Computational and experimental evidence of blood–brain barrier permeability assessed in silico, in vitro, and in vivo

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Проникновение фармакологических агентов через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) — важнейший фармакокинетический процесс, оказывающий решающее влияние на эффективность, способ применения и безопасность действия вещества. Существуют различные методы оценки проникновения веществ через ГЭБ. Методы анализа in silico обладают большим количеством преимуществ: быстрота получения результатов, не требует значительных вложений и затрат времени, снижение вреда для человека и животных при тестировании, возможность предварительного скрининга. К популярным методам анализа in silico относят веб-платформу Way2Drug и ПО VEGA ZZ. Way2Drug — это быстро развивающийся веб-портал, ориентированный на интеграцию востребованных вычислительных инструментов для поиска, анализа и разработки фармакологических веществ с использованием методов машинного обучения и искусственного интеллекта [1]. В настоящее время Way2Drug предоставляет возможность оценки многих видов биологической активности, токсичности, метаболизма и физико-химических характеристик для анализа химических соединений [2]. VEGA ZZ — это программное обеспечение, которое содержит все необходимые инструменты для создания сложных молекулярных структур в режиме реального времени. Одной из ключевых особенностей VEGA ZZ является использование алгоритмов машинного обучения с помощью количественных методов для моделирования взаимодействия молекул с биологическими системами [3]. Обе программы работают по методу структура–активность (QSAR) для прогнозирования физическо-химических свойств [4]. В основе метода QSAR лежит понимание, что биологическая активность соединения тесно связана с его молекулярной структурой. Благодаря использованию числовых дескрипторов данные математические модели включают различные измерения химической информации для прогнозирования [5]. Для лечения нейродегенеративных заболеваний D. Xie и соавт. использовали модели 3D-QSAR, чтобы получить информацию о разработке новых ингибиторов моноаминоксидазы B (МАО-B) для увеличения эффективной ингибирующей активности и стабильного связывания с рецептором [6]. Низкая проницаемость ГЭБ является ключевой проблемой для лечения большинства нейродегенеративных заболеваний. К свойствам соединений, влияющим на прохождение через ГЭБ, можно отнести: липофильность (параметр logP), растворимость в воде (logS), полярная площадь поверхности и тoпологический индекс полярной площади поверхности (PSA и TPSA), межмолекулярные взаимодействия: силы Ван-дер-Ваальса, доступность областей молекулы для взаимодействий (DEEP), уровень взаимодействия молекулы с полярными и заряженными компонентами ГЭБ (MEP), молекулярный липофильный потенциал (MLP), способность образовывать водородные связи, донорно-акцепторные свойства (HBACC и HBDON) и др. Некоторые химические вещества (боскалид, этоксазол) имеют различия до четырех порядков величины при сравнении параметров in silico и in vitro [7]. Прогнозирование физико-химических свойств потенциальных препаратов для понимания отношения к ГЭБ при лечении заболеваний ЦНС — одна из современных задач, которая стоит перед фармакологией.

Цель исследования

Определить и сравнить значения параметров, которые могут выступать предикторами для преодоления ГЭБ in silico, in vitro и проверить полученные данные в экспериментах in vivo.

МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Проведено рандомизированное клиническое исследование.

Условия проведения исследования

В исследовании использовали мышей, полученных из питомника «Рапполово» (Ленинградская обл.). Животных содержали в стандартных пластмассовых клетках в условиях вивария при свободном доступе к воде и пище и инвертированном освещении с 8:00 до 20:00 при температуре 22±2 °C. Опыт состоял из трех этапов: 1) определение параметров in silico для прогнозирования прохождения ГЭБ; 2) определение предиктора in vitro для прогнозирования прохождения ГЭБ; 3) фармакологический анализ действия веществ у экспериментальных животных после внутрибрюшинного введения.

Исследования проводили согласно Правилам лабораторной практики в Российской Федерации (Федеральный закон от 12.04.2010 № 61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств», Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации № 267 от 19.06.2003). Эксперименты на животных проводили в соответствии с правилами, принятыми Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей.

Определение in silico

Свойства для прогнозирования преодоления ГЭБ (DEEP, MEP, MLP, PSA, logS, logP и logBB) рассчитываются для каждой точки с помощью соответствующего алгоритма. Алгоритм DEEP: для каждой точки вычисляется расстояние от геометрического центра молекулы. Это свойство полезно для окрашивания поверхности по градиенту, чтобы выделить глубокие карманы и полости молекулы. MEP рассчитывается путем проецирования атомных зарядов на поверхность молекулы; MLP — путем проецирования атомных констант липофильности Брото–Моро на молекулярную поверхность [8]; PSA — с учетом полярных и неполярных атомных поверхностей. Эти свойства проецируются на поверхности с помощью двух цветовых кодов: синий (неполярная поверхность) и красный (полярная поверхность) [9]. Для расчетов логарифмов P и S, применяется ALogPS2.1, которая использует комбинацию атомных и фрагментных вкладов с коррекциями на основе молекулярной структуры, разбивает молекулу на составляющие части (атомы, функциональные группы, связи) и присваивает каждой части определенный вклад в logS и logP, вклады суммируются, а затем применяются специфические поправки (в зависимости от молекулы). Расчет logBB осуществлялся по отношению концентрации соединения в мозге к концентрации соединения в плазме [10].

Определение in vitro

Для расчета коэффициентов распределения использовали значения оптической плотности растворов, полученные методом ультрафиолетовой спектроскопии (УФС). Измерения проводили на УФ-спектрофотометре Beckman Coulter DU800 UV/Visible и хроматографической системе высокого давления BioLogic DuoFlow. Расчет практического logP осуществляли по формуле: P = lg(D_исх – D_конечн /D_конечн), где D_конечн — значение оптической плотности водного раствора после встряхивания с октанолом, D_исх — оптическая плотность исходного водного раствора до встряхивания с октанолом.

Фармакологический анализ действия веществ у экспериментальных животных

В работе использовано 170 беспородных белых мышей-самцов: 70 мышей на исследование с галоперидолом, 30 — на 6-ГДА, 30 — кисспетин-10, 40 — окситоцин.

В исследовании 6-ГДА использовали 30 мышей. Мыши были разделены на 3 равные группы: первая группа — контроль, группа, не подвергавшаяся воздействию; вторая группа — мыши, которым внутрибрюшинно (в/б) вводили 6-ГДА (в дозе 100 мг или 4 мкг/мкл); третья группа — мыши, которым в/б вводили 0,9% раствор натрия хлорида в дозе 300 мкл. Через 21 день после введения нейротоксина в дозе 100 мкг оценивали поведение животных в тесте «открытое поле», «ротарод», пол-тест.

