Flavonoids through the eyes of a pharmacologist. Antioxidant and anti-inflammatory activities

Abstract

Review discusses the mechanisms of antioxidant and anti-inflammatory actions of flavonoids. In discussing the antioxidant effect detail the mechanisms of scavenging of reactive oxygen species, the chelation of transition metals, the activation of antioxidant enzymes. In consideration of anti-inflammatory action emphasis on the effects of flavonoids on the activity of the transcription factors and pathways involved in the formation of the inflammatory response.

Full Text

Интерес к флавоноидам как к антиоксидантным средствам возник в середине 90-х гг. и в значительной степени был обусловлен появлением такого пищевого феномена, как «французский парадокс», который позднее был распространен и на народы других средиземноморских стран [22]. Целый ряд эпидемиологических исследований показал, что у жителей этих стран, несмотря на потребление жирной пищи, зачастую невысокую физическую активность и распространенность курения, особенности питания прямо коррелируют с относительно невысоким процентом сердечно-сосудистых заболеваний и высокой продолжительностью жизни. Изучение диеты людей, населяющих эти страны, показало наличие в их рационе значительного количества разнообразных флавоноидных соединений, главным образом в овощах, фруктах, винограде и красном вине [29, 34, 50, 51, 70, 74]. В последние годы появились основания говорить об аналогичном «азиатском парадоксе», характерном для народов, населяющих Японию и другие страны Юго-Восточной Азии, который обусловлен потреблением рыбы и морепродуктов, а также ряда пищевых продуктов растительного происхождения, в первую очередь сои [66, 87]. При этом принято считать, что наибольшую роль в многообразном влиянии флавоноидов на организм человека играют их антиоксидантные свойства.

Многочисленные исследования, проведенные в основном in vitro, показывают, что флавоноиды могут быть отнесены к неферментным антиоксидантам, способным прямо или косвенно ослаблять или предупреждать клеточные повреждения, вызываемые свободными радикалами [70]. По предложению авторов цитированной работы, флавоноиды могут осуществлять свой антиоксидантный эффект с помощью следующих механизмов:

1. прямого скавенирования реактивных форм кислорода (РФК);
2. активации антиоксидантных ферментов организма;
3. хелатирования переходных металлов;
4. редукции альфа-токоферильных радикалов;
5. ингибирования оксидаз;
6. ослабления оксидативного стресса, вызываемого оксидом азота и реактивными формами азота (РФА);
7. повышения плазменного уровня мочевой кислоты;
8. усиления антиоксидантных свойств низкомолекулярных антиоксидантов.

Не отвергая всех перечисленных выше возможностей, остановимся, по нашему мнению, на основных.

Способность ряда флавоноидов «гасить» РФК связана с особенностями их химического строения и обусловлена необходимостью либо отдавать атом водорода, либо выступать в качестве доноров электрона. В результате этих реакций происходит нейтрализация биологической активности свободных радикалов. Сами же антиоксиданты, отдав атом водорода или электрон, приобретают радикальные свойства. Правда, образовавшиеся при этом радикальные молекулы значительно более стабильны в сравнении с нейтрализуемыми радикалами, что делает их взаимодействие с субстратом маловероятным [8, 56, 57]. Высказывается и иная точка зрения, согласно которой образующийся промежуточный феноксильный радикал не стабилен, и одной из особенностей этого соединения является способность к делокализации неспаренного электрона, то есть к его перемещению в ароматическое кольцо с образованием ряда резонансных структур. Так что образовавшийся радикал может реагировать с другими свободными радикалами [1]. Не исключено, что это обусловливает возникновение у ряда флавоноидов прооксидантных свойств. Существует мнение, согласно которому большое значение имеет механизм отдачи водорода, поскольку процесс переноса электрона требует привлечения более высокой энергии [59]. При этом способность скавенировать свободные радикалы во многом определяется количеством гидроксильных групп и их расположением в молекуле флавоноида. Учитывая изложенное, отметим, что принятый сегодня консенсус относительно связывания флавоноидами свободных радикалов впервые в виде гипотезы был предложен W. Bors et al. еще в 1990 г. [17] и впоследствии поддержан многими исследователями [20, 52, 54, 69, 70]. Выдвинутая гипотеза включает три основных момента, представленных на рис. 1.

