукава	3,77 ± 0,98	5,20±1,03	4,80 ±1,17	9,10 ± 0,83 **

**- p <0,01; ****- p <0,0001- сравнение группы введения физиологического раствора и экспериментальной группы

Физиологический раствор. ВБ- группа мыщей после внутрибрюшинного введения физиологического раствора 300мкл

Вторая методика, которой подвергались животные, была светлая и темная камеры. Оценивались параметры: время пребывания в светлой камере и количество переходов между светлой и темной камерами (Табл. 7). По первому параметру различий между экспериментальной, контрольной и интактной группой не обнаружены. По второму показателю наблюдалось достоверное увеличение количества переходов между камерами, что говорит о слабом анксиолитическом эффекте после внутрибрюшинного введения окситоцина (p ≤ 0,05).

Таблица 7. Результаты анализа внутрибрюшинного введения галоперидола в разных дозах на поведение мышей в тесте темная и светлая камеры.

Table 7. Results of the analysis of intraperitoneal administration of haloperidol in different doses on the behavior of mice in the dark and light chamber test.

				Внутрибрюшинное
	Интактные	Физ.р. ВБ 20 мкл	Физ.р. ВБ 300 мкл	20 мкл	300 мкл
Время пребывания в светлой камере	100,40 ± 15,29	82,10 ± 12,22	82,10 ± 12,22	82,10 ± 12,22	84,30 ± 12,24
Количество переходов между светлой и темной камерами	3,30±0,65	3,40±1,78	3,90±0,62	3,90±0,92	6,40±1,78*

1 — интактные мыши; 2 — ложное внутрибрюшинное введение (внутрибрюшинное введение 20 мкл физиологического раствора), 3 — ложное внутрибрюшинное введение (внутрибрюшинное введение 300 мкл физиологического раствора), 4 —внутрибрюшинное введение 20 мкл окситоцина 5 МЕ; 5 — внутрибрюшинное введение 300 мкл окситоцина 5 МЕ

*-p ≤ 0,05- сравнение контрольной и экспериментальной групп

Физиологический.раствор. ВБ 20 мкл и 300 мкл- группы мыщей после внутрибрюшинного введения физиологического раствора 20 и 300мкл соответственно.

4. Исследования действия галоперидола

Поведенческий тест «Поза лектора». При исследовании мышей, которые однократно получали 0,1, 0,5 и 1 мг/кг галоперидола в тесте «Поза лектора» было установлено, что время пребывания животного в неподвижном состоянии при всех трех дозировках достоверно увеличивалось при внутрибрюшинном введении, по сравнению с группой интактных животных и группой животных, которым вводили физиологический раствор во всех временных точках (P ≤ 0.05, P ≤ 0.01 и P ≤ 0.001) (Табл. 8). Наблюдался дозозависимый эффект галоперидола при увеличении дозы с 0,1 мг/кг до 1 мг/кг. Максимальное увеличение времения пребывания в позе лектора составило 119,50± 0,27 с, что в 3,7 раз больше времени у контрольной группы, что говорит о выраженном влиянии галоперидола после внутрибрюшинного введения на мышей (32±10,08).

Табл.8 Результаты анализа внутрибрюшинного введения галоперидола в разных дозах на поведение мышей в тесте «Поза лектора».

Table 8. Results of the analysis of intraperitoneal administration of haloperidol in different doses on the behavior of mice in the “Lecturer’s Pose” test.

Тест			Внутрибрюшинное
	Контроль	Физ.р.ВБ	0,1	0,5	1
30	32±10,08	41,75±10,72	77,00±5,52#	101,40± 3,29###	110,00 ± 4,11###
60	26±8,28	40,18±11,20	91,25±4,97##	112,90± 0,67###	112,50± 3,66###
120	39±11,68	34,75±9,82	98,75±5,30###	114,0± 1,63###	119,50± 0,27###

Примечание. #- P ≤ 0,05; ##- P ≤ 0,01; ###- P ≤ 0,001 – по сравнению с группой мышей, которым внутрибрюшинно вводили физиологический раствор,

Note. # - P ≤ 0.05; ## - P ≤ 0.01; ###- P ≤ 0.001 – compared with the group of mice that were injected intraperitoneally with saline

Физ.р. ВБ- группа мыщей после внутрибрюшинного введения физиологического раствора 300мкл

Pole test. (Табл. 9). При минимальной дозировке при оценке параметра переворота, достоверного изменения эффекта обнаружено не было, в то время как при максимальной дозировке (1 мг/кг) наблюдалось наибольшее увеличение времени показателя с 1,29±0,13 у контрольной группы до 21,67± 3,10 через 60 минут и с 1,31±0,15 у контрольной группы до 34,00± 4,57 через 120 минут. Достоверных различий между группой введения физ. раствора и контрольной установлено не было.