В исследовании окситоцина использовали 40 беспородных мышей, разделенных на 4 группы: первая группа была интактной и не подвергалась введению окситоцина или 0,9% раствора натрия хлорида; вторая и третья группы получали однократное в/б введение 20 и 300 мкл окситоцина 5 МЕ соответственно; четвертая группа — 0,9% раствор натрия хлорида в дозе 300 мкл в/б. Поведенческие эффекты регистрировали в приподнятом крестообразном лабиринте в течение 5 мин и тесте «темная и светлая камеры».

В исследовании галоперидола использовали 70 беспородных мышей, разделенных на следующие группы: первая группа была интактной и не подвергалась введению галоперидола или 0,9% раствора натрия хлорида; вторая, третья и четвертая группы получали однократное введение 0,1, 0,5 и 1 мг/кг галоперидола в/б 300 мкл соответственно; пятая группа получала 300 мкл 0,9% раствора натрия хлорида в/б. Через 30, 60 и 120 мин после введения оценивали поведение животных в тесте «открытое поле», «поза лектора» и пол-тест.

В исследовании кисспептина-10 использовали 30 беспородных мышей, разделенных на группы: первая группа не подвергалась никакому введению; вторая, третья и четвертая группы подвергались однократному введению 1, 10 и 100 мг/кг кисспептина-10 в/б соответственно; пятая группа получала 300 мкл 0,9% раствора натрия хлорида в/б. Затем проводили тесты «половая мотивация», «открытое поле» и «приподнятый крестообразный лабиринт».

Методы исследования поведения

Исследование поведения мышей в тесте «открытое поле». С помощью теста исследовали свободную двигательную активность животных. Продолжительность одного опыта составляла 5 мин. Для определения ориентировочной реакции мышь помещали в открытое поле, пол которого разделен на секторы. Подсчитывали число вставаний на задние лапы (вертикальная составляющая ориентировочной реакции), число пересеченных квадратов (горизонтальная компонента), количество обнюхиваний (исследовательская компонента), груминг, фризинг и болюсные выделения, а также число заглядываний в отверстия в полу (норковое поведение, отражающее исследовательскую активность) за 5 мин наблюдения.

Исследование поведения мышей в пол-тесте. Мышь помещали на вершину деревянного стержня (50 см высотой и 1 см в диаметре, обернутого бинтом, и замеряли время, необходимое животному для ориентирования — поворота головой вниз (t-поворота) и спуска вниз по стержню (t-спуска). Стержень крепился к основе, которая устанавливается в «домашнем» боксе животного. Наблюдения продолжали в течении 2 мин.

Исследование поведения мышей в тесте «темная и светлая камеры». В тесте используется естественное стремление грызунов избегать ярко освещенных мест. Животных помещали в ярко освещенный отсек двухкамерной светлой/темной установки и регистрировали число переходов между отсеками за 5 мин, длительность пребывания в светлом и темном отсеках. Анксиолитический эффект проявляется в увеличении числа переходов из одного отсека в другой и время нахождения в светлом отсеке.

Исследование поведения мышей в тесте «поза лектора». Для оценки каталептогенного действия вещества используют несколько методов, позволяющих оценить способность животного сохранять искусственно приданную позу. Мышь располагают у горизонтального стержня, закрепленного на высоте 4 см диаметром 0,5 см так, чтобы она опиралась на обе передние лапки (поза лектора). Попытки придать животному нужную позу не продолжали более 1 мин. Фиксировали время пребывания животного в неподвижном состоянии в течении 2 мин. Оценивали общую продолжительность каталепсии.

Исследование поведения мышей в тесте «Ротарод». Тест предназначен для оценки моторной функции животного, проводится в установке «Ротарод» (Panlab, Harvard Apparatus, США). За неделю и за 30 мин до теста каждое животное обучалось удержанию на вращающемся стержне — с 4 до 40 об/мин в течение 1 мин. После обучения проводили тест, где измеряли длительность удержания при возрастающей скорости (от 4 до 40 об/мин). Максимальное фиксируемое время — 120 с. Латентный период выпадения является мерой работы мышц и моторных навыков мышей.

Исследования поведения крыс в приподнятом крестообразном лабиринте. Беспородных мышей помещали в центр экспериментальной камеры — крестообразного лабиринта, который состоит из 4 рукавов длиной 30 см и шириной 6 см, соединенных под прямым углом. Два рукава имеют с двух сторон стенки высотой 30 см, а два других открыты и освещены рассеянным искусственным светом. Лабиринт расположен на подставке высотой 40 см над уровнем пола. В течение 5 мин систематически проводили визуальную регистрацию следующих параметров: время нахождения в освещенных рукавах; количество выходов из темных рукавов в освещенные; время, которое мыши проводили на центральной площадке; количество свешиваний с открытых рукавов.

Исследование на половую мотивацию. Для оценки аппетентного полового поведения использовали камеру близости вознаграждения на открытом поле из оргстекла [9]. Открытое поле (85×35×50 см) оборудовали камерой с прозрачной перфорированной стенкой (15×35×50 см), установленной на одном конце. Передняя перфорированная стенка позволяет испытуемым подходить и исследовать (обнюхивать) животное (самку в стадии эструса) в камере, но предотвращает тактильный контакт или копуляцию. В день перед тестированием аппетентного поведения все мыши были адаптированы в установке в течение 30 мин. Поведение самцов регистрировали на видео в темной комнате с красным светом в течение 10 мин. Открытое поле и клетку со стимулом протирали 3% перекисью водорода в промежутках между опытами, чтобы устранить обонятельные раздражители. Для измерения половой мотивации для каждого животного фиксировали число попыток достичь самки, время, проведенное вблизи перегородки и латентное время до начала реакции на самку.

Методы статистической обработки данных

Оценку статистической достоверности различий проводили при помощи пакета программ GraphPad Prism 8.4.3 с использованием однофакторного дисперсионного анализа. Для сравнения интактной и экспериментальной групп применяли однофакторный дисперсионный анализ ANOVA. Из непараметрических критериев использовали критерий Краскела–Уоллиса для сравнения групп. Для представления полученных данных применяли такие показатели описательной статистики, как среднеарифметическое значение и ошибка среднего (M±m). Различия считали статистически значимыми при p ≤0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Результаты после анализа in silico и in vitro

Мы проанализировали способность исследуемых веществ с различной химической структурой (6-ГДА, галоперидол, окситоцин, кисспептин-10) проникать через ГЭБ. Большую часть времени молекула проводит в конформации, близкой к той, у которой общая энергия минимальна.

