Reactive changes of gastric mucosa and reduction of desacyl grelin in rat brain due to psychoemotional stress

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Выживание в чрезвычайных условиях часто сопровождается формированием пост травматического стрессового расстройства (ПТСР), как результата перенесенной острой психической травмы [1]. Последние часто рассматриваются как результат дисбаланса гормональных и пептидных систем, среди которых одна из ведущих — система грелина. В наших исследованиях показано, что антагонист рецепторов грелина [D-Lys3]-GHRP6 проявляет анксиолитическое действие и повышает содержание дезацилгрелина (ДАГ) после экспозиции крыс с питоном [2] и после их выращивания в условиях стресса социальной изоляции [3]. Данные подтверждают вовлечение системы грелина в регуляцию двигательного и эмоционального поведения при формировании ПТСР [2, 4].

Пептидный гормон грелин, открытый и описанный в 1999 г. [5], вырабатывается в слизистой оболочке желудка и кишечника, состоит из 28 аминокислот и включает три изоформы: ацилированный грелин, неацилированный (дезацилгрелин) и обестатин [6]. Грелин преимущественно синтезируется в желудке и секретируется в общий кровоток [7]. В желудке грелиновые ветви имеют тенденцию плотно располагаться в основании слизистых желез желудка и не имеют прямого контакта с желудочным содержимым. Грелиновые клетки располагаются по всей длине желудочно-кишечного тракта, где прямо связаны с содержимым кишечника. И грелин, и его рецепторы располагаются в периферических тканях, таких как яичники, кишечник, почки, легкие, сердце, островки поджелудочной железы [8–10]. В головном мозге рецепторы грелина представлены в гипоталамусе, гипофизе, зубчатой извилине гиппокампа, полях СА2 и СА3 гиппокампа, черной субстанции, вентральной тегментальной области, ядрах таламуса и дорсальном ядре шва [11].

Введение грелина вызывало потребление пищи и увеличение массы тела [12, 13]. Нокаутные мыши по гену рецептора грелина GHSR были не способны в той же степени реагировать на стресс, как интактные животные [14]. Возможный механизм взаимодействия грелиновой и кортиколибериновой систем может включать активацию гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы — одну из точек приложения грелина в мозге [15, 16]. Более того, введение грелина вызывало гипертрофию и пролиферацию кортикотропных клеток. Таким образом, возможная роль центрально-образованного грелина — это модуляция кортиколиберин-продуцирующих нейронов [17].

Реактивные изменения тканей слизистой оболочки желудка, подверженной глубоким эрозивным пост-стрессорным нарушениям [18] в экспериментальных моделях ПТСР ранее прицельно не исследовались. Между тем практика моделирования стресса для установления эффективности терапевтических воздействий предполагает целесообразность получения новых и информативных критериев оценки степени ее нарушения и терапевтического эффекта.

Цель исследования — установить реактивные изменения элементов внутренней части слизистой оболочки желудка и содержание ДАГ в структурах мозга в модели психогенного стресса.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты проведены на 22 самцах крыс Вистар, полученных из питомника лабораторных животных «Рапполово» (Ленинградская область). В каждом опыте все животные были разделены на экспериментальные группы в зависимости от модели экспериментального состояния и условий конкретного опыта. В каждой группе число животных лежало в интервале от 7 до 10. Животных содержали в условиях вивария в стандартных пластмассовых клетках при свободном доступе к воде и пище в условиях инвертированного света 8.00–20.00 при температуре 22 ± 2 °C.

Метод моделирования психической травмы. Под психической травмой понимается сильное, относительно краткое воздействие внешних отрицательных обстоятельств, приводящее к развитию негативных эмоциональных реакций типа страха, тревоги, ужаса, отчаяния и др., и формированию соматических нарушений (МКБ-10, 1993). Психическая травма моделировалась стрессирующим воздействием, суть которого состояла в переживании животным обстоятельств гибели партнера от действий хищника [1]. Применяли острую однократную психотравмирующую ситуацию. Группу крыс в количестве 10–15 животных помещали в террариум (размеры 1,2 × 0,7 × 1 м) к тигровому питону. Одно животное погибало в результате его пищевых потребностей, остальные крысы переживали ситуацию гибели партнера. После этого крыс забирали из террариума.

Биохимические исследования. Животных на 7-й день после экспозиции с питоном декапитировали, выделяли исследуемые структуры головного мозга (миндалину, гиппокамп и гипоталамус) и замораживали в жидком азоте для последующего биохимического исследования. Замороженные образцы подвергали гомогенизации при температуре жидкого азота с помощью криогенной мельницы Cryomill (Retsch, Германия). Гомогенизацию проводили в течение 3 мин после охлаждения до нужной температуры. Полученные гомогенаты суспендировали в стандартном забуференном фосфатном растворе (рН 7,4) с добавлением 0,5 % твин-20. Образцы гомогенатов структур головного мозга замораживали до дальнейшего исследования. Далее определяли содержание ДАГ с помощью высокочувствительного твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Были использованы системы Unacylated ghrelin (mouse, rat), Express enzyme immunoassay kit (SPI-BIO, Франция) с пределом чувствительности 1 пг/мл. Концентрацию белка в образцах определяли согласно традиционному методу Бредфорда.

Гистологические исследования. Исследовали гистологическое строение внутренней части слизистой оболочки желудка в ее кардиальном отделе у 2 групп половозрелых самцов крыс (по 5 животных массой 200–220 г): интактных и после острого однократного стрессирования. На 4-е сутки после экспозиции с питоном крыс подвергали декапитации, извлекали желудки, которые фиксировали в 10 % растворе формалина. В горизонтальных парафиновых срезах слизистой оболочки желудка, отступя 0,02 мм от области перехода пищевода в желудок, после окрашивания гематоксилином и эозином на площади 0,015 мм² раздельно подсчитывали высоту поверхностных и ямочных слизистых клеток (как обладающих разной степенью дифференцировки), высоту ямочной стромы, площади поверхностных, ямочных мукоцитов и стромы ямок, а также число погибших мукоцитов. Для уточнения дифференцировки эпителиальных клеток производили их окрашивание альциановым синим (Biovitrum, Россия). Морфометрию проводили с помощью программы Imagescope (Электронный анализ, Россия).

Статистические методы анализа. Для статистической обработки полученных биохимических данных применяли пакеты Stаstistica v. 6. Нормальность распределений оценивали при помощи критерия Колмогорова–Смирнова, значимость различий между группами — при помощи t-критерия Стьюдента либо U-критерия Манна–Уитни. Гистологические данные обработаны с использованием пакета статистической программы GraphPad PRISM 6.0 (США) и непараметрического критерия Манна–Уитни, определяемого после установления медианы, верхнего и нижнего квартилей.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В гистологических исследованиях у интактных крыс желудочные ямочки на протяжении среза, визуально, значительно не отличались по высоте и содержали узкий просвет. Ямочные мукоциты обладали признаками менее дифференцированных клеток, чем поверхностные, отличаясь между собой по высоте и площади (р < 0,0001). Среди мукоцитов определялись единичные погибшие элементы, содержащие гиперхромное сморщенное и иногда фрагментированное ядро, измененное по типу апоптоза. Жизнеспособные клетки содержали крупное овальное или округлое ядро с различимым ядрышком и небольшие участки скоплений секреторных включений слизи, расположенные вблизи поверхностной части хорошо развитой цитоплазмы (рис. 1, а). Над поверхностью эпителиального пласта окрашивалась тонкая непрерывная слизистая каемка. В строме ямочек располагались фибробласты и капилляры.

 

Рис. 1. Строение слизистой оболочки желудка у интактной крысы (а) и после эмоционального стресса (b). Окраска гематоксилином и эозином. Ок. ×10, об. ×40. Вставка — фрагмент среза слизистой оболочки, окрашенного альциановым синим

 

В результате краткосрочного переживания психогенного стресса рельеф поверхности слизистой оболочки на протяжении среза желудка становился неровным, просвет ямочек — более широким, а мукоциты — значительно меньшими по высоте и площади (рис. 1, b, табл. 1, 2). Наибольшую часть цитоплазмы мукоцитов занимали скопления слизистых включений; ширина слизистой каемки увеличилась. Ядро слизистых клеток стало мельче и более окрашенным, чем в контроле. В мукоидном эпителии резко возросло количество погибших клеток, часть которых, утратив связь с остальными клетками пласта, обнаруживалась на поверхности. Высота и площадь стромы ямочек значительно уменьшились. Строма слизистой оболочки (особенно) и эпителий (в меньшей степени) были диффузно инфильтрированы лимфоидными клетками.

 

Таблица 1. Линейные параметры элементов и число погибших мукоцитов в слизистой оболочке желудка в 0,015 мм² площади (25%/Me/75%) в эксперименте у крыс

Способ воздействия	Высота, мкм			Число погибших мукоцитов
	поверхностных мукоцитов	ямочных мукоцитов	ямочной стромы
Нет (интактные крысы)	9,5/11,7/13,9	6,1/7,7/9,3	60,2/72,6/85,0	11,6/18,0/24,4
Стресс	5,8/7,0/8,2*	5,9/7,5/8,6	23,8/41,9/60,0*	28,3/49,4/70,5*

^{* Различия с параметрами у интактных крыс значимы, р < 0,0001.}

 

С помощью высокочувствительного ИФА было выявлено содержание ДАГ во всех исследованных структурах головного мозга. Основные количественные данные представлены на рис. 2. У животных контрольной группы содержание ДАГ различалось в разных структурах головного мозга. Минимальное значение отмечено для гиппокампа. Концентрация ДАГ в миндалине оказалась в полтора, а в гипоталамусе — в 3 раза выше, чем в гиппокампе (р < 0,05). Психоэмоциональный стресс приводил к значительному снижению уровня ДАГ в миндалевидном теле, гиппокампе и гипоталамусе. По сравнению с контрольными данными концентрация ДАГ была снижена в 8–12 раз (р < 0,01). Значимых различий между структурами по концентрации ДАГ после стресса отмечено не было. Характерны приблизительно одинаковые концентрации ДАГ во всех группах крыс после стресса и во всех исследованных структурах, которые лежат в сравнительно узком интервале 0,015–0,020 нг/мг.

 

Таблица 2. Площадь элементов слизистой оболочки желудка (25%/Me/75%) в эксперименте у крыс

Способ воздействия	Площадь, мкм2
	поверхностных мукоцитов	ямочных мукоцитов	ямочной стромы
Нет (интактные крысы)	48,3/69,7/91,1	17,6/37,3/56,9	109,9/148,9/187,0
Стресс	25,1/35,8/45,5*	23,3/31,7/40,1	93,1/92,2/101,3*

^{* Различия с параметрами у интактных крыс значимы, р < 0,0001.}

 

Таким образом, в настоящей работе выявлено вовлечение системы грелина у животных с постстрессовым расстройством. Установлено, что переживание стресса гибели партнера выражается эрозивным воспалением слизистой оболочки желудка, гибелью многих слизистых клеток, а также усилением в жизнеспособных эпителиальных клетках продукции слизи. Между тем реактивные изменения тканей слизистой оболочки желудка, подверженной глубоким эрозивным постстрессорным нарушениям [18], в экспериментальных моделях ранее прицельно не исследовались. В то же время практика моделирования стресса [1] для установления эффективности терапевтических воздействий предполагает целесообразность получения новых и информативных критериев оценки степеней ее нарушения и терапевтического эффекта. В данной работе установлены реактивные изменения элементов внутренней части слизистой оболочки желудка в модели психогенного стресса.

 

Рис. 2. Концентрация дезацилгрелина в структурах головного мозга крыс после психоэмоционального стресса. 1,1 — амигдала, контрольная группа; 2,1 — амигдала, психоэмоциональнай стресс (экспозиция с питоном); 1,2 — гипоталамус, контрольная группа; 2,2 — гипоталамус, психоэмоциональнай стресс (экспозиция с питоном); 1,3 — гиппокамп, контрольная группа; 2,3 — гиппокамп, психоэмоциональнай стресс (экспозиция с питоном). * p ≤ 0,01 — различия между интактными и экспериментальными животными

 