Табл. 9. Результаты анализа внутрибрюшинного введения галоперидола в дозах на поведение мышей в Пол тесте.

Table 9. Results of the analysis of intraperitoneal administration of haloperidol in doses on the behavior of mice in the Pol test.

Тест			Внутрибрюшинное
	Контроль	Физ.р.ВБ	0,1	0,5	1
Переворот
30	1,22±0,14	2,11±0,35	2,50±0,37	2,40± 0,61	7,67 ± 1,11
60	1,29±0,13	2,11±0,35	2,00±0,46	7,37± 1,67*	21,67± 3,10***
120	1,31±0,15	2,11±0,35	3,40±1,06	7,75± 1,11	34,00± 4,57***
Спуск
30	7,05±0,70	6,77±0,52	7,40±0,65	12,61±0,96	10,33±1,20
60	7,05±0,70	6,77±0,52	12,20±1,49	12,13±1,39	24,00±6,25**
120	7,05±0,70	6,77±0,52	20,40±5,86	13,00±1,35	39,67±1,48 ***

Примечание. *- P ≤ 0,05, **- P ≤ 0,01, ***- P ≤ 0,001 –экспериментальная группа по сравнению с группой мышей, которым внутрибрюшинно вводили физиологический раствор

Note. * - P ≤ 0.05, ** - P ≤ 0.01, *** - P ≤ 0.001 - compared with the group of mice that were intraperitoneally injected with saline

Физ.р. ВБ- группа мышей после внутрибрюшинного введения физиологического раствора 300мкл

При определении параметра «время cпуска» дозировка 1 мг/кг была наиболее эффективна, показав достоверное увеличение времени для спуска в Pole тесте для внутрибрюшинного методов введения галоперидола (Табл 9). Наибольшие различие были установлены при введении дозировки 1 мг/кг, по сравнению с группой введения физ. раствора (P ≤ 0.01). Можно сделать вывод, что внутрибрюшинное введение галоперидола сильно изменяло поведение мышей в поведенченских тестах, что говорит о достаточно высокой эффективности внутрибрюшинного введения галоперидола.

Поведенческий тест «Открытое поле».

Наблюдение за грызунами в тесте «Открытое поле» позволило выявить характерные особенности изменения горизонтальной активности в тесте «Открытое поле» в зависимости от временной точки и дозировки. Наибольшие различия были выявлены в количестве пересеченных квадратов между животными, подвергшимися введению

Галоперидола в дозе 1 мг/кг, и животными контрольной группы (Табл. 10). Горизонтальная активность после внутрибрюшинного введения через 60 минут достоверно уменьшалась до 9,67± 2,02 при дозировке 0,5 мг/кг и 6,87± 2,11 при дозировке 1 мг/кг, по сравнению с группой мышей после введения физиологического раствора (P ≤ 0,001). Самая низкая дозировка понижала показатель, но недостоверно, с 38,20±2,77 у группы введения физ. раствора до 27,60±4,06. При определении показателя «Стойка на задних лапках», было установлено стойкое понижение их числа на 60 и 120 минуте средней и максимальной дозировке (P ≤ 0.01 и P ≤ 0.001).

 

Табл. 10. Результаты анализа внутрибрюшинного введения галоперидола в дозах на поведение мышей в отрытое поле.

Table 10. Results of the analysis of intraperitoneal administration of haloperidol in doses on the behavior of mice in an open field.

Тест			Внутрибрюшинное
	Контроль	Физ.р.ВБ	0,1			0,5		1
Горизонтальная двигательная активность
30	47,00±1,60	38,20±2,77	27,60±4,06			14,25± 2,74 ###		11,67 ± 2,04 ###
60	46,53±1,68	38,20±2,77	24,00±3,14			15,75± 1,85 ###		3,00± 0,92 ###
120	49,10±1,97	38,20±2,77	16,00±3,36			9,67± 2,02 ###		6,87± 2,11 ###
Стойка на задних лапках
30	3,25±0,36	2,62±0,37	2,00±0,76		0,5±0,32			1,33±0,44
60	3,25±0,36	2,62±0,37	1,30±0,30		0,5±0,18 ##			0,33±0,07 ###
120	3,25±0,36	2,62±0,37	1,80±0,48		0,00±0,0 ###			0,33±0,07 ###
Норки
30	6,00±0,50	4,00±0,64	3,80±0,77	1,75±0,16 #			2,88±0,56
60	6,00±0,50	4,00±0,64	2,25±0,36	1,50±0,56 ##			0,67±0,28 ###
120	6,00±0,50	4,00±0,64	2,00±0,00	00,00±0,00 ###			0,44±0,28 ###

 

При определении параметра «Норки» при средней дозировке внутрибрюшинное введение эффективно понижало дозу до 0,44±0,28 (P ≤ 0.001), по сравнению с группой введения физ.раствора.