VDW (объем Ван-дер-Ваальса) — показатель размера молекулы. Наибольший объем наблюдается у окситоцина (1088,5 ЕІ) и кисспептина (1405,4 ЕІ), средний — у галоперидола (640 EI), и наименьший — у 6-ГДА. У галоперидола наиболее оптимальное значение VDW для прохождения через ГЭБ (табл. 1–2).

 

Таблица 1. Результаты анализа in silico на физико-химические свойства исследуемых веществ

Table 1. Results of in silico analysis of the physicochemical properties of the studied compounds

Показатель	6-Гидроксидофамина гидрохлорид	Кисспептин-10	Окситоцин	Галоперидол
VDW, EI	318,3	1405,4	1088,5	640,4
DEEP, Å	5,01±0,66	10,07±3,29	8,70±2,29	7,03±2,36
MEP, кДж/моль	0,03±0,39	–0,12±0,10	0,039±0,23	0,04±0,12
MLP	–0,002±0,22	–0,15±0,50	–0,31±0,48	0,22±0,32
HBACC	–1,87±0,60	–1,69±1,05	–1,79±0,92	–0,75±0,62
HBDON	–0,01±0,01	–0,17±0,17	–0,16±0,27	–0,01±0,02
PSA, Å2	–1,01±0,32	7,17±1,33	–0,16±0,27	–6,15±0,89

 

Таблица 2. Результаты анализа, полученные in silico (logP_теор, logS, logBB) и in vitro (спектрофотометрия, logP_практ)

Table 2. Results of in silico (logP_теор, logS, logBB) and in vitro analysis (UV spectrophotometry, logP_практ)

Показатель	6-Гидроксидофамина гидрохлорид	Кисспептин-10	Окситоцин	Галоперидол
logPтеор	–0,91	0,27	–0,69	3,70
logPпракт	–1,01	–0,79	–0,816	0,7
logS	–1,44	–5,15	–4,26	–4,93
logBB	–0,790	–1,125	–0,904	0,488

 

DEEP — характеризует доступность определенных областей молекулы для взаимодействий. Наибольшее значение наблюдается у кисспептина-10, далее у окситоцина и галоперидола. Самое маленькое значение у 6-ГДА, которое наиболее оптимально для преодоления ГЭБ.

MEP (максимальная энергия по поляризации). Молекулы с положительными значениями MEP: 6-ГДА, окситоцин, галоперидол. Молекулы с отрицательными значениями MEP: кисспептин. Отрицательное значение MEP часто указывает на бóльшую липофильность, поэтому кисспептин-10 лидирует по данному показателю среди других соединений.

MLP (минимальная энергия по поляризации). Высокие значения MLP указывают на относительную стабильность молекулы. Низкое значение у 6-ГДА, кисспептина-10, окситоцина может указывать на потенциальные трудности с прохождением через ГЭБ или непредсказуемое поведение молекул. Высокое значение наблюдается только у галоперидола.

HBACC (степень основности/кислотности). 6-ГДА, кисспептин-10 и окситоцин с более низким (отрицательным) значением HBACC (–1,9) указывают на меньшее количество акцепторов водородных связей, что может способствовать его более легкой проницаемости через ГЭБ по данному параметру. Галоперидол является более полярным и имеет некоторое количество акцепторов водородных связей, что может снижать его проницаемость.

HBDON (донор водорода). Значение HBDON отрицательное у всех исследуемых веществ, что говорит о том, что молекула содержит относительно меньшее количество доноров водородных связей. Наиболее гидрофильное значение у 6-ГДА и галоперидола, что делает их худшими для прохождения через ГЭБ среди четырех веществ по данному показателю.

PSA (поверхностная площадь полярной области). Наиболее низкой полярностью обладает галоперидол, затем 6-гидроксидофамин и окситоцин, и наиболее полярным оказался кисспептин.

logP_теор и logP_практ — наиболее низкое значение у 6-ГДА, затем окситоцина; у кисспептина-10 значение, близкое к нулю и самое большое значение у галоперидола.

logP_практ определяли с помощью спектрофотометрии, в ходе чего было установлено, что наименьшее значение у 6-ГДА как у самого гидрофильного соединения, затем у окситоцина и кисспептина и самое большое значение как у самого липофильного соединения — у галоперидола.

Растворимость в воде (logS) — важный фактор, влияющий на проницаемость ГЭБ, хотя и не является определяющим. Анализ показал, что умеренной растворимостью обладает только 6-ГДА (–1,44), остальные исследуемые соединения практически нерастворимы.

logBB. Значение равное –0,3 или менее говорит о низкой способности проникать через ГЭБ, согласно полученным данным, наилучшим показателем обладает галоперидол (0,488), наихудшим — кисспептин-10 (–1,125).

Результаты исследований экспериментов in vivo

Исследования действия 6-ГДА

При исследовании поведения у животных в тесте «открытое поле» по показателям горизонтальная двигательная активность, принюхивание, стойка на стенку, стойка на задних лапах, исследование норок и количество болюсов, в тесте «ротарод» по показателю времени удерживания и в пол-тесте по показателям времени переворота и спуска значимых различий между экспериментальной группой, группой введения 0,9% раствора натрия хлорида и контролем установлено не было (табл. 3).

 

Таблица 3. Результаты поведенческих тестов после введения 6-ГДА в тестах «открытое поле» (уровень горизонтальной двигательной активности, обнюхивание, стойки на стенке), «ротарод» (время удерживания на ротароде), «пол-тест» (время переворота и спуска)

Table 3. Results of behavioral tests following administration of 6-OHDA in the open field test (horizontal locomotor activity, sniffing, wall rearing), rotarod test (time on the rotarod), and pole test (time to turn and time to descend)

Тест	Контроль	Физ. р. в/б	6-ГДА в/б
Открытое поле
Горизонтальная двигательная активность (количество пересеченных квадратов)	53,90±6,05	49,79±5,50	46,00±3,34
Обнюхивание (количество актов обнюхивания)	11,90±0,83	10,95±0,9	9,0±0,73
Стойки на стенку (количество стоек)	14,10±2,26	14,50±2,52	10,10±1,79
Ротарод
Время удерживания, с	60,04±5,39	62,78±5,12	76,81±12,22
Пол-тест
Время переворота, с	2,67±0,50	4,00±0,50	3,67±0,41
Время спуска, с	14,55±1,48	12,73±1,82	12,36±1,04
Примечание. Физ. р. в/б — внутрибрюшинное ведение 300 мкл 0,9% раствора натрия хлорида; 6-ГДА в/б — внутрибрюшинное введение 6-гидроксидофамина.

