Behavioral analysis of anxiolytic action of phenazepam in conditions of an acute psychogenic stress (predator presentation) in Danio rerio

Andrei A. Lebedev; Лебедев Андрей Андреевич; Aleksandr S. Devyashin; Девяшин Александр Сергеевич; Aleksandra A. Blazhenko; Блаженко Александра Александровна; Sergei V. Kazakov; Казаков Сергей Владимирович; Viktor A. Lebedev; Лебедев Виктор Андреевич; Eugenii R. Bychkov; Бычков Евгений Рудольфович; Petr D. Shabanov; Шабанов Петр Дмитриевич

doi:10.17816/RCF19171-78

Behavioral analysis of anxiolytic action of phenazepam in conditions of an acute psychogenic stress (predator presentation) in Danio rerio

Authors: Lebedev A.A.¹, Devyashin A.S.¹, Blazhenko A.A.¹, Kazakov S.V.¹, Lebedev V.A.¹, Bychkov E.R.¹, Shabanov P.D.¹
Affiliations:
1. Institute of Experimental Medicine
Issue: Vol 19, No 1 (2021)
Pages: 71-78
Section: Original articles
URL: https://journals.eco-vector.com/RCF/article/view/70641
DOI: https://doi.org/10.17816/RCF19171-78
ID: 70641

Cite item

Full Text

Open Access
Restricted Access

Access granted
Restricted Access

Subscription or Fee Access

Abstract
Full Text
About the authors
References
Statistics

Abstract

We studied the effect of benzodiazepine anxiolytic phenazepam after the predator presentation to Danio rerio. The test of novelty was used: the fish was placed first in a beaker with a dissolved pharmacological substance (or H₂O) and then into a novel tank for 6 min, where the trajectory, the path length, the number of movements to the upper part of the novel tank, the number and time of the pattern of “freezing” were measured. It is shown that, in response to the novelty of tank, the fish are reacted by submerging to the bottom, increasing the frizing, and reducing the number of movements to the upper half of the novel tank. After phenazepam administration, the fish were not only in the lower, but also in the upper part of the novel tank. The average path length did not change significantly in the range of doses used. The number and time of the frizing, as well as the time spent in the lower part of the novel tank, decreased more than 2 times compared to the control group of animals and showed a dose-dependent effect. The number of movements to the upper part of the novel tank for the experiment increased significantly from 1 in the control to 57 after phenazepam in a dose of 1 mg/l. At the same time, the number of movements of fish to the upper part of the novel tank significantly increased more than 2 times from 3^th min of the experiment with the use of phenazepam in a dose of 1 mg/l. Predator presentation (Hypsophrys nicaraguensis) caused an increase in the number of freezing (temporary immobilization) and a decrease in the length of the trajectory of movement in the novel tank as compared with the Danio rerio control group. Phenazapam at a dose of 1 mg/l removed the effects of a predator, while exhibiting a typical effect: the number of movements to the upper part of the tank during the experiment significantly increased to 30; the time at the bottom of the tank was halved. It was concluded that the novelty stress test and the test with a predator are highly sensitive for studying anxiety-phobic reactions in Danio rerio.

Keywords

Danio rerio, predator, phenazepam, anxiety, fear, anxiolytics

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Взаимодействия хищника и жертвы — одна из наиболее адекватных моделей естественного психогенного стресса, включающие как уникальные, так и общие характеристики. Такие взаимодействия происходят в нескольких направлениях (от жертвы к хищнику, от хищника к жертве). Жертва может получить информацию от хищника с помощью сигналов: визуальных, обонятельных, акустических и вибрационных. В литературе есть достаточно обширная информация об этих типах восприятия у рыб в ответ на присутствие хищника [4, 13]. Различные комбинации этих сигналов от хищника вызывают тревожно-фобические реакции [9]. Вместе с тем в настоящее время ощущается явный недостаток данных по фармакологическому анализу эффектов предъявления хищника Danio rerio.