Обсуждение

Обсуждение данных in silico и in vitro

Обобщив данные, полученные с помощью QSAR, наилучшая проходимость через ГЭБ по исследуемым параметрам наблюдается у галоперидола (Табл. 11). Остальные соединения (кисспептин-10, 6-ГДА и окситоцин) показали слабые свойства по отношению к ГЭБ.

Таблица 11. Анализ физико-химических свойств исследуемых веществ, способствующих (+) и препятствующих (-) преодолению ГЭБ.

Table 11. Analysis of the physicochemical properties of the studied substances that promote (+) and hinder (-) overcoming the BBB.

Вещество

VDW, EI

DEEP, Å

MEP, кДж/моль

MLP

HBACC, Number of H-bond acceptors

HBDON, Number of H-bond donors

PSA, Polar surface area (Å2)

LogBB

LogP теор

LogP практ

LogS

Способность проникать через ГЭБ

6-Гидроксидофамина гидрохлорид

-

+

-

-

+

-

-

-

-

-

+

Низкая

Кисспептин-10

-

-

+

-

+

+

-

-

-

-

-

Низкая

Окситоцин

-

-

-

-

+

+

-

-

-

-

-

Низкая

Галоперидол

+

-

-

+

-

-

+

+

+

+

-

Высокая

 

Растворимость в воде (LogS) является важным фактором, влияющим на проницаемость ГЭБ, хотя и не является определяющим. Молекула должна обладать определенной растворимостью в воде, чтобы успешно проходить через водные поры и межклеточное пространство ГЭБ. Умеренной растворимостью обладает только 6-ГДА (-1,44), остальные исследуемые соединения практически нерастворимы LogS > 0 - очень хорошо растворимо (> 1 моль/л), LogS от -1 до 0 - хорошо растворимо (0,1 – 1 моль/л). При значениях LogS от -2 до -1 – вещество умеренно растворимо (0,01 – 0,1 моль/л), LogS < -4 - практически нерастворимо (< 0,0001 моль/л). Анализ показал, что умеренной растворимостью обладает только 6-ГДА (-1,44), остальные исследуемые соединения практически нерастворимы. Последним определяемым параметром был LogBB-значение logBB, равное -0,3 или менее говорит о низкой способности проникать через ГЭБ [11], согласно полученным данным, наилучшим показателем обладает галоперидол (0,488), в то время как  кисспептин-10 (-1,125), 6-ГДА (-0,790) и окситоцин (-0,904) имеют низкое значение, что говорит о плохой способности проникать через ГЭБ. Отдельного внимания заслуживает показатель LogP. LogP является компонентом эмпрического правила Липински, которое позволяет оценить биодоступность химического соединения с определенным набором фармакологических и биологических активностей и его способность быть лекарственным средством [12]. Правило гласит, что соединение, чтобы быть «подобным» лекарству, должно: во-первых, иметь менее пяти атомов-доноров водородной связи вследствие  того, что большое количество доноров водородной связи связано с плохой проницаемостью мембраны за счет дополнительной энергии, необходимой для разрушения водородных связей при переходе из водной среды в липидную мембрану; во-вторых, иметь молекулярную массу менее 500, так как высокое значение молекулярной массы связано с плохой растворимостью и плохой проницаемостью через мембраны; в-третьих, липофильность logP должна быть менее 5. У соединений с высоким значением logP происходит увеличение нежелательных проявлений токсикологических свойств; в-четвертых,  иметь суммарно не более 10 атомов азота и кислорода (грубая оценка количества акцепторов водородной связи). По данным анализа in silico было установлено, что самое маленькое значение практического LogP у 6-ГДА. Чем ниже LogP (значение -1 и более), тем гидрофильнее молекула, тем хуже проникает или практически не проникает через липидные мембраны ГЭБ. Низкое значение логарифма также у окситоцина (-0,69). У кисспептина-10 значение, близкое к нулю (0,27). Окситоцин и кисспептин могут плохо проникать через барьер, т.к. обладают невыраженными гидрофильными и липофильными свойствами. Наибольшое значение LogP у галоперидола (3,70), что говорит о выраженных липофильных свойствах, что спобоствует хорошему проникновению через ГЭБ. Анализ LogP, в ходе физико-химического анализа с помощью спектрофотометрии показал наименьшее значение у 6-ГДА, как у самого гидрофильного соединения (-1,01), затем окситоцин (-0,816) и кисспептин (-0,79). Логарифмы, полученные в ходе спектрофотометрии, у кисспептина и окситоцина отличаются от полученных данных in silico, это объясняется тем, что при расчетах in silico учитываются молекулярные структуры веществ без учета многих параметров, которые могут влиять на параметр, например, температура раствора, pH и др. Спектрофотометрические данные принимают во внимание данные факторы и являются наиболее точными. Наибольшее значение практического логарифма, как у самого липофильного соединения, наблюдалось у галоперидола (-0,2). Однако оно меньше теоретического, что может быть связано с параметрами, которые ухудшают его проницаемость (высокая энергия поляризации, высокое количество доноров водородных связей и низкая растворимость в воде). Таким образом, данные анализа in silico и физико-химического метода согласуются и подтверждают высокую степень прохождения через ГЭБ у галоперидола и низкую для окситоцина, кисспептина-10 и 6-ГДА.

