Эффективность применения различных схем системной противовоспалительной терапии глюкокортикоидами при развитии острого ЛПС-индуцированного повреждения легких в эксперименте

Полный текст

АКТУАЛЬНОСТЬ

Для поиска новых и эффективных методов лечения острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС) особое место занимает иммуногенная модель повреждения легких [1, 2]. Наиболее изученными моделями иммуногенного ОРДС являются модели с эндотрахеальным введением липополисахарида (ЛПС). Введение эндотоксина (ЛПС клеточной стенки грамотрицательных бактерий), обладающего высокой иммуно- и пирогенностью, способно вызвать как местные (массивная инфильтрация нейтрофилов в легкие, микротромбоз, интерстициальный и альвеолярный отек, гибель альвеолярных эпителиальных клеток и активация макрофагов), так и системные (избыточная продукция цитокинов и хемокинов, эндотелиальная дисфункция, нарушение микроциркуляции) патологические процессы [3–5]. На сегодняшний день являются доказанными системный противовоспалительный и мембраностабилизирующий эффекты глюкокортикоидов при различных иммуновоспалительных заболеваниях, в т. ч. при ОРДС, однако нерешенным вопросом остается выбор оптимальной дозы и режима их применения [1, 6, 7].

Цель исследования — оценить эффективность применения различных схем системной противовоспалительной терапии глюкокортикоидами на экспериментальной модели острого ЛПС-индуцированного повреждения легких.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Доклиническое исследование проведено на 100 беспородных крысах-самцах. Острое повреждение легких моделировали посредством экспериментальной модели прямого острого повреждения легких методом однократного интратрахеального введения ЛПС клеточной стенки бактерии Salmonella enterica («Sigma-Aldrich») в дозе ЛД₅₀ (20 мг/кг) [4]. Все животные были разделены на группы (по 20 каждая): 1 — интактные крысы; 2 — контрольная группа (ЛПС + физиологический раствор); 3 — ЛПС + дексаметазон 0,52 мг/кг (малые дозы); 4 — ЛПС + дексаметазон 1,71 мг/кг (средние дозы); 5 — ЛПС + дексаметазон 8 мг/кг (высокие дозы). Препараты вводили внутрибрюшинно один раз в день в течение 3 сут. Дозы дексаметазона рассчитывались по методу межвидового переноса доз с применением коэффициента, учитывающего разницу в площади поверхности тела [8]. В ходе эксперимента оценивали выживаемость, лабораторные, клинические параметры (гиподинамия, синюшность конечностей, тахипноэ, диспноэ), температуру и массу тела животных. Также рассчитывали массовый коэффициент легких (отношение массы легочного комплекса к массе животного) [4].

Статистический анализ. Для проверки гипотез, представленных в данной работе, была создана электронная база данных, полученных в результате эксперимента, с использованием программ Microsoft Office 365 Excel и с последующей статистической обработкой результатов в среде статистической программы Graph Pad Prism 8.0. Результаты исследования приведены в виде медианы, верхнего и нижнего квартилей — Me [Q1; Q3]. При сравнении медианы и относительных величин частоты показателей групп, имеющих нормальное распределение, использовался критерий Краскела–Уоллиса с проведением последующего апостериорного попарного сравнения с помощью теста Данна с учетом поправки Бонферрони. Статистически значимым различием показателей считался уровень значимости p < 0,05. Связь между качественными показателями, на двух уровнях каждый, оценивалась посредством построения четырехпольных таблиц сопряженности и расчета на их основе критерия χ² Пирсона, а при числе наблюдений на ячейке четырехпольной таблицы меньше 5 использовался точный критерий Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В группе 2 (группа контроля) наблюдается статистически значимое увеличение массового коэффициента легких после интратрахеального введения ЛПС в дозе 20 мг/кг по сравнению с группой 1 (интактные животные) (p < 0,0001). На фоне внутрибрюшинного введения дексаметазона в дозе 0,52 и 8 мг/кг в группах 3 и 5 отмечаются достоверно низкие значения медианы массового коэффициента легких в сравнении со значениями данного показателя в группе контроля (p = 0,0016 и р = 0,0003 соответственно) (табл. 1).

 

Таблица 1. Показатели массового коэффициента легких, 72 ч после лечения в течение 3 сут и их сравнение с группой контроля*
№ группы	Описание группы	Значение массового коэффициента легких	р (Dunn post-hoc test**)
1	Интактные животные	7,48* [5, 7; 8, 0]	<0,0001
2	Контроль, ЛПС 20 мг/кг и/т	12,53 [12, 02; 14, 02]	–
3	ЛПС 20 мг/кг и/т + дексаметазон 0,52 мг/кг в/б	8,59* [8, 25; 10, 56]	0,0016
4	ЛПС 20 мг/кг и/т + дексаметазон 1,71 мг/кг в/б	11,84 [9, 64; 12, 87]	0,5
5	ЛПС 20 мг/кг и/т + дексаметазон 8 мг/кг в/б	8,39* [7, 51; 9, 72]	0,0003
* — различия статистически значимы относительно значений в группе контроля (p < 0,05, критерий Краскела–Уоллиса); ** — здесь и дальше — тест апотсериорного межгруппового сравнения переменных.