 

Исследования действия кисспептина-10

Тест «половая мотивация»

Контрольное латентное время до начала реакции самца на самку составило 9,1±1,0 с. Введение в/б кисспептина-10 только в максимальной дозировке значимо сократило латентное время (р=0,0008) по сравнению с интактной группой и составило 4,1±0,5 с (рис. 1). Остальные дозировки в/б-введения (1 и 10 мкг) значимо не изменяли контрольное латентное время. Введение в/б 0,9% раствора натрия хлорида достоверных изменений по сравнению с интактной группой не показало, что говорит о том, что уровень тревожности у животных значительно не повысился и манипуляции проведены правильно. Вторым оцениваемым параметром эксперимента было определение количества попыток достижения самки самцом у перегородки, которое составило в интактной группе 13,5±1,0. Введение в/б кисспептина-10 в дозировке 100 мкг незначимо увеличило количество попыток по сравнению с интактной группой и составило 15,7±2,1 с, а в/б-введение кисспептина-10 в дозировках 1 и 10 мкг не повлияло на количество попыток достижения самки самцом у перегородки по сравнению с интактной группой. Введение в/б 0,9% раствора натрия хлорида статистически значимых изменений по сравнению с интактной группой не показало и составило 14,0±1,2. Таким образом, кисспептин-10 почти не изменял поведение животных.

 

Рис. 1. Поведение животных в тесте «половая мотивация» после внутрибрюшинного (в/б) введения 0,9% раствора натрия хлорида и кисспептина-10: а — показатель «Латентный период»; b — показатель «Количество подходов к самке». 1 — интактные (интактная группа животных без воздействия); 2 — кисспептин в/б 1 (в/б введение кисспептина 10 в дозировке 1 мкг); 3 — кисспептин в/б 10 (в/б введение кисспептина-10 в дозировке 10 мкг); 4 — кисспептин в/б 100 (в/б введение кисспептина-10 в дозировке 100 мкг); 5 — физ. р. в/б (в/б введение 0,9% раствора натрия хлорида). Результаты исследования представлены в виде M±m. *р ≤0,05; — различие между группой с введением кисспептина-10 и интактной группой.

Fig. 1. Animal behavior in the sexual motivation test following intraperitoneal (i.p.) injection of 0.9% sodium chloride solution and kisspeptin-10: a, latency period; b, number of approaches to the female. 1, intact (intact group of animals without intervention); 2, i.p. kisspeptin 1 (intraperitoneal injection of kisspeptin-10 at a dose of 1 µg); 3, i.p. kisspeptin 10 (intraperitoneal injection of kisspeptin-10 at a dose of 10 µg); 4, i.p. kisspeptin 100 (intraperitoneal injection of kisspeptin-10 at a dose of 100 µg); 5, i.p. saline (intraperitoneal injection of 0.9% sodium chloride solution). Data are presented as M ± m. *p ≤ 0.05, difference between the kisspeptin-10 group and the intact group.

 

Тест «приподнятый крестообразный лабиринт»

Различий в количестве перебежек у группы в/б введения кисспептина-10 в дозировках 1 и 10 мкг, 0,9% раствора натрия хлорида и интактной группой обнаружено не было (табл. 4). При повышении дозировки до 100 мкг в/б наблюдалось значимое увеличение перебежек до 5,1±1,1 по сравнению с интактной группой. Следующими оцениваемыми показателями было время, проведенное в открытых рукавах и количество свешиваний с рукавов.

 

Таблица 4. Результаты поведенческого теста «приподнятый крестообразный лабиринт» после введения кисспептина-10

Table 4. Results of the elevated plus maze test following administration of kisspeptin-10

Показатель	Интактные	Физ. р. в/б	Кисспептин-10 в/б
			1 мкг	10 мкг	100 мкг
Количество перебежек между рукавами	2,22±0,32	2,4±0,3	2,33±0,4	2,67±0,5	5,1±1,1*
Время в открытых рукавах, с	15,1±2,1	12,44±2,26	12,56±2,30	11,44± 2,07	32,5±2,5*#
Количество свешиваний с рукава	1,7±0,2	2,0 ±0,23	1,6±0,23	1,5±0,24	4,4±0,5*#
Примечание. Физ. р. в/б — внутрибрюшинное введение 0,9% раствора натрия хлорида. Результаты исследования представлены в виде M±m; *р ≤0,05; #р ≤0,05 — различия между группами введений 0,9% раствора натрия хлорида и экспериментальной группы соответствующего введения.

 

При в/б введении кисспептина-10 статистически значимые изменения по обоим параметрам наблюдались только при максимальной дозировке, показав увеличение времени в открытых рукавах до 32,5±2,5 по сравнению с интактной группой (15,1±2,1 с) и с 1,7±0,2 у интактной группы по количеству свешиваний до 4,4±0,5. Остальные группы — 0,9% раствор натрия хлорида в/б, кисспептин в/б в дозе 1 и 10 мкг — статистически значимых изменений по сравнению с интактной группой не показал.

Тест «Открытое поле»

У группы животных после в/б введения 0,9% раствора натрия хлорида значимых различий с интактной группой ни по одному параметру обнаружено не было.

Поведение животных, которым вводили кисспептин-10 в дозах 1 и 10 мкг в/б значимо не изменялось ни по одному параметру (табл. 5). Введение 100 мкг в/б кисспептина-10 характеризуется значимым увеличением вертикальных стоек (p=0,0144), исследований норок (p=0,0005) и пересеченных квадратов (p=0,0019), по сравнению с интактными мышами. Остальные показатели (обнюхивание, стойка с упором, груминг и количество болюсов) значимых различий с интактными животными экспериментальные группы не показали.

 

Таблица 5. Результаты теста «открытое поле» после введения кисспептина-10

Table 5. Results of the open field test following administration of kisspeptin-10

Показатель	Интактные	Физ. р. в/б	Кисспептин-10 в/б
			1 мкк	10 мкг	100 мкг
Количество актов обнюхивания	32,89±3,21	40,89±8,36	30,56±4,25	38,67±4,16	35,67±6,2
Количество стоек с упором	3,88±0,96	3,22 ±0,49	2,7±0,52	2,22±0,49	2,56±0,50
Количество вертикальных стоек	1,55±0,24	2,22±0,40	1,44±0,24	3,11±0,51	1,22±0,14*
Количество исследованных норок	6,00±1,26	7,44±1,51	4,22±0,96	7,00±1,09	13,22±1,09*
Количество пересеченных квадратов	24,22±4,51	22,22±3,40	23,89±3,90	21,67±2,94	42,89±2,18*
Примечание. Физ. р. в/б — внутрибрюшинное введение 300 мкл 0,9% раствора натрия хлорида. Результаты исследования представлены в виде M±m. *p ≤0,05.