Обсуждение результатов фармакологического анализа в экспериментах на животных in vivo

6-ГДА. Изменение поведения после введения 6-ГДА внутрибрюшинным методом оценивали по трем тестам: открытое поле, открытое поле и пол тест. В тестах открытое поле» по показателям: горизонтальная двигательная активность, принюхивание, стойка на стенку, стойка на задних лапах, исследование норок и количество болюсов, ротарод, показатель: временя удерживания и пол тест, показатель: время переворота и спуска, достоверных различий между экспериментальной группой, группой физиологического раствора и контролем установлено не было, что подтверждает данные in silico и физико-химический метод определения практического LogP. 6-ГДА не обладает свойствами, способствующими прохождению через ГЭБ, поэтому внутрибрюшинно введенный фармакологический агент не попал в ЦНС и не оказал действия на поведение мышей. Окситоцин. При исследовании поведения у животных в тесте «крестообразный лабиринт» по большинству показателей (количество перебежек между рукавами и время, проведенное в открытых рукавах) различий установлено не было ни при одной дозировке внутрибрюшинного введения окситоцина, а также введения физиологического раствора. Достоверное различие наблюдалось по одному из трех параметров- частоты свешиваний с рукавов. У группы мышей после внутрибрюшинного введения 300 мкл окситоцина 5 МЕ количество свешиваний увеличивалось в 2,4 раза, по сравнению с КГ, не получавшей препарат и физиологический раствор (p ≤ 0,05). Во втором поведенческом тесте время пребывания в светлой камере не изменялось ни у одной из групп, животные предпочитали проводить время в темной камере, но количество переходов между светлой и темной камерами увеличивалось количество переходов между камерами, что говорит о повышении исследовательской активности и слабом анксиолитическом эффекте после внутрибрюшинного введения окситоцина (p ≤ 0,05). Таким образом, по двум тестам наблюдалось изменение по одному из нескольких параметров, что свидетельствует о небольших изменениях в поведении мышей после внутрибрюшинного введения, однако сила эффекта недостаточна. Грызуны предпочитают закрытые рукава, темные норы и имеют естественные страхи находиться на открытых площадках и упасть с высоты. В ходе исследования после внутрибрюшинного введения окситоцина мыши предпочитали закрытые рукава, но имели повышенную исследовательскую активность, что связано со слабым анксиолитическим действием окситоцина. Повышение исследовательской активности и уменьше тревожности можжет быть связано с центральными и периферическими составляющими. Механизмы, с помощью которых окситоцин вызывает функциональный эффект, все еще являются предметом дискуссий, особенно с учетом того, что в дополнение к их прямому действию на мозг появляется все больше данных, предполагающих потенциальное влияние через другие периферически опосредованные пути. Поведение мышей изменялось незначительно. Кисспептин. Во всех трех тестах (ПКЛ, открытое поле и половая мотивация) внутрибрюшинное введение кисспептина-10 в дозировках 1 и 10 мкг достоверных различий не продемонстрировало. Вызывало достоверные различия только максимальная дозировка 100 мкг. В тесте открытое поле увеличивался показатель исследованных норок, количество пересеченных квадратов, вертикальных стоек, по сравнению с интактными мышами (р≤0,05). В тесте «Приподнятый крестообразный лабиринт» только максимальная дозировка вызывала увеличение времени проведения в открытых рукавах, количество свешиваний и количество перебежек между рукавами (р≤0,05). Увеличение данных показателей опосредовано уменьшением тревожности и/или повышением исследовательской активности у группы крыс после внутрибрюшинного введения кисспептина-10. По остальным оцениваемым показателям время в закрытых рукавах и число актов груминга достоверных различий между группами выявлено не было. В тесте половой мотивации Кисспептин-10 усиливал один из параметров- уменьшение латентного периода. Таким образом, группа мышей после внутрибрюшинного введения вещества показала достоверные различия в тесте по 4 показателям из 8. Внутрибрюшинное введение кисспептина-10 увеличивало только в одной из трех дозировок- 100 мкг. Суммируя, можно предположить, что кисспептина-10 оказывал слабый поведенческий эффект. Галоперидол. Получены фундаментальные данные, сравнивающие фармакологическую активность галоперидола после внутрибрюшинного введения. Фармакологическая активность определялась по показателям в поведенческих тестах (Пол тест, открытое поле и поза лектора) в трех временных точках- через 30, 60 и 120 минут. Во всех трех тестах наблюдались достоверные изменения показателей после введения галоперидола, по сравнению с контрольными группами. Наиболее чувствительным методом оказался тест «Поза лектора», в котором наблюдалось увеличение эффекта во всех временных. В других тестах увеличение эффекта наблюдается с дозы 0,5 мг/кг, например, в Пол тесте при оценке показателя «время поворота», открытом поле при оценке показателей «горизонтальная активность» и «норки». Дозировка 0,1 мг/кг оказалось недостаточной в данных тестах для усиления эффекта. Также оценивали время проявления поведенческой активности при дозировках 0,1 и 0,5 мг/кг, которое наблюдалось в различных временных точках. Наиболее раннее проявление наблюдалось в двух тестах - «Поза лектора» и открытое поле (горизонтальная двигательная активность и норки), а в Пол тесте и открытом поле (показатель «стойка на задних лапах») изменение активности наблюдалось преимущественно на 60 и 120 минутах. Таким образом, данные, полученные in silico и in vitro согласуются с данными, полученными после фармакологического исследования. Галоперидол проникал через ГЭБ и снижал двигательную, исследовательскую активность.