 

В группе 5 (введение внутрибрюшинно 8 мг/кг дексаметазона) наблюдается статистически значимое снижение концентрации натрия в венозной крови в сравнении с группой контроля (p = 0,001). В группах 4 и 5 регистрируются достоверно значимые высокие показатели медианы концентрации калия (K) в венозной крови в сравнении с группой контроля (p = 0,002 и p = 0,008). Сывороточная концентрация ионизированного кальция (iCa) была достоверно выше в группе 4 (введение внутрибрюшинно 1,71 мг/кг дексаметазона) в сравнении с группой контроля. Медиана концентрации глюкозы венозной крови достоверно выше в группах 3–5 в сравнении с группой контроля (табл. 2).

 

Таблица 2. Содержание натрия, калия и глюкозы в крови лабораторных животных, 72 ч после лечения в течение 3 сут и их сравнение с группой контроля
№ группы	Описание группы	Показатели
		Na, ммоль/л	K, ммоль/л	iCa, ммоль/л	глюкоза, ммоль/л
2	Контроль, ЛПС 20 мг/кг и/т	142 [139; 144]	4,3 [3, 9; 4, 6]	1,45 [1, 24; 1, 49]	8,55 [7, 77; 8, 77]
3	ЛПС 20 мг/кг и/т + дексаметазон 0,52 мг/кг в/б	140,5 [139, 2; 141]	4,6 [4, 48; 5, 98]	1,44 [1, 36; 1, 49]	11,17* [9, 99; 11, 63]
4	ЛПС 20 мг/кг и/т + дексаметазон 1,71 мг/кг в/б	140 [139; 141]	4,9* [4, 8; 5, 6]	1,52* [1, 47; 1, 53]	12,22* [9, 97; 13, 72]
5	ЛПС 20 мг/кг и/т + дексаметазон 8 мг/кг в/б	137* [136, 5; 138, 5]	5,0* [4, 75; 5, 35]	1,43 [1, 34; 1, 56]	11,44* [10, 68; 14, 81]
p (критерий Краскелла–Уоллиса)		<0,001	0,0013	0,02	<0,001
* — p < 0,05, Dunn post-hoc test.

 

В группах 3–5 на фоне внутрибрюшинного введения дексаметазона наблюдались значимые межгрупповые различия по абсолютному количеству и процентному содержанию лимфоцитов, моноцитов, гранулоцитов (табл. 3).

 

Таблица 3. Показатели клинического анализа крови лабораторных животных
№ группы	Описание группы	Лейкоциты, 109/л	Лимфоциты, 109/л	Моноциты, 109/л	Гранулоциты, 109/л	Лимфоциты, %	Моноциты, %	Эритроциты, 1012/л	Гемоглобин, г/л	Тромбоциты, 109/л
2	Контроль, ЛПС 20 мг/кг и/т	7,7 [7, 2;10, 2]	5,4 [4, 6;5, 8]	0,4 [0, 3;0, 5]	1,5 [1, 3;1, 7]	74 [73;75]	5 [5;6]	7,5 [7, 4;7, 7]	15,2 [15;16]	519 [515;592]
3	ЛПС 20 мг/кг и/т + дексаметазон 0,52 мг/кг в/б	6,1 [5, 8;6, 8]	1,8* [1, 7;2, 1]	0,8 [0, 7;0, 9]	3,2* [3, 1;3, 8]	32* [29; 36]	13* [11; 14]	7 [7; 7]	15 [15; 16]	548 [504;599]
4	ЛПС 20 мг/кг и/т + дексаметазон 1,71 мг/кг в/б	8 [7; 11]	2* [1; 3]	1* [0, 5;1, 5]	5* [4; 6]	22* [20; 30]	12* [11; 15]	7 [7; 8]	15 [15; 17]	511 [444;568]
5	ЛПС 20 мг/кг и/т + дексаметазон 8 мг/кг в/б	8,5 [7, 2; 10, 1]	2,4* [1, 6; 3]	1,3* [1; 1, 4]	4,5* [4, 1; 6]	30,5* [29; 34]	15,3* [13, 3; 15, 7]	7,7 [7, 3; 7, 9]	16,3 [15, 5; 16, 4]	410* [335; 449]
p (критерий Краскелла–Уоллиса)		<0,001	0,012	0,009	<0,001	<0,001	0,001	0,28	0,19	0,021
* — p < 0,05, Dunn post-hoc test.

 

В этих группах (введение дексаметазона) наблюдается статистически значимое увеличение растворимых фибрин-мономерных комплексов (РФМК) после интратрахеального введения ЛПС в дозе 20 мг/кг по сравнению с данными группы 1 (интактные животные) (p < 0,001), что, вероятно, отражало активацию тромбообразования. При этом следует отметить, что повышение дозы дексаметазона было ассоциировано с более высокими показателями РФМК (табл. 4).