Рис. 1. Основные мишени в молекуле флавоноидов, обеспечивающие связывание свободных радикалов, на примере химической структуры кверцетина (модификация J.B. Bubols et al., 2013)

Из рис. 1 следует следующее.

1. Гидроксильные группы 3΄и 4΄, связанные с кольцом В (катехольная структура), являются основной характеристикой флавоноидов, необходимой для «гашения» свободных радикалов. При этом гидроксильные группы именно у B-кольца, очевидно, играют наиболее значимую роль в скавенировании РФК, тогда как аналогичные заместители в кольцах A и С оказывают значительно меньшее антиоксидантное действие [13, 21, 82].
2. Двойная связь 2, 3 в конъюгации с 4-оксо-(кетоновой)-группой в кольце С обеспечивает делокализацию электрона от кольца В. Делокализация электронов ароматических колец, как известно, стабилизирует образующиеся радикалы (по-видимому, благодаря резонансу), когда флавоноид взаимодействует с РФК [20].
3. Гидроксильные группы, связанные с кольцами А и С в 3, 5 и 7-м положениях, вместе с 4-оксогруппой также повышают антиоксидантную активность флавоноидов, вероятно обеспечивая связывание водорода с оксогруппой [28, 70].

В экспериментах in vitro установлено, что именно те флавоноиды, которые обладают всеми отмеченными особенностями химической структуры, отличаются наибольшей способностью гасить свободные радикалы. К таким полифенолам относятся флавонолы кверцетин и мирицетин, а также флаван-3-олы эпикатехина галлат, эпигаллокатехин и особенно эпигаллокатехина галлат. При этом значительное участие в усилении антирадикальной активности принимает гидроксильная группа в положении 3, которая придает дополнительную активность флавонолам и флаван-3-олам [8].

В то же время можно считать установленным, что антиоксидантная активность присуща агликонам, но не гликозилированным или конъюгированным дериватам флавоноидов. По-видимому, такое различие обусловлено тем, что в процессе гликозилирования, глюкуронизации, сульфатирования и метилирования происходит замещение гидроксильных групп у ароматических колец, ответственных за взаимодействие со свободными радикалами, что, вероятно, снижает антиоксидантную активность [75].

Большое значение в механизме антиоксидантного действия флавоноидов имеет хелатирование металлов переменной валентности. Флавоноиды легко связывают ионы таких переходных металлов, как железо и медь, которые, инициируя перекисное окисление, способствуют образованию свободных радикалов. По мнению многих исследователей, хелатирование металлов является наиболее эффективным путем подавления процессов перекисного окисления флавоноидами [8].

Хорошо известно, что генерация супероксидного радикала происходит под влиянием металлсодержащих NАD(P)Н-зависимых оксидаз и цитоплазматической ксантиноксидазы, локализованных во многих клетках. При этом кислород может превращаться в супероксидный радикал по уравнению:

О2 + Fe2+ или Cu+ → + Fe3+ или Cu2+

Образовавшийся супероксидный радикал быстро дисмутирует с образованием перекиси водорода H2O2, которая, не будучи свободным радикалом, быстро превращается в самый реактивный из оксирадикалов — гидроксильный радикал HO· в соответствии с известной реакцией Фентона:

Fe2+ или Cu+ + H2O2 → Fe3+ или Cu2+ + OH‾ + HO·

Исходным материалом для этой же реакции служит избыток железа, превышающий количество Fe3+, находящееся в связанном состоянии с трансферрином, протеином, транспортирующим железо [39]. Кроме того, супероксидный радикал обеспечивает высвобождение Fe2+из ферритина и содержащих кластеры железо-сера дегидратаз путем редуцирования Fe3+, а также способен редуцировать железо или медь в реакции:

 + Fe3+ или Cu2+ → O2 + Fe2+ или Cu+,

поставляя редуцированные ионы переходных металлов для реагирования с H2O2 [20, 67].

Индуцируемый ионами переменной валентности оксидативный стресс ведет к массивному повреждению белков, липидов и особенно ядер клеток, где молекулы ДНК координатно связаны с различными переходными металлами. Это вызывает разделение нитей ДНК, повреждение нуклеотидов с последующей злокачественной трансформацией, генные мутации либо апоптоз. При этом наибольшее неблагоприятное воздействие производит инициируемое металлами образование гидроксильного радикала HO· [38, 40, 42, 64, 67, 68, 74].

Исходя из вышеизложенного, связывание переходных металлов, главным образом железа и меди, катализирующих образование свободных радикалов и за счет этого инициирующих оксидативный стресс, представляет собой важную антиоксидантную стратегию. Поэтому способность флавоноидов хелатировать металлы переменной валентности оказывается весьма важной.

Сегодня хорошо известно, что многие флавоноиды способны хелатировать переходные металлы, хотя этот механизм менее изучен, чем прямое скавенирование свободных радикалов. Несмотря на существенные различия в хелатирующей металлы активности, выявлен ряд общих молекулярных аспектов рассматриваемого эффекта [35, 67]. Интересно, что в этих реакциях задействованы те же компоненты химической структуры (главным образом катехольная структура кольца B), что и при скавенировании свободных радикалов (рис. 2).

Рис. 2. Предположительные мишени в молекуле флавоноидов для взаимодействия с металлами переменной валентности (по Procházková D. et al., 2011). М — переходный металл

1. По-видимому, важную роль играют гидроксильные группы 3΄ и 4΄ в кольце B.
2. Отмечается значение гидроксильных групп в положениях 3 и 5 и 4-оксогруппы в кольце С [8, 35, 85].

В качестве доказательства приведенных закономерностей отметим, что при использовании циклической вольтметрии флавоноиды лютеолин и кверцетин, содержащие в молекуле катехольный фрагмент, оказались более мощными ингибиторами реакции Фентона, чем байцилеин и нарингенин, в структуре которых этот фрагмент отсутствует [26]. Ведущая роль в связывании железа катехольной группы у кольца B в сравнении с кольцом А была подтверждена и другими исследователями [14, 19, 43]. Роль гидроксилов в 3-м и 5-м положениях в комплексе с 4-оксогруппой в процессе хелатирования железа также была продемонстрирована в эксперименте [47]. Из изученных флавоноидов наибольшей способностью хелатировать металлы, по-видимому, обладает кверцетин. Это полифенольное соединение, как и его сульфоновые водорастворимые дериваты, оказалось способным образовывать комплексы не только с железом и медью, но и с другими металлами, в том числе с кадмием и хромом, что позволяет считать кверцетин не только антиоксидантом, но и потенциальным антидотом при интоксикации солями соответствующих металлов [27, 49, 70, 80]. Достаточно высокая антиоксидантная активность была обнаружена также при образовании металлокомплексов у рутина, катехина, нарингенина, морина и ряда других флавоноидов [8].

Другим механизмом, обеспечивающим благоприятное воздействие флавоноидов на течение оксидативного стресса, является повышение активности антиоксидантных ферментов, которые, как известно, представляют собой основной фактор защиты от электрофильных токсикантов. В многочисленных экспериментах in vitro показана способность этих растительных полифенолов активировать NАD(P)Н: хинон оксиредуктазу (NQO1), супероксиддисмутазу (SOD), каталазу (KAT), гемоксигеназу-1 (HO-1), а также три связанных с глутатионом фермента: глутатионпероксидазу (GPx), глутатионредуктазу (GR), глутатион-S-трансферазу (GST). Это обеспечивает наличие у флавоноидов непрямого антиоксидантного эффекта [41]. Такое действие было выявлено у представителей всех подклассов флавоноидов [35, 64, 135, 186]. Четкий антиоксидантный эффект в разнообразных клеточных культурах, экспрессирующих такие антиоксидантные ферменты, как GPx, GR, GST, SOD, KAT, был зафиксирован при использовании кверцетина, катехина, мирицетина, лютеолина, нарингенина, апигенина, тангеретина, генистеина, флавоноидов какао [18, 44, 46, 58, 63, 65].

Сегодня доминирует мнение, согласно которому стимуляция флавоноидами активности антиоксидантных ферментов обусловлена главным образом взаимодействием с таким транскрипционным фактором, как Nrf2. Редокс-чувствительная сигнальная система Keap1/Nrf2/ARE контролирует внутриклеточный гомеостаз через экспрессию генов иммунного ответа, апоптоза и клеточного цикла, обеспечивая участие в процессах воспаления, канцерогенеза и защиты от различных стрессовых воздействий, в том числе активных форм кислорода [2–6, 10, 12, 28, 33, 79, 84].