Заключение:

В исследованиях in silico проводили анализ физико-химических свойств соединений различной химической природы (6-ГДА, галоперидол, окситоцин и кисспептин-10), в ходе которого установлено, что 6-ГДА, окситоцин и кисспептин-10 являются веществами, плохо проникающими через ГЭБ, в то время как галоперидол обладает высокой проходимостью через ГЭБ. С помощью метода УФ-спектрофотометрии также оценивали коэффициент липофильности (LogP) данных соединений. Наиболее высокие значения LogP наблюдались у галоперидола по сравнению с окситоцином, кисспептином-10 и 6-ГДА.

При фармакологическом анализе исследуемых соединений показано соответствие между расчетными показателями проницаемости ГЭБ, оцениваемыми методами in silico и in vitro и данными, полученными в экспериментах in vivo. Периферическое введение 6-ГДА, соединения с отрицательным LogP, не влияло на поведение животных ни в одном из проведенных тестов (Ротарод, Pole test, Открытое поле). Окситоцин и кисспептин-10 оказывали незначительное влияние на поведение, изменяя только некоторые показатели, в то время как поведенческие изменения при периферическом введении галоперидола были наиболее выражены.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о возможности использования показателей (предикторов и LogP), рассчитанных методами in silico и in vitro, для прогнозирования проходимости ГЭБ соединениями различной химической природы.

 

Об авторах

Мария Владимировна Литвинова

Институт экспериментальной медицины

Автор, ответственный за переписку.
Email: litvinova-masha@bk.ru
ORCID iD: 0000-0002-2924-7475
SPIN-код: 9548-4683

аспирант

Россия, 197022, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12

Макар Антонович Андреев

Email: makariy.andreev@gmal.com
ORCID iD: 0009-0004-4908-2614

Виктор Владимирович Ильин

Институт экспериментальной медицины

Email: victor.iljin@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1012-7561
SPIN-код: 5559-8089

канд. хим. наук

Россия, Санкт-Петербург

Андрей Андреевич Лебедев

Институт экспериментальной медицины

Email: aalebedev-iem@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0003-0297-0425
SPIN-код: 4998-5204

доктор биол. наук, профессор

Россия, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12

Евгений Рудольфович Бычков

Институт экспериментальной медицины

Email: bychkov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8911-6805
SPIN-код: 9408-0799

канд. мед. наук

Россия, Санкт-Петербург

Петр Дмитриевич Шабанов

Институт экспериментальной медицины; Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова

Email: pdshabanov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1464-1127
SPIN-код: 8974-7477

доктор мед. наук, профессор

Россия, 197022,Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12; 194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, 6

Список литературы