Исследования поведения Danio rerio (zebrafish) применяются в современной нейрофармакологии [7, 11, 16]. Активное плавание, адаптация к новой обстановке, короткий репродуктивный период, высокая плодовитость и низкая себестоимость дают возможность использовать Danio rerio в качестве животных моделей для лабораторных исследований [18]. В частности, было исследовано поведение Danio rerio после применения анксиолитиков и анксиогенов [1, 19, 20], что коррелировало с уровнем кортизола в крови [10]. Поведенческие эффекты у Danio rerio показаны также после применения этанола [11, 12], никотина [14], морфина [8], фенамина [17], бензодиазепинов [6] и кокаина [16]. В последние годы для регистрации поведения Danio rerio применяют компьютерный анализ видеотрека, что в свою очередь позволяет более детально, с высокой точностью изучить эффекты фармакологических веществ [11].

Целью настоящей работы было проведение фармакологического анализа действия анксиолитиков бензодиазепинового ряда на примере феназепама у Danio rerio после предъявления хищника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выбор животных. В работе использованы 104 половозрелые рыбы Danio rerio (zebrafish) (Cyprinidae, Teleostei) фирмы «Аква Питер» возрастом 6–8 мес. (молодые половозрелые животные, жизненный цикл до 5 лет), выращенные в ФГБНУ «ИЭМ» — Danio rerio, дикий тип (wildtype). Для тестирования использовали интактных животных после двухнедельного периода адаптации к помещению и аквариумам водоизмещением 40 л по 20–30 животных в каждом. Температура воды 25–27 °C поддерживалась постоянно. Животных содержали в стандартных условиях светового режима 12/12 ч при температуре помещения 22 ± 2 °C, кормили дважды в день стандартным кормом (Tetramin tropical flakes).

Тест новизны. Для экспериментов оценки новизны применяли стандартный просмотровый аквариум, который используется для изучения тревожно-фобических реакций у Danio rerio [7]. Он имел водоизмещение 1,5 л, трапецевидную форму высотой 15 см и шириной 7 см. Длина аквариума в основании составляла 22 см, а в верхней части — 28 см. Такая конструкция аквариума позволяет минимизировать латеральные движения рыбки и свободно наблюдать за вертикальными и горизонтальными движениями. Поскольку данный поведенческий тест основывается главным образом на инстинкте поиска защиты от незнакомой обстановки погружением на дно [10], аквариум был разделен чертой на 2 равные части, верхнюю и нижнюю. Рыбка помещалась сначала в мерный стакан водоизмещением 200 мл с растворенным фармакологическим веществом (или Н₂О) на 5 мин, затем в предстартовый аквариум с водой (10 × 10 × 10 см) на 5 мин и далее в просмотровый аквариум на 6 мин, где регистрировались двигательная активность за опыт (длина трека рыбки), число переходов в верхнюю и нижнюю половины аквариума и время в них. Автоматически регистрировалось число и время паттернов «фризинг» (обездвиживание или «примерзание») за опыт, которые обычно наблюдаются в ответ на новизну и отражают уровень тревожности животного. Поведение регистрировалось автоматически с помощью системы Noldus EthoVision XT7, которая позволяет просмотреть видеотреки рыбки. Система позволяет снимать показания как в цифровом выражении, так и визуально контролировать видеотрек. Весь период наблюдения непрерывно регистрировался, при помощи программы шла запись траектории движения (см. рисунок).

Траектории движения Danio rerio на фоне действия феназепама и хищника: 1 — вода (контроль); 2 — феназепам 0,1 мг/л; 3 — феназепам 0,5 мг/л; 4 — феназепам 1 мг/л; 5 — предъявление хищника; 6 — феназепам 1 мг/л + хищник

Модель стресса с хищником. В экспериментах с хищником рыбку помещали сначала в мерный стакан водоизмещением 200 мл с растворенным фармакологическим веществом (или Н₂О) на 5 мин, затем в предстартовый аквариум с хищником Hypsophrys nicaraguensis (10 × 10 × 10 см) на 5 мин и далее в просмотровый аквариум, который обычно используется для оценки новизны стимула, на 6 мин.

Фармакологические вещества. Для фармакологического анализа использовали феназепам ОАО «Новосибхимфарм» 1 мг/мл. Феназепам растворяли в воде для аквариумов и применяли в трех дозах: 1) 0,1 мг на 1000 мл воды; 2) 0,5 мг на 1000 мл воды: 3) 1 мг на 1000 мл воды

Статистические методы анализа. Оценку статистической достоверности различий проводили при помощи пакета программ SPSS SigmaStat 3,0, Graph Pad Prism 6 с использованием однофакторного дисперсионного анализа. Для сравнения контрольной и экспериментальных групп использовали однофакторный дисперсионный анализ ANOVA. Из непараметрических критериев использовали критерий Краскела–Уоллиса для сравнения групп. Различия считали статистически значимыми при значении р < 0,05. Для представления полученных данных использовали такие показатели описательной статистики, как среднеарифметическое значение и ошибка среднего.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В процессе проведения экспериментов были установлены типичные поведенческие реакции на новизну (то есть на помещение животного в просмотровый аквариум). Как правило, рыба находилась в это время в нижней части просмотрового аквариума и совершала небольшие перемещения вдоль него (см. рисунок).

Средняя длина пути рыбы, который автоматически регистрировался по продолжительности трека, составляла 1205 ± 91,8 см. При этом часто наблюдался фризинг (примерзание, время полной неподвижности). Число и время паттерна «фризинг» автоматически регистрировались и составляли за опыт соответственно 68,2 ± 5,7 и 36,5 ± 4,5 с. Среднее время пребывания рыбы в нижней части аквариума составляло 351,0 ± 36,4 с (см. таблицу). Число перемещений рыбы в верхнюю часть просмотрового аквариума за опыт составляло 1,2 ± 0,8. На фоне введения феназепама были выявлены типичные для анксиолитика поведенческие реакции на новизну (то есть на помещение животного в просмотровый аквариум). Как правило, рыбы находились в это время не только в нижней части просмотрового аквариума, но часто заплывали и в верхнюю его часть (см. рисунок, 2–4). На фоне феназепама средняя длина пути рыбы существенно не изменялась в диапазоне использованных доз по сравнению с контрольной группой животных (см. таблицу). При этом так же, как и в контроле, наблюдался фризинг. Число и время паттерна «фризинг» достоверно снижались по сравнению с контрольной группой животных (р < 0,05) и проявляли дозозависимый эффект. Среднее время пребывания рыбы в нижней части аквариума также достоверно снижалось по сравнению с контрольной группой животных (р < 0,05) и составляло при введении 0,1, 0,5 и 1 мг/л соответственно 297,0 ± 37,6, 207,6 ± 52,2 и 142,8 ± 44,1, проявляя неизменно дозозависимый эффект (см. таблицу). Число перемещений рыбы в верхнюю часть просмотрового аквариума за опыт достоверно увеличивалось по сравнению с контрольной группой животных (р < 0,01) и составляло при введении 0,1, 0,5 и 1 мг/л соответственно 3,1 ± 1,1, 18,6 ± 4,3 и 57,0 ± 11,2.