Через вовлечение этого сигнального пути происходит активация экспрессии генов антиоксидантных ферментов за счет взаимодействия транскрипционного фактора Nrf2 с цис-регуляторным антиоксидант-респонсивным элементом (ARE). Цистеиновые остатки, присутствующие в структуре Keap1, по-видимому, функционируют как редокс-сенсоры, а некоторые флавоноиды, возможно, могут химически модифицировать цистеиновые тиолы. Это облегчает диссоциацию Nrf2 от Keap1 и последующую его ядерную транслокацию [31, 41]. Попав в ядро, фактор Nrf2, как установлено, связывается с ARE в промоторном регионе многих генов, в том числе и кодирующих экспрессию антиоксидантных ферментов в некоторых типах клеток и тканей [5, 11, 15, 40, 62, 89]. В экспериментах на нокаутных по Nrf2 мышах была зафиксирована нарушенная индукция детоксицирующих ферментов и редокс-регулирующих протеинов [73].

В то же время нельзя не отметить, что одновременно многие флавоноиды обладают определенной прооксидантной активностью. Не исключено, что эта активность пропорциональна количеству гидроксильных групп в молекулах флавоноидов [23]. Именно наличие гидроксильных групп у ароматических колец, по-видимому, способствует повышенному образованию гидроксильного радикала из перекиси водорода через реакцию Фентона [70]. Кроме того, показано, что ряд флавоноидов способен редуцировать переходные металлы: Fe3+в Fe2+ и Cu2+ в Cu+, что, как известно, обеспечивает поставку редуцированных металлов для последующего взаимодействия с H2O2 [33, 68, 76]. Прооксидантные свойства были выявлены у байкалеина, эпигаллокатехина (EGC), эпигаллокатехина галлата (EGCG), кверцетина, морина, мирицетина, катехина и других флавоноидов [67, 71, 77, 88]. Интересно, что одни и те же флавоноиды могут проявлять как антиоксидантные, так и прооксидантные свойства, что, по-видимому, определяется используемой концентрацией и различными условиями окружающей среды [55, 67, 68, 70, 86, 88].

Как относиться к выявленным прооксидантным свойствам флавоноидов? Этот вопрос остается недостаточно изученным и весьма дискуссионным. При этом высказываемые мнения колеблются от необходимости относиться с осторожностью к использованию больших доз флавоноидов до довольно спокойного отношения к их прооксидантной активности [32, 53, 70]. Нельзя не отметить, что существует точка зрения, согласно которой небольшая степень оксидативного стресса, индуцируемая некоторыми флавоноидами, активирует антиоксидантную защиту организма путем стимулирования экспрессии антиоксидантных ферментов и таким образом усиливает процессы клеточной трансдукции и общей цитопротекции [7, 37, 70].

Противовоспалительное действие флавоноидов

Наряду с антиоксидантным действием противовоспалительная активность многих флавоноидов хорошо известна на протяжении многих лет. Более того, не вызывает сомнений, что отмеченные эффекты зачастую тесно связаны, поскольку имеют ряд общих патофизиологических механизмов [7]. В последние годы опубликован ряд серьезных монографий и статей обзорного характера, посвященных противовоспалительному действию флавоноидов [1, 8]. Поэтому, не углубляясь в детали, отметим лишь ряд существенных моментов, имеющих, на наш взгляд, большое значение, в контексте рассматриваемой проблемы.

Хорошо известно, что в ответ на повреждение ткани эндотелиальными клетками, лейкоцитами и макрофагами индуцируется высвобождение ряда провоспалительных факторов, которые запускают каскад тканевых реакций. Активируется хемотаксис, повышается проницаемость капилляров, формируется очаг воспаления, в пределах которого осуществляются фагоцитоз, лизис, апоптоз с последующим восстановлением разрушенной ткани. Важную роль в этом сложном каскаде реакций играют так называемые медиаторы воспаления, к которым относятся разнообразные провоспалительные хемокины и цитокины, такие как фактор некроза опухоли — альфа (TNF-α), интерлейкины-1, -6, -8 (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8), РФК, адгезивные молекулы эндотелия (ICAM-1, VCAM-1), интегрины и другие физиологически активные соединения. Эти медиаторы воспаления индуцируют адгезию лейкоцитов к эндотелиальным клеткам, высвобождение протеаз, образование метаболитов арахидоновой кислоты, активацию процесса свертывания крови. Особое значение при этом имеет внутриклеточная трансдукция с активацией факторов и путей транскрипции, таких как NF-κB, Keap1/Nrf2/ARE, MAPR-киназы, определяющих уровень экспрессии провоспалительных генов, обеспечивающих формирование воспалительной реакции [1, 8, 52].