 

Таблица 4. Содержание РФМК в крови лабораторных животных
№ группы	Описание группы	РФМК, г/л × 102
1	Интактные животные	6,75 [5, 8; 9]
2	Контроль, ЛПС 20 мг/кг и/т	9 [8, 9; 10]
3	ЛПС 20 мг/кг и/т + дексаметазон 0,52 мг/кг в/б	13* [12; 17]
4	ЛПС 20 мг/кг и/т + дексаметазон 1,71 мг/кг в/б	12,5* [10, 75; 17, 5]
5	ЛПС 20 мг/кг и/т + дексаметазон 8 мг/кг в/б	14,5* [12, 5; 18, 75]
p (критерий Краскелла–Уоллиса)		<0,001
* — p < 0,001, Dunn post-hoc test.

 

В группах 1, 3–5 в сравнении с группой контроля (2) наблюдались статистически значимые различия между частотой встречаемости таких клинических параметров, как гиподинамия, синюшность конечностей, тахипноэ, диспноэ (p < 0,001, точный критерий Фишера).

При внутригрупповом сравнении выявлено, что изменения массы тела были статистически значимы во всех испытуемых группах по сравнению с исходными значениями на момент начала эксперимента (р < 0,05, попарный критерий Уилкоксона). В то же время значимых различий в характере изменения веса между группами не установлено.

Анализ выживаемости в группах показал, что применение дексаметазона внутрибрюшинно в малых дозах (0,52 и 1,71 мг/кг) один раз в сут в течение 3 сут положительно влияло на выживаемость при остром ЛПС-индуцированном повреждении легких: на 4-е сут в соответствующих группах животных был выявлен только один летальных исход (5 %). В группе крыс, получавших дексаметазон в дозе 8 мг/кг, летальность составила 25 % (5 животных), а в группе контроля — 45 % (9 животных).

Таким образом, индукция острого повреждения легких в эксперименте на лабораторных животных с помощью эндотрахеального введения ЛПС S. enterica приводит к развитию ранней летальности (45 %, 9/20), ухудшению клинических, лабораторных и морфологических (массовый коэффициент легких) параметров. К исходу 3-х сут наблюдается статистически значимое снижение массового коэффициента легких у животных, получавших дексаметазон в дозе 0,52 и 8 мг/кг, в сравнении с животными контрольной группы и животными, получавшими 1,71 мг/кг. Применение дексаметазона внутрибрюшинно в малых дозах (0,52 и 1,71 мг/кг) один раз в день в течение 3 сут положительно влияет на выживаемость при остром ЛПС-индуцированном повреждении легких. У животных, получающих дексаметазон, регистрируется более высокий уровень глюкозы, калия, ионизированного кальция, РФМК, что, вероятно, обусловлено побочными эффектами терапии глюкокортикоидами. При этом следует отметить, что повышение дозы дексаметазона было ассоциировано с активацией тромбообразования. Значимых различий по динамике клинических показателей между группами, получающими дексаметазон, не выявлено

ВЫВОДЫ

1. Индукция острого легочного повреждения в эксперименте на модели мелких лабораторных животных с помощью эндотрахеального введения ЛПС enterica приводит к развитию ранней летальности (45 %, 9/20), ухудшению клинических, лабораторных и морфологических (массовый коэффициент легких) параметров.
2. К исходу 3-х сут наблюдается статистически значимое снижение массового коэффициента легких у животных, получавших дексаметазон в дозе 0,52 и 8 мг/кг, в сравнении с контрольной группы и животными, получающими 1,71 мг/кг дексаметазона.
3. Применение дексаметазона внутрибрюшинно в малых дозах (0,52 и 1,71 мг/кг) один раз в день в течение 3 сут положительно влияет на выживаемость при ЛПС-индуцированном повреждении легких — летальность к исходу 3-х сут составила 5 % (1/20).
4. У животных, получающих дексаметазон, регистрируется более высокий уровень глюкозы, калия, ионизированного кальция, РФМК, что, вероятно, обусловлено побочными эффектами терапии глюкокортикоидами. При этом следует отметить, что повышение дозы дексаметазона было ассоциировано с активацией тромбообразования. Значимых различий по динамике клинических показателей между группами, получающими дексаметазон, не выявлено.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Финансирование данной работы не проводилось.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Этическая экспертиза. Проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом ФГБВОУ ВО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ (протокол № 258 от 21.12.2021).

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

Об авторах

Владимир Владимирович Салухов

Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова

Email: vlasaluk@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1851-0941
SPIN-код: 4531-6011
Scopus Author ID: 55804184100

докт. мед. наук, доцент

Россия, Санкт-Петербург

Никита Игоревич Волошин

Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова

Email: nikitavoloshin1990@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-3880-9548
SPIN-код: 6061-4342

Адъюнкт первой кафедры (Терапии усовершенствования врачей)

Россия, Санкт-Петербург

Максим Игоревич Шперлинг

Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова

Автор, ответственный за переписку.
Email: mersisaid@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3274-2290
SPIN-код: 7658-7348
Scopus Author ID: 57215661145
ResearcherId: ABC-3170-2021

клинический ординатор первой кафедры (Терапии усовершенстования врачей)

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы