PROTECTIVE EFFECT OF AMINO ACIDS IN THE ORGANOTYPIC CULTURE OF THE ECTODERMAL GENESIS TISSUES AT THE CYCLOPHOSPHANE PRESENCE

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Исследование регуляторных механизмов многоклеточных систем дает возможность понять генез индивидуального развития организмов, механизмы дифференцировки и специализации клеток, принципы регуляции специализированных тканей и воспроизведения генетической информации. Регуляторные механизмы клеток возникли в процессе эволюции в результате ингибирующих биохимических реакций. Полагают, что такой континуум существовал у донервных организмов. В последующем филогенезе совокупность гуморальных регуляторов вступала в отношения с нервной регуляцией. Эти механизмы, очевидно, были ведущими в управлении ростом и развитием клеток до становления специальных регуляторных систем. В процессе формирования многоклеточных систем регуляторные механизмы координировали соотношение клеток различных популяций, контролировали дифференцировку, пролиферацию. Биорегуляторы, влияющие на процессы роста и развития, широко распространены в тканях многоклеточного организма. Таким образом, одним из наиболее приоритетных направлений в современной биологии и медицине является изучение механизмов регуляции многоклеточных систем и сложного равновесного состояния между двумя основными физиологическими процессами - пролиферацией и апоптозом, - которое возникает под влияни ем различных аминокислот и пептидов [1-3]. Была показана специфичность действия олигопептидов и аминокислот в отношении тканей с различным генезом. При построении дендрограммы, полученной путем кластерного анализа, выявлено, что одна из ветвей представлена тканями эктодермального генеза (нервная ткань, кожа), в которых стимуляция клеточной пролиферации происходит под влиянием гидрофобных аминокислот [4]. В последние десятилетия появились множественные данные о том, что кодируемые аминокислоты, представляющие собой структурные элементы белков и пептидов, сами обладают регуляторными свойствами в отношении тканей-мишеней [5-9]. Показано, что при понижении уровня экстрацеллюлярного глютамина клетки становились более чувствительными к Fas-опосредованному апоптозу [10]. По некоторым данным, глютамат-индуцированный апоптоз в этих клетках устраняется при предварительной инкубации культур (7 дней) с 0,5-2 мл лития (антибиполярное вещество) [11]. Имеются также данные о влиянии аргинина на процессы клеточной пролиферации и апоптоза. Добавление аргиназы (уменьшающей концентрацию аргинина за счет энзиматической деградации) в культуру нормальных клеток приводит к блоку клеточного цикла на стадии G0/G1, но через неделю клетки восстанавливаются. Однако в культуре злокачественных клеток наступает массивная клеточная гибель в течение 3-5 дней, при добавлении аргинина восстанавливается только менее 0,01% клеток [12]. Установлено, что после избыточного внутрибрюшинного введения крысам аргинина повышается не только его уровень в плазме крови, но и уровень аденозинтрифосфата в ткани поджелудочной железы, развиваются повреждения за счет активации митохондриального пути апоптоза [13]. При исследовании аминокислот с разветвленными боковыми цепями (валин, лейцин, изолейцин) только лейцин в концентрации 10-5-10-3 M вызывал в культуре гепатоцитов крыс усиление синтеза дезоксирибонуклеиновой кислоты и пролиферации. Кроме того, лейцин стимулировал S6-киназу 1 (S6K1), эукариотический фактор инициации (eIF4E) [14]. Имеются данные, что влияние аминокислот, особенно лейцина, может происходить при участии mammalian target of rapamycin, complex 1 (mTORC1) и, таким образом, при этом контролируются многие компоненты процесса трансляции, включая факторы инициации и элонгации [6, 15]. В ряде наших работ показано, что кодируемые аминокислоты влияют различным образом на основные клеточные процессы - пролиферацию и апоптоз - в зависимости от генеза ткани: экто-, энто- и мезодермального [2, 16-18]. В настоящее время в связи с процессами уничтожения химического оружия становятся актуальными задачи клинической токсикологии, связанные с поражением людей ипритом. Возникают проблемы хронического отравления его малыми дозами в течение длительного периода. Кроме того, широко применяющиеся в настоящее время в онкологии цитостатики имеют ряд побочных эффектов, требующих их устранения. Исходя из этого представляется важным исследовать регуляторные влияния на нервную ткань и кожу 20 кодируемых аминокислот и их сочетаний с целью определения протекторных свойств аминокислот при действии цитостатических агентов. Одним из ипритоподобных веществ является цитостатик циклофосфан (ЦФ), используемый также для моделирования резорбтивного действия иприта. Молекулярный механизм токсического действия ЦФ, как и иприта, связан с его алкилирующими свойствами и вследствие этого с его способностью вступать в связь с анионами фосфорных и карбоновых кислот, фенолов, а также с аминогруппами. Эти химические радикалы широко представлены в нуклеиновых кислотах, ферментах и структурных белках, их цитостатический эффект начинается уже в фазе G1 клетки и содействует торможению в фазе S. Целью настоящей работы было исследовать действие 20 кодируемых аминокислот и их сочетаний на развитие органотипической культуры фрагментов коры головного мозга и кожи крыс, а также их протекторное влияние в присутствии цитостатического агента - ЦФ. ОРГАНОТИПИЧЕСКОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ТКАНЕЙ Наиболее адекватный метод для быстрой количественной оценки направленности влияния исследуемых биологически активных веществ - органотипическое культивирование фрагментов тканей и анализ зоны роста эксплантатов [3, 16, 17]. Органотипическое культивирование позволяет произвести быструю скрининговую оценку биологической активности изучаемого вещества. Это связано с тем, что изменение количества клеток является результатом стимуляции или ингибирования клеточной пролиферации и служит критерием первичной интегральной оценки биологической активности веществ. Преимущество рассматриваемого метода состоит в том, что в эксплантатах сохраняется такая же иерархическая соподчиненность клеточного состава ткани, как и в целостном организме. В органотипической культуре возможно строго дозированное воздействие непосредственно на клетки исследуемыми препаратами. При этом исключаются действующие в целостном организме нервные, гормональные и другие влияния. Исходным материалом для культивирования служит ткань от различных животных. Изменение количества пролиферирующих клеток в зоне роста может служить критерием первичной интегральной оценки биологической активности исследуемого вещества и быть основанием для поиска других его эффектов. Классической тест-системой является органотипическая культура различных тканей крыс. В данной работе органотипическое культивирование тканей проводили, используя 1100 эксплантатов коры головного мозга и 950 эксплантатов кожи 3-месячных самцов крыс линии Вистар. Отпрепарированные в стерильных условиях фрагменты кожи разделяли на более мелкие части величиной около 1 мм3, которые помещали в чашки Петри с коллагеновым покрытием дна. Питательная среда состояла на 35% из среды Игла, 35% - раствора Хенкса, 25% - фетальной телячьей сыворотки. В среду добавляли глюкозу (0,6%), инсулин (0,5 ед./мл), гентамицин (100 ед./мл). Использованы L-аминокислоты (фирма «Sigma», США) - глицин (Gly), аланин (Ala), аспарагин (Asn), гистидин (His), лизин (Lys), серин (Ser), глютамин (Gln), аргинин (Arg), пролин (Pro), аспарагиновая (Asp) и глутаминовая (Glu) кислоты, тирозин (Tyr), цистеин (Cys), валин (Val), треонин (Thr), метионин (Met), лейцин (Leu), изолейцин (Ile), фенилаланин (Phe), триптофан (Trp). Для выявления эффективных концентраций исследуемые препараты вводились в культуральную среду экспериментальных чашек Петри в различных концентрациях - 0,01-0,05 нг/мл. При раститровке аминокислот от 0,01 до 100 нг/мл было обнаружено, что аминокислоты обладают максимальной стимулирующей пролиферацию активностью при концентрации 0,05 нг/мл, т. е. эта концентрация является эффективной. В чашки Петри с экспериментальными эксплантататами добавляли 3 мл питательной среды с исследуемой концентрацией препаратов, в чашки Петри с контрольными эксплантатами - 3 мл питательной среды без добавления препаратов. Таким образом, эксплантаты экспериментальной и контрольной групп развивались в одинаковых объемах питательной среды. Чашки Петри помещали в термостат при температуре 37 оС в условиях постоянного поступления 5% СО2 и через 3 сут просматривали под фазовоконтрастным микроскопом. Определяли индекс площади (ИП), который рассчитывали в условных единицах как соотношение площади всего эксплантата (вместе с зоной выселяющихся клеток) и площади центральной зоны эксплантата. С целью визуализации эксплантатов применяли микротеленасадку для микроскопа (серия 10, «МТН-13» фирмы «Альфа-Телеком», Россия). Для расчета ИП эксплантатов использовали программу PhotoM 1.2. В 1-е сут культивирования происходило распластывание эксплантатов на коллагеновой подложке, выселение пролиферирующих и мигрирующих специализированных клеток (глиоцитов, эпителиоцитов), фибробластов, составляющих зону роста от края эксплантата. Через 3 сут, если в эксперименте наблюдалась стимуляция развития зоны роста в результате клеточной пролиферации, ИП экспериментальных эксплантатов увеличивался по сравнению с ИП контрольных эксплантатов. В случаях угнетения зоны роста ИП эксплантатов понижался по сравнению с контрольными значениями. При исследовании эксплантатов коры головного мозга было выявлено, что стимулирующим статистически достоверным влиянием на ИП обладали гистидин - ИП выше на 42 ± 5% (n = 20, p < 0,05) по сравнению с контролем (n = 21), а также все гидрофобные аминокислоты: валин - ИП выше на 55 ± 9% (n = 23, p < 0,05) по сравнению с контролем (n = 20), аспарагиновая кислота - ИП выше на 56 ± 13% (n = 24, p < 0,05) по сравнению с контролем (n = 23), треонин - ИП выше на 41 ± 7% (n = 25, p < 0,05) по сравнению с контролем (n = 24), метионин - ИП выше на 57 ± 11% (n = 20, p < 0,05) по сравнению с контролем (n = 22), лейцин - ИП выше на 24 ± 3% (n = 20, p < 0,05) по сравнению с контролем (n = 21), изолейцин - ИП выше на 41 ± 5% (n = 20, p < 0,05) по сравнению с контролем (n = 21). Ингибирующее статистически достоверное действие на ИП эксплантатов выявилось у тирозина - ИП ниже на 20 ± 4% (n = 19, p < 0,05) по сравнению с контролем (n = 21), глицина - ИП ниже на 31 ± 13% (n = 25, p < 0,05) по сравнению с контролем (n = 24), пролина - ниже на 22 ± 4% (n = 20, p < 0,05) по сравнению с контролем (n = 20), триптофана - ИП ниже на 22 ± 4% (n = 23, p < 0,05) по сравнению с контролем (n = 21). При действии остальных исследованных аминокислот ИП оставался на уровне контрольных значений (табл. 1). В культуре ткани кожи крыс при действии аминокислот стимулирующее клеточную пролиферацию влияние выявлено у 5 аминокислот. При введении в культуральную среду глутаминовой кислоты ИП увеличивался на 29 ± 1% (n = 24, р < 0,05) по сравнению с контролем (n = 22), при действии лизина - на 30 ± 3% (n = 