NF-κB представляет собой гетеродимерный комплекс белков, которые находятся в цитоплазме и неактивны, будучи связанными со специфическим ингибиторным белком IκB. В условиях активации комплекса происходит фосфорилирование белка IκB с помощью специфических киназ IKK и последующей протеасомной деградации. Высвободившийся активный NF-κB поступает в ядро клетки, где связывается со специфической таргетной последовательностью ДНК, определяя процесс транскрипции контролируемых генов [2, 45, 86]. Сегодня ясно, что фактор NF-κB играет ключевую и многогранную роль в развитии воспалительной реакции. С одной стороны, будучи стимулированным рядом провоспалительных цитокинов, таких как TNF-α, ИЛ-6 и др., NF-κB активирует образование арахидоновой кислоты с последующим увеличением синтеза простагландинов, тромбоксанов, простациклинов и лейкотриенов — активных индукторов воспалительного процесса [8]. Следует подчеркнуть, что эффективность данного каскада обеспечивается активностью таких ферментов, как фосфолипаза А2, циклооксигеназа (ЦОГ) и липоксигеназа (ЛОГ), которые наряду с NF-κB служат многообещающими мишенями для действия флавоноидов. И действительно, показано, что целый ряд флавоноидов ингибирует указанные ферменты, нарушая образование эйкозаноидов и ослабляя тем самым развитие воспалительной реакции [1, 8, 25, 36, 52]. С другой стороны, установлено, что фактор транскрипции NF-κB таргетирует гены химокинов, цитокинов, иммунных рецепторов, молекул клеточной адгезии, инициирующие мощный провоспалительный эффект [81]. Поэтому способность флавоноидов ингибировать транскрипционный фактор NF-κB является одним из многообещающих подходов к объяснению механизма противовоспалительного действия этих растительных полифенолов.

Очевидно, нельзя не отметить и возможную роль в развитии воспаления уже упоминавшейся сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE, контролирующей состояние внутреннего гомеостаза посредством регулирования различных этапов клеточной пролиферации, дифференцировки и апоптоза [3, 9, 61]. Регуляторная роль указанной системы в отношении развития воспалительного процесса четко прослеживается в экспериментах на нокаутных по Nrf2 животных [6]. Не исключено, что противовоспалительное действие различных флавоноидов, в том числе флаванолов, флавонолов, изофлавонов, обусловлено активацией системы Keap/Nrf2/ARE [3, 79].

Подводя итоги обзора, отметим, что сегодня не вызывает сомнений благоприятное влияние пищевых флавоноидов на организм человека, обусловленное их высокой биологической активностью. В последние десятилетия установлено, что рассмотренными выше видами действия биологическая активность флавоноидов отнюдь не исчерпывается. Кроме антиоксидантного и противовоспалительного эффектов известны такие виды активности, как противоопухолевая, противоишемическая, антигипертензивная, противодиабетическая, противомикробная, противовирусная, антитромбогенная, эстрогенная, нейротропная и др. Это косвенно подтверждается огромным количеством эпидемиологических исследований, проведенных в последние годы. В то же время существует много проблем, препятствующих как целенаправленному клиническому применению флавоноидов, так и созданию на их основе индивидуальных высокоэффективных лекарственных препаратов. Первая из них определяется особенностями фармакокинетики флавоноидов. Подавляющее большинство выявленных видов фармакологической активности подтверждено в экспериментах in vitro, а достигнуть их адекватной концентрации в организме ввиду особенностей метаболизма удается далеко не всегда. К существенному же повышению дозировки большинство клиницистов относится с оправданной настороженностью по причине возможных и пока не установленных побочных эффектов. Кроме того, механизмы их фармакологического действия, учитывая современные подходы к требованиям доказательной медицины, нуждаются в дальнейшем углубленном комплексном изучении. И все же нам близок оптимистический взгляд на перспективу клинического применения флавоноидов, что, кроме выявленного многообразия биологической активности, обусловлено относительной дешевизной получения лекарственных препаратов и большой распространенностью этих пищевых полифенолов в окружающей нас, то есть близкой нам, природе.