Поведение Danio rerio после введения феназепама и предъявления хищника, M + m

Группа	Число фризингов, n	Время фризинга, с	Длина траектории, см	Время в нижней части аквариума, с	Число перемещений в верхнюю часть аквариума, n
Контроль (H₂O)	52,4 ± 8,1	36,5 ± 4,5	1205 ± 91	351,0 ± 36,4	1,2 ± 0,8
Феназепам 0,1 мг/л	52,4 ± 8,1	34,6 ± 3,9	1315 ± 88	297,0 ± 37,6	3,1 ± 1,1
Феназепам 0,5 мг/л	36,3 ± 7,5*	23,7 ± 6,2*	1256 ± 106	207,6 ± 52,2*	18,6 ± 4,3*
Феназепам 1 мг/л	29,7 ± 5,2*	17,3 ± 4,6*	1422 ± 91^#	142,8 ± 44,1*^#	57,0 ± 9,2**^##
Хищник	89,4 ± 9,6*	46,5 ± 4,8	931 ± 49*	355,6 ± 11,3	3 ± 0,3
Феназепам 1 мг/л + хищник	64,2 ± 14,3^#	31 ± 7,2	1120 ± 36	232,8 ± 27,1*^#	30,2 ± 1,6**^##

* p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,01 — относительно группы контроля (H₂O) в просмотровом аквариуме; ^#p ≤ 0,05; ^## p ≤ 0,01 — относительно показателей после предъявления хищника в просмотровом аквариуме.

Для исследования эффектов предъявления хищника у Danio rerio использовали наиболее эффективную дозу феназепама 1 мг/л, выявленную в предварительных экспериментах по фармакологическому анализу действия анксиолитика. После предъявления хищника животные полностью перемещались в нижнюю часть просмотрового аквариума (см. рисунок, 5). При этом число паттернов «фризинг» достоверно увеличивалось (р < 0,05) с 52,4 ± 8,1 до 89,4 ± 9,6, а длина траектории движения при этом снижалась (р < 0,05) с 1205 ± 91 до 931 ± 49 см по сравнению с контрольной группой (Н₂О). На фоне феназепама 1 мг/л число паттернов «фризинг» достоверно снижалось (р < 0,05) с 89,4 ± 9,6 до 64,2 ± 14,3, а длина траектории проявляла тенденцию к увеличению (с 931 ± 49 до 1120 ± 36 см) по сравнению с животными после предъявления хищника без введения транквилизатора (см. рисунок, 6). На фоне феназепама 1 мг/л также снижалось время в нижней части аквариума (р < 0,05) с 355,6 ± 11,3 до 232,8 ± 27 с и увеличивалось число перемещений в верхнюю часть аквариума (р < 0,05) с 3 ± 0,3 до 30,2 ± 1,6 по сравнению с животными после предъявления хищника без введения транквилизатора.

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Исследования, проведенные нами ранее, показали, что тест стресса новизны является весьма чувствительным для изучения тревожно-фобических реакций у Danio rerio. Показано также, что феназепам дозозависимо снижает по сравнению с контрольной группой рыб число и время фризинга, увеличивает число перемещений в верхнюю половину аквариума и время плавания в последней [2, 3]. Настоящие исследования подтвердили данные, что реакция на новизну помещения в просмотровый аквариум у Danio rerio (zebrafish) имеет типичную картину паттернов поведения. В ответ на незнакомую обстановку просмотрового аквариума рыба реагировала погружением на дно, фризингом (обездвиживанием или «примерзанием») и снижением двигательного поведения (см. рисунок). При этом часто наблюдался фризинг, число и время которого за опыт было достаточно велико, как и время пребывания рыбы в нижней части аквариума. Полученные результаты во многом согласуются с данными литературы [19, 20].

Настоящие исследования подтвердили полученные нами данные, что реакция на новизну помещения в просмотровый аквариум у Danio rerio имеет типичную картину паттернов поведения на фоне введения феназепама. При этом рыбы плавали после введения анксиолитика не только в нижней части просмотрового аквариума, но стали больше подниматься вверх (см. рисунок). Длина траектории рыбы после введения феназепама существенно не увеличивалась по сравнению с контрольной группой животных. Число и время паттерна «фризинг» после введения феназепама достоверно снижались по сравнению с контрольной группой животных и также проявляли дозозависимый эффект. Время пребывания рыбы в нижней части аквариума после введения феназепама значительно снижалось, особенно при использовании в дозе 0,5 и 1 мг/л (см. таблицу). Число перемещений рыбы в верхнюю часть просмотрового аквариума после введения феназепама достоверно увеличивалось по сравнению с контрольной группой животных, особенно при использовании в дозе 1 мг/л. Полученные результаты во многом согласуются с данными литературы. В частности, отмечается, что тестирование анксиолитиков применяется в ряде лабораторий для исследования противотревожного эффекта у Danio rerio, и рыбы показывают, как правило, типичную картину поведенческих паттернов [6].