 

Таким образом, эмоционально-исследовательское и двигательное поведения после в/б введения кисспептина-10 изменялись значимо по сравнению с интактной группой только в максимальной дозировке 100 мкг.

Исследования действия окситоцина

По показателям количество перебежек между рукавами и время, проведенное в открытых рукавах, значимых различий установлено не было ни при одной дозировке в/б внутрибрюшинного введения окситоцина и 0,9% раствора натрия хлорида (табл. 6). Было выявлено различие при оценке показателя частоты свешиваний с рукавов. У группы мышей после в/б введения 300 мкл окситоцина 5 МЕ (9,10±0,83) количество свешиваний увеличивалось по сравнению с контрольной группой, не получавшей препарат и 0,9% раствор натрия хлорида (3,77±0,98, p=0,0019).

 

Таблица 6. Результаты анализа в тесте приподнятый крестообразный лабиринт после введения окситоцина

Table 6. Results of the elevated plus maze test following administration of oxytocin

Показатель	Интактные	Физ. р. в/б	Окситацин в/б
			20 мкл	300 мкл
Количество перебежек между рукавами	1,10±0,10	1,30±0,15	1,30±0,15	1,50±0,22
Время в открытых рукавах, с	5,67±1,96	6,40±1,78	5,50±1,94	10,50±2,76
Количество свешиваний с рукава	3,77±0,98	5,20±1,03	4,80±1,17	9,10±0,83**
Примечание. Физ. р. в/б — внутрибрюшинное введение 300 мкл 0,9% раствора натрия хлорида. **p <0,01; — сравнение группы введения физиологического раствора и экспериментальной группы.

 

Вторая методика, которой подвергались животные, — тест «светлая и темная камеры». Оценивали: время пребывания в светлой камере и количество переходов между светлой и темной камерами (табл. 7). По первому параметру различий между экспериментальной, контрольной и интактной группой не обнаружено. По второму показателю наблюдалось значимое увеличение количества переходов между камерами, что говорит о слабом анксиолитическом эффекте после в/б введения окситоцина (p=0,0058).

 

Таблица 7. Результаты анализа внутрибрюшинного введения галоперидола в разных дозах на поведение мышей в тесте «темная и светлая камеры»

Table 7. Effects of intraperitoneal administration of haloperidol at different doses on mouse behavior in the light–dark box test

Показатель	Интактные	Физ. р. в/б 20 мкл	Физ. р. в/б 300 мкл	Галоперидол в/б
				20 мкл	300 мкл
Время пребывания в светлой камере	100,40±15,29	82,10±12,22	82,10±12,22	82,10±12,22	84,30±12,24
Количество переходов между светлой и темной камерами	3,30±0,65	3,40±1,78	3,90±0,62	3,90±0,92	6,40±1,78*
Примечание. Физ. р. в/б 20 мкл, Физ. р. в/б 300 мкл — группы мышей после внутрибрюшинного введения 0,9% раствора натрия хлорида 20 и 300 мкл соответственно. *p ≤0,05 — сравнение контрольной и экспериментальной групп.

 

Исследования действия галоперидола

Поведенческий тест «поза лектора». При исследовании мышей, которые однократно получали 0,1, 0,5 и 1 мг/кг галоперидола в тесте «поза лектора», было установлено, что время пребывания животного в неподвижном состоянии при всех трех дозировках значимо увеличивалось при в/б введении, по сравнению с группой интактных животных и группой животных, которым вводили 0,9% раствор натрия хлорида во всех временных точках (табл. 8). Наблюдался дозозависимый эффект галоперидола при увеличении дозы с 0,1 до 1 мг/кг. Максимальное увеличение времени пребывания в позе лектора составило 119,50±0,27 с, что в 3,7 раза больше времени контрольной группы, что говорит о выраженном влиянии на мышей галоперидола после в/б введения (32±10,08 с).

 

Таблица 8. Результаты анализа внутрибрюшинного введения галоперидола в разных дозах на поведение мышей в тесте «поза лектора»

Table 8. Effects of intraperitoneal administration of haloperidol at different doses on mouse behavior in the lecturer’s posture test

Тест	Контроль, с	Физ. р. в/б, с	Галоперидол в/б, с
			0,1 мг/кг	0,5 мг/кг	1 мг/кг
30 мин	32±10,08	41,75±10,72	77,00±5,52*	101,40±3,29***	110,00±4,11***
60 мин	26±8,28	40,18±11,20	91,25±4,97**	112,90±0,67***	112,50±3,66***
120 мин	39±11,68	34,75±9,82	98,75±5,30***	114,0±1,63***	119,50±0,27***
Примечание. Физ. р. в/б — внутрибрюшинное введение 300 мкл 0,9% раствора натрия хлорида. *p ≤0,05; **p ≤0,01; ***p ≤0,001 — по сравнению с группой мышей, которым внутрибрюшинно вводили 0,9% раствор натрия хлорида.

 

Пол-тест. При минимальной дозировке при оценке параметра переворота значимого изменения эффекта обнаружено не было, в то время как при максимальной дозировке (1 мг/кг) наблюдалось наибольшее увеличение времени показателя у контрольной группы с 1,29±0,13 до 21,67±3,10 через 60 мин и с 1,31±0,15 до 34,00±4,57 через 120 мин. Статистически значимых различий между группой введения 0,9% раствора натрия хлорида и контрольной группой не установлено (табл. 9).

 

Таблица 9. Результаты анализа внутрибрюшинного введения галоперидола в дозах на поведение мышей в пол-тесте

Table 9. Effects of intraperitoneal administration of haloperidol at different doses on mouse behavior in the pole test

Тест	Контроль	Физ. р. в/б	Галоперидол в/б
			0,1 мг/кг	0,5 мг/кг	1 мг/кг
Переворот
30 мин	1,22±0,14	2,11±0,35	2,50±0,37	2,40± 0,61	7,67 ± 1,11
60 мин	1,29±0,13	2,11±0,35	2,00±0,46	7,37± 1,67*	21,67± 3,10***
120 мин	1,31±0,15	2,11±0,35	3,40±1,06	7,75± 1,11	34,00± 4,57***
Спуск
30 мин	7,05±0,70	6,77±0,52	7,40±0,65	12,61±0,96	10,33±1,20
60 мин	7,05±0,70	6,77±0,52	12,20±1,49	12,13±1,39	24,00±6,25**
120 мин	7,05±0,70	6,77±0,52	20,40±5,86	13,00±1,35	39,67±1,48 ***
Примечание. Физ. р. в/б — внутрибрюшинное введение 300 мкл 0,9% раствора натрия хлорида. *p ≤0,05, **p ≤0,01, ***p ≤0,001 — экспериментальная группа по сравнению с группой мышей, которым внутрибрюшинно вводили 0,9% раствор натрия хлорида.

 

При определении параметра «время cпуска» дозировка 1 мг/кг была наиболее эффективна, показав значимое увеличение времени для спуска в пол-тесте для в/б методов введения галоперидола (табл. 9). Наибольшие различия были установлены при введении дозировки 1 мг/кг по сравнению с группой введения 0,9% раствор натрия хлорида (p=0,0001). Можно сделать вывод, что в/б введение галоперидола сильно изменяло поведение мышей в поведенченских тестах, что говорит о достаточно высокой эффективности в/б введения галоперидола.

Поведенческий тест «открытое поле». При наблюдении за грызунами в тесте «открытое поле» выявлены характерные особенности изменения горизонтальной активности мышей в зависимости от временной точки и дозировки. Наибольшие различия фиксировали при пересечении квадратов животными, подвергшимися введению галоперидола в дозе 1 мг/кг, и животными контрольной группы (табл. 10). Горизонтальная активность после в/б введения через 60 мин значимо уменьшалась до 9,67±2,02 при дозировке 0,5 мг/кг и 6,87±2,11 при дозировке 1 мг/кг по сравнению с группой мышей после введения 0,9% раствора натрия хлорида (p=0,0001). Самая низкая дозировка понижала показатель, но незначимо, с 38,20±2,77 у группы введения 0,9% раствора натрия хлорида до 27,60±4,06. При определении показателя «стойка на задних лапах» было установлено стойкое понижение их числа на 60-й и 120-й минуте в средней и максимальной дозировке (p=0,001).

 

Таблица 10. Результаты анализа внутрибрюшинного введения галоперидола на поведение мышей в тесте «отрытое поле»

Table 10. Effects of intraperitoneal administration of haloperidol on mouse behavior in the open field test

Тест	Контроль	Физ. р. в/б	Галоперидол в/б
			0,1 мг/кг	0,5	1
Горизонтальная двигательная активность (количество пересеченных квадратов)
30 мин	47,00±1,60	38,20±2,77	27,60±4,06	14,25±2,74***	11,67±2,04***
60 мин	46,53±1,68	38,20±2,77	24,00±3,14	15,75±1,85***	3,00±0,92***
120 мин	49,10±1,97	38,20±2,77	16,00±3,36	9,67±2,02***	6,87±2,11***
Стойка на задних лапках (количество стоек)
30 мин	3,25±0,36	2,62±0,37	2,00±0,76	0,5±0,32	1,33±0,44
60 мин	3,25±0,36	2,62±0,37	1,30±0,30	0,5±0,18**	0,33±0,07***
120 мин	3,25±0,36	2,62±0,37	1,80±0,48	0***	0,33±0,07***
Норки (количество исследованных норок)
30 мин	6,00±0,50	4,00±0,64	3,80±0,77	1,75±0,16*	2,88±0,56
60 мин	6,00±0,50	4,00±0,64	2,25±0,36	1,50±0,56**	0,67±0,28***
120 мин	6,00±0,50	4,00±0,64	2,00±0,00	0 ***	0,44±0,28***
Примечание. Физ. р. в/б — внутрибрюшинное введение 300 мкл 0,9% раствора натрия хлорида. *p ≤0,05, **p ≤0,01, ***p ≤0,001 — экспериментальная группа по сравнению с группой мышей, которым внутрибрюшинно вводили 0,9% раствор натрия хлорида.

 

При определении параметра «норки» при средней дозировке в/б введение эффективно понижало дозу до 0,44±0,28 (p ≤0,001), по сравнению с группой введения 0,9% раствора натрия хлорида.

ОБСУЖДЕНИЕ

Обсуждение данных in silico и in vitro

Обобщив данные, полученные с помощью QSAR, наилучшая проходимость через ГЭБ по исследуемым параметрам наблюдается у галоперидола (табл. 11). Остальные соединения (кисспептин-10, 6-ГДА и окситоцин) показали слабые свойства по отношению к ГЭБ.

 

Таблица 11. Анализ физико-химических свойств исследуемых веществ, способствующих (+) и препятствующих (–) преодолению ГЭБ

Table 11. Analysis of physicochemical properties of the studied compounds that facilitate (+) or impede (–) blood–brain barrier penetration

Показатель	Вещество
	6-гидрокси-дофамина гидрохлорид	кисспептин-10	окситоцин	галоперидол
VDW	–	–	–	+
DEEP	+	–	–	–
MEP	–	+	–	–
MLP	–	–	–	+
HBACC	+	+	+	–
HBDON	–	+	+	–
PSA	–	–	–	+
logBB	–	–	–	+
logPтеор	–	–	–	+
logPпракт	–	–	–	+
logS	+	–	–	–
Способность проникать через ГЭБ	Низкая	Низкая	Низкая	Высокая

 