С помощью высокочувствительного твердофазного ИФА был выявлен ДАГ в исследованных структурах мозга: миндалине, гиппокампе и гипоталамусе. Обращают на себя внимание большие различия в содержании ДАГ в разных структурах мозга в физиологических условиях (контрольная группа). В данной группе животных содержание ДАГ в образцах гипоталамуса оказалось достоверно выше в сравнении с концентрациями ДАГ в других структурах. Относительно высокие концентрации ДАГ в образцах гипоталамуса могут служить косвенным подтверждением данных о присутствии в ядрах гипоталамуса грелинсодержащих нейронов. Данный факт согласуется с данными иммуногистохимических исследований, где было показано наличие грелин-положительных нейронов в ядрах латерального гипоталамуса [8]. Выраженное многократное снижение уровня ДАГ после стресса предъявления хищника может свидетельствовать, что грелиновая система и ее составляющие компоненты активно участвуют в сигнальных стресс-зависимых нейронных сетях. Ответ грелиновой сигнальной системы на предъявление хищника отражается на лимбических (определяющих эмоциональный ответ) структурах головного мозга, в частности в гиппокампе, миндалине и гипоталамусе. Исследования последних лет показали ключевую роль грелина в физиологической реакции мозга на стресс, поскольку одна из возможных мишеней грелина в стрессорной реакции — это кортиколиберин-продуцирующие нейроны паравентрикулярного ядра гипоталамуса. Существует мнение о родстве между грелином и кортиколиберином, поскольку грелиновые рецепторы были найдены в паравентрикулярном ядре, основном источнике кортиколиберина, и в ядре Вестфаля–Эдингера (Якубовича), месте экспрессии урокортина [19]. В частности, был описан механизм, по которому грелин активирует кортиколибериновые нейроны у мышей. Периферическое или внутрижелудочковое введение грелина значительно потенцировало c-fos-маркер клеточной активации в котриколиберин-продуцирующих нейронах. Более того, центральное введение грелина вызывает гипертрофию и пролиферацию кортикотропных клеток [19]. Активация гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы — это возможный механизм, через который грелин регулирует некоторые физиологические процессы. Активация этой системы может быть важна, когда грелин играет роль защиты против депрессивных симптомов при хроническом стрессе. Показано, что грелин повышал экспрессию гена кортиколиберина в паравентрикулярном ядре гипоталамуса. Таким образом, возможная роль центрально образованного грелина — это модуляция кортиколиберин-продуцирующих нейронов [20]. Вероятно, сильное стрессорное воздействие приводит к подавлению грелиновой системы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Система грелина играет важную роль в механизмах стресса. Элементы данной системы целесообразно рассматривать прежде всего как молекулярные мишени фармакологического воздействия с целью коррекции постстрессорных расстройств. В желудке, который считается основным источником грелина, грелиновые ветви имеют тенденцию плотно располагаться в основании слизистых желез желудка. Краткосрочное переживание психогенного стресса в экспериментальной модели выражается эрозивным воспалением слизистой оболочки желудка, гибелью многих слизистых клеток, а также усилением в жизнеспособных эпителиальных клетках продукции слизи. Выраженное многократное снижение уровня ДАГ после стресса предъявления хищника может свидетельствовать, что грелиновая система и ее составляющие компоненты активно участвуют в сигнальных стресс-зависимых нейронных сетях. Ответ грелиновой сигнальной системы на предъявление хищника отражается на лимбических (определяющих эмоциональный ответ) структурах головного мозга, в частности, гиппокампе, миндалине и гипоталамусе. По-видимому, ДАГ представляет собой элемент грелиновой сигнальной системы, который активно реагирует на психоэмоциональный стресс, причем сходным образом в различных структурах мозга.

About the authors

Vladislava A. Raptanova

Institute of Experimental Medicine; St. Petersburg Medicо-Social Institute

Author for correspondence.
Email: vladislavaraptanova@yandex.ru

postgraduate student

Russian Federation, 12, Acad. Pavlov str., Saint Petersburg, 197376; Saint Petersburg

Andrei V. Droblenkov

Institute of Experimental Medicine; St. Petersburg Medicо-Social Institute

Email: droblenkov_a@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5155-1484
SPIN-code: 8929-8601

PhD, Dr. Sci. (Med.)

Russian Federation, 12, Acad. Pavlov str., Saint Petersburg, 197376; Saint Petersburg

Andrei A. Lebedev

Institute of Experimental Medicine

Email: aalebedev-iem@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0003-0297-0425
SPIN-code: 4998-5204

PhD, Dr. Sci. (Biol.), Professor

Russian Federation, 12, Acad. Pavlov str., Saint Petersburg, 197376

Pavel S. Bobkov

Institute of Experimental Medicine; St. Petersburg Medicо-Social Institute

Email: bobkov_pl@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4858-6170
SPIN-code: 2382-8246

PhD, Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation, 12, Acad. Pavlov str., Saint Petersburg, 197376; Saint Petersburg

Platon P. Khokhlov

Institute of Experimental Medicine

Email: platonkh@list.ru
ORCID iD: 0000-0001-6553-9267
SPIN-code: 8673-7417

PhD, Cand. Sci. (Biochemistry)

Russian Federation, 12, Acad. Pavlov str., Saint Petersburg, 197376

Ilia Y. Thyssen

Institute of Experimental Medicine

Email: iljatis@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8710-9580
SPIN-code: 9971-3496

PhD, Cand. Sci. (Biol.)

Russian Federation, 12, Acad. Pavlov str., Saint Petersburg, 197376

Anatoliy D. Lisovskiy

Institute of Experimental Medicine

Email: lisovskiy.t@mail.ru

postgraduate

Russian Federation, 12, Acad. Pavlov str., Saint Petersburg, 197376

Eugeny R. Bychkov

Institute of Experimental Medicine

Email: bychkov@mail.ru

PhD, Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation, 12, Acad. Pavlov str., Saint Petersburg, 197376

Petr D. Shabanov

Institute of Experimental Medicine

Email: pdshabanov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1464-1127
SPIN-code: 8974-7477

MD, PhD, Dr. Sci. (Med.), Professor

Russian Federation, 12, Acad. Pavlov str., Saint Petersburg, 197376

References