Предъявление хищника вызывало у Danio rerio увеличение числа фризингов (временного обездвиживания) и снижение длины траектории движения по сравнению с контрольной группой животных. Феназапам в дозе 1 мг/л снимал эффекты от предъявления хищника, проявляя при этом типичное для него действие: число перемещений в верхнюю часть аквариума за опыт существенно увеличивалось до 30; в 2 раза снижалось время в нижней части аквариума (см. таблицу). Полученные результаты во многом согласуются с данными литературы. В частности, отмечается, что предъявление хищника вызывало у Danio rerio увеличение видоспецифических реакций на хищника, который встречается у данного вида в естественной природе, индийскую листовую рыбу (Nandus nandus), вызывая повышение частоты и числа прыжков, а также вибрирующие движения [5]. В наших исследованиях анализировали поведение Danio rerio не в ответ на хищника, а после его предъявления, в другом аквариуме. Поэтому мы не наблюдали увеличения числа прыжков, и рыбы проявляли повышенную тревожность в просмотровом аквариуме, выражающуюся в снижении локомоций и увеличении числа фризингов. Полученные данные говорят в пользу суммации анксиогенного эффекта новизны просмотрового аквариума (см. таблицу и рисунок, 1) и эффекта от предъявления хищника (см. таблицу и рисунок, 5) в виде еще большего увеличения числа фризингов и снижения локомоций. Это согласуется с данными литературы. При исследовании действия анксиолитиков бензодиазепинового ряда на примере диазепама показано, что он снижал уровень кортизола и тревожно-фобические реакции после действия хищника [15]. Данные о действии феназепама, отечественного препарата, на эффекты предъявления хищника в доступной литературе не отмечены.

Возникает вопрос, сходны ли механизмы, лежащие в основе наблюдаемых реакций страха у Danio rerio, с механизмами других позвоночных, включая человека. Вопрос, может ли наша модель с хищником отражать эффекты анксиолитических, анксиогенных и/или изменяющих страх веществ, также трудно решить на данном этапе, так как проведено еще мало исследований подобного рода. При использовании фармакологического подхода в работе с Danio rerio встают такие проблемы, как оптимизация способов доставки, адсорбции, распределения, метаболизма и секреции лекарственного средства. Становится понятным, что представленная модель с хищником не является в полной мере «моделью» какого-либо человеческого расстройства. Тем не менее результаты показывают, что рыбки Danio rerio — перспективный инструмент, с помощью которого можно изучать механизмы реакции страха у позвоночных. Таким образом, мы рассматриваем полученные результаты с хищником как только первые шаги в нужном направлении, к исследованию и моделированию повышенной тревожности и страха у человека.

ВЫВОДЫ

Предъявление хищника Hypsophrys nicaraguensis вызывает у Danio rerio увеличение числа паттернов «фризинг» (временного обездвиживания) и снижение длины траектории движения в просмотровом аквариуме для оценки новизны.
Феназепам в дозе 1 мг/л снимает эффекты от предъявления хищника Hypsophrys nicaraguensis у Danio rerio, проявляя при этом типичное для него действие: число перемещений в верхнюю часть аквариума за опыт существенно увеличивается и снижается время в нижней части просмотрового аквариума для оценки новизны.
Тест стресса новизны и тест с хищником обладают высокой чувствительностью для изучения тревожно-фобических реакций у Danio rerio.

About the authors