Растворимость в воде (logS) является важным фактором, влияющим на проницаемость ГЭБ, хотя и неопределяющим. Молекула должна обладать определенной растворимостью в воде, чтобы успешно проходить через водные поры и межклеточное пространство ГЭБ. Умеренной растворимостью обладает только 6-ГДА (–1,44), остальные исследуемые соединения практически нерастворимы: logS >0 — очень хорошо растворимо (>1 моль/л), logS от –1 до 0 — хорошо растворимо (0,1–1 моль/л). При значениях logS от –2 до –1 — вещество умеренно растворимо (0,01–0,1 моль/л), logS <–4 — практически нерастворимо (<0,0001 моль/л). Последним определяемым параметром был logBB — значение равное –0,3 или менее говорит о низкой способности проникать через ГЭБ [11]. Согласно полученным данным, наилучшим показателем обладает галоперидол (0,488), в то время как кисспептин-10 (–1,125), 6-ГДА (–0,790) и окситоцин (–0,904) имеют низкое значение, что говорит о плохой способности проникать через ГЭБ. Отдельного внимания заслуживает показатель logP. LogP является компонентом эмпрического правила Липински, которое позволяет оценить биодоступность химического соединения с определенным набором фармакологических и биологических активностей и иметь лекарственные свойства [12]. Правило гласит, что соединение, чтобы быть «подобным» лекарству, должно, во-первых, иметь менее пяти атомов-доноров водородной связи, вследствие того что большое количество доноров водородной связи связано с плохой проницаемостью мембраны за счет дополнительной энергии, необходимой для разрушения водородных связей при переходе из водной среды в липидную мембрану; во-вторых, иметь молекулярную массу менее 500, так как высокое значение молекулярной массы связано с плохой растворимостью и плохой проницаемостью через мембраны; в-третьих, липофильность logP должна быть менее 5. У соединений с высоким значением logP происходит увеличение нежелательных проявлений токсикологических свойств. В-четвертых, иметь суммарно не более 10 атомов азота и кислорода (грубая оценка количества акцепторов водородной связи). По данным анализа in silico было установлено, что самое маленькое значение практического logP у 6-ГДА. Чем ниже logP (значение –1 и более), тем гидрофильнее молекула, тем хуже проникает или практически не проникает через липидные мембраны ГЭБ. Низкое значение логарифма также у окситоцина (–0,69), у кисспептина-10 — близкое к нулю (0,27). Окситоцин и кисспептин могут плохо проникать через барьер, так как обладают невыраженными гидрофильными и липофильными свойствами. Наибольшее значение logP у галоперидола (3,70), что говорит о выраженных липофильных свойствах, способствующих хорошему проникновению через ГЭБ. Анализ logP в ходе физико-химического анализа с помощью спектрофотометрии показал наименьшее значение у 6-ГДА, как у самого гидрофильного соединения (–1,01), у окситоцина –0,816 и у кисспептина –0,79. Логарифмы, полученные в ходе спектрофотометрии, у кисспептина и окситоцина отличаются от полученных данных in silico, это объясняется тем, что при расчетах in silico учитываются молекулярные структуры веществ без учета многих параметров, которые могут влиять, например, на температуру раствора, pH и др. Спектрофотометрия учитывает эти факторы и является наиболее точной. Наибольшее значение практического логарифма как у самого липофильного соединения наблюдалось у галоперидола (–0,2). Однако оно меньше теоретического, что может быть связано с параметрами, которые ухудшают его проницаемость (высокая энергия поляризации, высокое количество доноров водородных связей и низкая растворимость в воде). Таким образом, данные анализа in silico и физико-химического метода согласуются и подтверждают высокую степень прохождения через ГЭБ у галоперидола и низкую у окситоцина, кисспептина-10 и 6-ГДА.

Обсуждение результатов фармакологического анализа в экспериментах на животных in vivo

6-ГДА. Изменение поведения мышей после введения 6-ГДА в/б методом оценивали по трем тестам: «открытое поле», «ротарод» и пол-тест. В тесте «открытое поле» по показателям: горизонтальная двигательная активность, принюхивание, стойка на стенку, стойка на задних лапах, исследование норок и количество болюсов, в тесте «ротарод» по времени удерживания и в пол-тесте по показателям времени переворота и спуска статистически значимых различий между экспериментальной группой, группой 0,9% раствора натрия хлорида и контролем установлено не было, что подтверждает данные in silico и физико-химический метод определения практического logP. 6-ГДА не обладает свойствами, способствующими прохождению через ГЭБ, поэтому в/б введенный фармакологический агент не попал в ЦНС и не оказал действия на поведение мышей.

Окситоцин. При исследовании поведения у животных в тесте «крестообразный лабиринт» по большинству показателей (количество перебежек между рукавами и время, проведенное в открытых рукавах) различий установлено не было ни при одной дозировке в/б введения окситоцина и 0,9% раствора натрия хлорида. Достоверное различие наблюдалось по одному из трех параметров — частоте свешиваний с рукавов. У группы мышей после в/б введения 300 мкл окситоцина 5 МЕ количество свешиваний увеличивалось в 2,4 раза по сравнению с контрольной группой, не получавшей препарат и 0,9% раствор натрия хлорида (p ≤0,05). Во втором поведенческом тесте время пребывания в светлой камере не изменялось ни у одной из групп, животные предпочитали проводить время в темной камере, но увеличивалось количество переходов между светлой и темной камерами, что говорит о повышении исследовательской активности и слабом анксиолитическом эффекте после в/б введения окситоцина (p ≤0,05). Таким образом, по двум тестам наблюдалось изменение по одному из нескольких параметров, что свидетельствует о небольших изменениях в поведении мышей после в/б введения, однако сила эффекта недостаточна. Грызуны предпочитают закрытые рукава, темные норы и имеют естественные страхи находиться на открытых площадках и упасть с высоты. В ходе исследования после в/б введения окситоцина мыши предпочитали закрытые рукава, но имели повышенную исследовательскую активность, что связано со слабым анксиолитическим действием окситоцина. Повышение исследовательской активности и уменьшение тревожности может быть связано с центральными и периферическими составляющими. Механизмы, с помощью которых окситоцин вызывает функциональный эффект, все еще являются предметом дискуссий, особенно с учетом того, что в дополнение к их прямому действию на мозг появляется все больше данных, предполагающих потенциальное влияние через другие периферически опосредованные пути. Поведение мышей изменялось незначительно.

Кисспептин-10. Во всех трех тестах («приподнятый крестообразный лабиринт», «открытое поле» и «половая мотивация») в/б введение кисспептина-10 в дозировках 1 и 10 мкг значимых различий не продемонстрировало. Вызывала различия только максимальная доза 100 мкг. В тесте «открытое поле» увеличивался показатель исследованных норок, количества пересеченных квадратов, вертикальных стоек по сравнению с интактными мышами (р ≤0,05). В тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» только максимальная дозировка вызывала увеличение времени проведения в открытых рукавах, количество свешиваний и перебежек между рукавами (р ≤0,05). Увеличение значений данных показателей опосредовано уменьшением тревожности и/или повышением исследовательской активности у группы мышей после в/б введения кисспептина-10. По остальным оцениваемым показателям — время в закрытых рукавах и число актов груминга — значимых различий между группами выявлено не было. В тесте половой мотивации кисспептин-10 усиливал один из параметров — уменьшение латентного периода. Таким образом, группа мышей после в/б введения вещества показала значимые различия в тесте по четырем показателям из восьми. В/б введение кисспептина-10 увеличивало показатели только в одной из трех дозировок — 100 мкг. Суммируя, можно предположить, что кисспептин-10 оказывал слабый поведенческий эффект, аналогично другим нейропептидам, модулирующим эмоциональное поведение животных [13, 15].