22, р < 0,05) по сравнению с контролем (n = 21), под влиянием аргинина - на 30 ± 3% (n = 25, р < 0,05) по сравнению с контролем (n = 23), при действии пролина - на 21 ± 1% (n = 21, р < 0,05) по сравнению с контролем (n = 24), при действии триптофана - на 18 ± 4% (n = 20, р < 0,05) по сравнению с контролем (n = 23), при действии тирозина отмечалось увеличение на 19 ± 3% (n = 21, р < 0,05) по сравнению с контролем (n = 24), а при действии лейцина наблюдалось уменьшение ИП на 15% (n = 21) по сравнению с контролем (n = 22). При действии остальных исследованных аминокислот ИП оставался на уровне контрольных значений (см. табл. 1). Ранее нами было показано, что эффективными дипептидами являются те соединения, в которых одна аминокислота стимулирует клеточную пролиферацию в данной ткани, а другая угнетает ее [1, 4]. Таблица 1 Изменение ИП (%) по отношению к контролю при введении в культуру ткани кожи, коры головного мозга аминокислот в эффективных концентрациях Аминокислота Кора головного мозга Кожа Gly -31 ± 7* +2 ± 1 Ala -3 ± 1 -3 ± 2 Asn +7 ± 3 -13 ± 3 His +42 ± 7* +12 ± 5 Lys -7 ± 2 +30 ± 3* Ser +2 ± 1 +4 ± 3 Gln -5 ± 2 -7 ± 5 Arg +1 ± 1 +30 ± 3* Pro -22 ± 3* +21 ± 1* Glu -5 ± 1 +29 ± 1* Asp +56 ± 11* -15 ± 5 Cys +4 ± 3 -3 ± 1 Tyr -20 ± 3* +19 ± 1* Val +55 ± 9* -4 ± 2 Thr +40 ± 5* -2 ± 1 Met +57 ± 7* +6 ± 2 Leu +24 ± 3* -15 ± 3 Ile +41 ± 7* -8 ± 2 Phe -3 ± 1 +5 ± 1 Trp -22 ± 5* +18 ± 4* Примечание. * - различия по сравнению с показателем в контроле, р < 0,05. Полужирным шрифтом выделены статистически достоверные изменения ИП. Поэтому при исследовании действия сочетаний аминокислот на ИП эксплантатов ткани коры головного мозга и кожи особое внимание уделялось сочетаниям лейцина с пролином и лейцина с тирозином, так как в нервной ткани лейцин был стимулирующей, а пролин и тирозин - угнетающими аминокислотами. Для эксплантатов кожи стимулирующими аминокислотами были пролин и тирозин, а угнетал пролиферацию лейцин. В экспериментах на коре головного мозга были получены данные о том, что стимулирующее влияние на ИП оказали лейцин совместно с тирозином - ИП выше на 29 ± 2% (n = 21, p < 0,05) по сравнению с контролем (n = 20), лейцин совместно с пролином - ИП выше на 32 ± 3% (n = 20, p < 0,05) по сравнению с контролем (n = 22) (рис. 1). Таким образом, при сочетаниях лейцина с аминокислотами отмечалось даже превышение на 5-8% того стимулирующего эффекта, который наблюдался при изолированном действии лейцина (см. рис. 1). Контроль - нулевая линия, по вертикали - изменение ИП и площади экспрессии, %; * - p < 0,05 по сравнению с ИП в контроле При действии сочетаний аминокислот на ИП эксплантатов ткани кожи лейцин совместно с пролином способствовал увеличению ИП на 25 ± 3% (n = 22, p < 0,05) по сравнению с контролем (n = 21), лейцин совместно с тирозином увеличивал ИП на 24 ± 3% (n = 22, p < 0,05) по сравнению с контролем (n = 20). Это также превышало на 4-5% стимулирующий эффект, который наблюдался при изолированном действии как тирозина, так и пролина. Для изучения действия ЦФ на эксплантаты как коры головного мозга, так и кожи в органотипической культуре в питательную среду вводили ЦФ в концентрациях 0,01-10 мг/мл. Начиная с концентрации 0,01 мг/мл, происходило угнетение зоны роста, приводящее к статистически достоверному уменьшению ИП на 16 ± 1 и 18 ± 2% по сравнению с контрольными значениями соответственно. По мере увеличения концентраций рост эксплантатов затормаживался еще больше. При концентрации ЦФ 0,5 мг/мл ИП эксплантатов уменьшался уже на 18 ± 1 и 20 ± 3% по сравнению с ИП в контроле соответственно. При введении ЦФ в культуральную среду Рис. 1. Влияние аминокислот на ИП эксплантатов коры головного мозга Таблица 2 ИП (%) эксплантатов коры головного мозга и кожи при действии сочетаний аминокислот (Leu + Tyr, Leu + Pro) и ЦФ Сочетания аминокислот и ЦФ ЦФ Leu + Tyr Leu + Tyr и ЦФ Leu + Pro Leu + Pro и ЦФ Кора головного мозга -23 ± 1* +29 ± 3* +8 ± 2 +32 ± 5* +12 ± 1 Кожа -21 ± 1* +24 ± 1* -7 ± 1 +25 ± 3* -5 ± 2 Примечание. * - различия по сравнению с показателем в контроле, р < 0,05. в концентрации 1 мг/мл наблюдалось выраженное угнетение развития эксплантатов кожи и коры головного мозга крыс, ИП снижался на 21 и 23% соответственно по сравнению с ИП контрольных эксплантатов (табл. 2). При одновременном введении в культуральную среду сочетаний аминокислот - лейцин + тирозин и лейцин + пролин и ЦФ в концентрации 1 мг/мл происходило устранение ингибирующего действия ЦФ и величина ИП была на уровне контроля или имелась тенденция к увеличению в эксплантатах коры головного мозга. Так, при введении ЦФ в культуральную среду в концентрации 1 мг/мл с сочетанием лейцин + тирозин в эффективных концентрациях угнетающий эффект в эксплантатах не наблюдался. Отсутствие ингибирующего влияния ЦФ выражалось в статистически не достоверном уменьшении зоны роста эксплантатов коры головного мозга и кожи на 8 ± 5% (n = 24, р > 0,05) и 7 ± 3% (n = 24, р > 0,05), что сравнимо с контрольными значениями ИП (n = 22 и 20 соответственно). При действии ЦФ в концентрации 1 мг/мл с сочетанием лейцин + пролин в эффективных концентрациях в культуре ткани кожи ингибирующее влияние ЦФ на эксплантаты также устранялось. Наблюдалось лишь статистически не достоверное уменьшение зоны роста эксплантатов на -5 ± 2% (n = 25, р > 0,05), что сопоставимо с контрольными значениями ИП (n = 20). Введение в культуральную среду с эксплантатами коры головного мозга эффективной концентрации ЦФ с сочетанием лейцин + пролин приводило к устранению ингибирующего влияния ЦФ и статистически не достоверному увеличению зоны роста эксплантатов на 12 ± 1% (n = 24; р > 0,05) по сравнению с контрольными значениями (n = 20). Таким образом, выявлено, что цитостатическое действие ЦФ при одновременном введении с сочетаниями аминокислот - лейцин + тирозин и лейцин + пролин устранялось, уменьшаясь в целом на 36-31% в эксплантатах коры головного мозга и на 14-15% в эксплантатах кожи. Эти сочетания аминокислот способны устранять ингибирующий эффект ЦФ в органотипической культуре тканей коры головного мозга и кожи, которые происходят из эктодермального зародышевого листка. На основании полученных экспериментальных данных можно полагать, что при действии ЦФ, моделирующего резорбтивное действие иприта, в тканях коры головного мозга и кожи происходит угнетение клеточной пролиферации. Этот эффект ЦФ необходимо учитывать при лечении отдаленных последствий отравлений ипритом и ипритоподобными соединениями, так как даже в случаях легкого поражения могут развиваться патологические изменения нервной ткани и кожи, с чем могут быть связаны и онко- и мутагенные эффекты иприта. Полученные результаты позволяют обосновать использование сочетаний аминокислот для снятия токсического влияния иприта и ипритоподобных веществ, а также для ослабления побочных явлений при лечении цитостатиками онкологических заболеваний. Исследование эффективных сочетаний аминокислот - лейцин + тирозин и лейцин + пролин создает базу для синтезирования дипептидов, обладающих протекторными свойствами при действии цитостатических соединений.

About the authors

N I Chalisova

S. M. Kirov Military Medical Academy the Russian Defense Ministry, Saint Petersburg, Russia; I. P. Pavlov Institute of physiology, Saint Petersburg

A E Korovin

S. M. Kirov Military Medical Academy the Russian Defense Ministry, Saint Petersburg, Russia

References

Supplementary files