Галоперидол. Получены фундаментальные данные, сравнивающие фармакологическую активность галоперидола после в/б введения. Фармакологическая активность определялась по показателям в поведенческих тестах (пол-тест, «открытое поле» и «поза лектора») в трех временных точках — через 30, 60 и 120 мин. Во всех трех тестах наблюдались статистически значимые изменения показателей после введения галоперидола, по сравнению с контрольными группами. Наиболее чувствительным методом оказался тест «поза лектора», в котором наблюдалось увеличение эффекта во всех временных точках. В других тестах увеличение эффекта наблюдается с дозы 0,5 мг/кг, например, в пол-тесте при оценке показателя «время поворота», в открытом поле — при оценке показателей «горизонтальная активность» и «норки». Дозировка 0,1 мг/кг оказалось недостаточной в данных тестах для усиления эффекта. Оценивали также время проявления поведенческой активности при дозировках 0,1 и 0,5 мг/кг, которое наблюдалось в различных временных точках. Наиболее раннее — в тестах «поза лектора» и «открытое поле» (горизонтальная двигательная активность и норки), а в пол-тесте и открытом поле (стойка на задних лапах) изменение активности происходило преимущественно на 60-й и 120-й минутах. Таким образом, данные, полученные in silico и in vitro, согласуются с данными, полученными после фармакологического исследования. Галоперидол проникал через ГЭБ и снижал двигательную и исследовательскую активность.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В исследованиях in silico анализировали физико-химические свойства соединений различной химической природы (6-ГДА, галоперидол, окситоцин и кисспептин-10), в ходе которых установлено, что 6-ГДА, окситоцин и кисспептин-10 являются веществами, плохо проникающими через ГЭБ, в то время как галоперидол обладает высокой проходимостью. С помощью метода УФ-спектрофотометрии также оценивали коэффициент липофильности (logP) данных соединений. Наиболее высокие значения logP наблюдались у галоперидола по сравнению с окситоцином, кисспептином-10 и 6-ГДА.

При фармакологическом анализе исследуемых соединений показано соответствие между расчетными показателями проницаемости ГЭБ, оцениваемыми методами in silico и in vitro, и данными, полученными в экспериментах in vivo. Периферическое введение 6-ГДА, соединения с отрицательным logP, не влияло на поведение животных ни в одном из проведенных тестов («ротарод», пол-тест, «открытое поле»). Окситоцин и кисспептин-10 оказывали незначительное влияние на поведение, изменяя только некоторые показатели, в то время как поведенческие изменения при периферическом введении галоперидола были наиболее выражены.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о возможности использования показателей (предикторов и logP), рассчитанных методами in silico и in vitro, для прогнозирования проходимости ГЭБ соединениями различной химической природы.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. М.В. Литвинова, М.А. Андреев, В.В. Ильин, А.А. Лебедев, Е.Р. Бычков — проведение экспериментов, написание черновика рукописи, пересмотр и редактирование рукописи написание и редактирование текста статьи. Авторы одобрили версию для публикации, а также согласились нести ответственность за все аспекты работы, гарантируя надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой ее части.

Этическая экспертиза. Исследование одобрено локальным этическим комитетом ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» (протокол № 4/24 от 24.10.2024).

Источник финансирования. Исследование выполнено в рамках государственного задания Минобрнауки России FGWG-2025-0020 на 2025–2027 гг. «Поиск молекулярных мишеней для фармакологического воздействия при аддиктивных и нейроэндокринных нарушениях с целью создания новых фармакологически активных веществ, действующих на рецепторы ЦНС».

Раскрытие интересов. Авторы заявляют об отсутствии отношений, деятельности и интересов за последние три года, связанных с третьими лицами (коммерческими и некоммерческими), интересы которых могут быть затронуты содержанием статьи.

Оригинальность. При создании настоящей работы авторы не использовали ранее опубликованные сведения (текст, иллюстрации, данные).

Доступ к данным. Все данные, полученные в настоящем исследовании, доступны в статье.

Генеративный искусственный интеллект. При создании настоящей статьи технологии генеративного искусственного интеллекта не использовали.

Рассмотрение и рецензирование. Настоящая работа подана в журнал в инициативном порядке и рассмотрена по обычной процедуре. В рецензировании участвовали один внешний рецензент, член редакционной коллегии и научный редактор издания.

ADDITIONAL INFO

Author contributions: M.V. Litvinova, M.A. Andreev, V.V. Ilyin, A.A. Lebedev, E.R. Bychkov: investigation, writing—original draft, writing—review & editing. All the authors approved the version of the manuscript to be published and agreed to be accountable for all aspects of the work, ensuring that questions related to the accuracy or integrity of any part of the work are appropriately investigated and resolved.

Ethics approval: The study was approved by the Local Ethics Committee of the Institute of Experimental Medicine (Protocol No. 4/24 dated 24 October 2024).

Funding sources: This study was conducted as part of State Assignment of the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation FGWG 2025-0020 (2025–2027): Identification of Molecular Targets for Pharmacological Intervention in Addictive and Neuroendocrine Disorders Aimed at Developing Novel Pharmacologically Active Compounds Acting on Central Nervous System Receptors.

Disclosure of interests: The authors have no relationships, activities, or interests for the last three years related to for-profit or not-for-profit third parties whose interests may be affected by the content of the article.

Statement of originality: No previously obtained or published material (text or data) was used in this study or article.

Data availability: All data obtained in this study are available in this article.

Generative artificial intelligence: No generative artificial intelligence technologies were used to prepare this article.

Provenance and peer-review: This paper was submitted unsolicited and reviewed following the standard procedure. The peer review process involved one external reviewer, a member of the Editorial Council, and the in-house science editor.

About the authors

Mariya V. Litvinova

Institute of Experimental Medicine

Author for correspondence.
Email: litvinova-masha@bk.ru
ORCID iD: 0000-0002-2924-7475
SPIN-code: 9548-4683
Russian Federation, Saint Petersburg

Makar A. Andreev

Saint Petersburg National Research University of Information Technologies, Mechanics and Optics

Email: makariy.andreev@gmail.com
ORCID iD: 0009-0004-4908-2614
SPIN-code: 3152-7118
Russian Federation, Saint Petersburg

Viсtor V. Iljin

Institute of Experimental Medicine

Email: victor.iljin@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1012-7561
SPIN-code: 5559-8089

Cand. Sci. (Chemistry)

Russian Federation, Saint Petersburg

Andrei A. Lebedev

Institute of Experimental Medicine

Email: aalebedev-iem@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0003-0297-0425
SPIN-code: 4998-5204

Dr. Sci. (Biology), Professor

Russian Federation, Saint Petersburg

Eugenii R. Bychkov

Institute of Experimental Medicine; Kirov Military Medical Academy

Email: bychkov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8911-6805
SPIN-code: 9408-0799

MD, Dr. Sci. (Medicine)

Russian Federation, Saint Petersburg; Saint Petersburg

References