Митохондриальные сети клеток кумулюса и качество ооцитов

Полный текст

АКТУАЛЬНОСТЬ

Нарушения фертильности является растущей проблемой в развитых странах, при этом ассоциированная с бесплодием митохондриальная дисфункция была продемонстрирована у женщин как при определенных соматических заболеваниях, так идиопатическом бесплодии. Митохондрии ооцитов в отличие от соматических клеток обеспечивают выработку АТФ гликолитическим и пентозофосфатным путями, а не путем окислительного фосфорилирования, что обеспечивает активную энергетическую аранжировку на ранних этапах эмбриогенеза. Значительную роль в достижении ооцитами цитоплазматического созревания и формировании достаточного митохондриального пула ооцитов играют окружающие его клетки кумулюса [1].

Функциональные митохондриальные нарушения являются взаимосвязанным фактором многочисленных заболеваний, в том числе и в репродуктивной сфере [2]. Данный тезис привел к предположению, что как аномальные метаболические маркеры митохондрий, так и количественные и качественные нарушения функционирования митохондриальных сетей ассоциированы с неблагоприятным репродуктивным прогнозом [3]. Повышенные маркеры оксидативного стресса у женщин репродуктивного возраста ассоциированы как с митохондриальными дисфункциями и наличием репродуктивно-значимой патологией (например, синдром поликистозных яичников), так и с высоким риском бесплодия и невынашивания беременности [4]. С другой стороны, маркеры оксидативного стресса являются результатом субклинических нарушений, в то время как до появления лабораторных маркеров уже на протяжении определенного времени имеются ультраструктурные изменения, отражающие функциональный потенциал клеток [5]. Одним из таких изменений является состояние митохондриальных сетей в функциональных и вспомогательных клетках [6].

Цель исследования — провести сравнительный анализ между состоянием митохондриальных сетей клеток кумулюса и качеством ооцитов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование было проведено на материале, полученном при выполнении пункции фолликулов в протоколах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) отделения репродуктологии НИИ акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта. При исследовании фолликулярной жидкости, полученной от 22 пациенток в возрасте от 28 до 37 лет включительно (средний возраст 32,3 ± 1,2 года) c трубно-перитонеальным фактором бесплодия, после отбора ооцитов были выделены клетки кумулюса, после чего суспензия высеивалась на покровные стекла в шестилуночных культуральных планшетах. После суточной инкубации при температуре 37° C клетки окрашивались прижизненным митохондриальным красителем (митотрекером) в течение 45 мин в бессывороточной среде. Фиксация на предметные стекла выполнялась в 10 % растворе нейтрального забуференного формалина в течение 10 мин. Визуализация осуществлялась при помощи конфокального микроскопа Leica TCS SP5 II с аналитической системой SMD FLCS. Для анализа трехмерной организации митохондрий с каждого препарата выбиралось от 20 до 30 клеток, для каждой из которых снимался z-стек, полностью захватывающий все митохондрии в клетке. Размер вокселя подбирался в соответствии с критерием Найквиста для возможности проведения пространственной деконволюции, которая осуществлялась при помощи специальной компьютерной программы, рассчитывающей функцию рассеивания точки. Полученные в результате деконволюции данные сегментировались в программе Bitplane Imaris с использованием модуля Filament Tracer. В статистический анализ включались средние значения параметра Filament Length для каждой клетки, включаемые в анализ как параметр длины ветви митохондриальной сети, а также количество таких ветвей сети. Ветви длиной менее 0,7 мкм принимались за артефакт сегментации и не учитывались при обработке данных. Число ветвей митохондриальной сети косвенно оценивалось по среднему времени затухания флуоресценции (τ, мс).

В дальнейшем результаты исследования митохондриальных сетей клеток кумулюса сравнивались с качеством полученных в протоколах ВРТ ооцитов. Качество ооцитов оценивалось на основании внешнего вида цитоплазмы, вителлинового слоя, полярного тельца. Исследование выполнено в полном соответствии с принципами Хельсинкской декларации Всемирной ассоциации «Этические принципы научных и медицинских исследований с участием человека», действующими порядками и стандартами оказания медицинской помощи, а также другими регуляторными требованиями к проведению клинических исследований и наблюдательных программ в Российской Федерации.

РЕЗУЛЬТАТЫ

По результатам оценки эмбриологических протоколов было получено 74 ооцита, при этом 39 ооцитов были хорошего качества и отличались гомогенной цитоплазмой однородного цвета и отсутствием гранулярности, 35 ооцитов имели негативные признаки и характеризовались наличием вакуолей, темной окраской, включениями, деформацией и/или гранулярностью. Среднее время затухания в клетках кумулюса при ооцитах хорошего качества составило 3,11 (2,64; 3,53) мс, было достоверно выше при анализе данных клеток при ооцитах с негативными признаками и составило 0,97 (0,60; 1,95) мс (U = 276,5, p = 0,032). Корреляционный анализ ранжированных значений (по Спирмену) продемонстрировал, что время затухания флуоресценции имело сильную прямую корреляцию (r = 0,76) с числом ветвей митохондриальной сети. Таким образом, степень разветвления (структура) митохондриальной сети клеток кумулюса коррелирует с качеством ооцита.

При исследовании внутриклеточной структуры клеток кумулюса было установлено, что увеличение длины ветвей митохондриальной сети обратно коррелировало с количеством митохондрий. Основываясь на этом факте, можно предположить, что в данном случае это, скорее всего, является следствием фракционирования сети, а не нарастания массы митохондрий путем их деления, поскольку биогенез митохондрий не сопряжен с распадом митохондриальных сетей [7]. Достоверных различий в интенсивности флуоресценции не получено, однако при увеличении длины ветвей увеличивается интенсивность флуоресценции, что было установлено на основании уменьшения среднего значения τ при снижении увеличения средней длины ветви митохондриальной сети. Вероятно, данные изменения связаны с тем, что для работы электрон-транспортной цепи создаются более благоприятные условия и/или в более крупных митохондриях генерируется меньше активных форм кислорода либо они более эффективно нейтрализуются [8]. Полученные различия в клетках кумулюса можно связать с механизмом самоконтроля качества и количества митохондрий клеткой. Имеются данные, что с увеличением генерации активных форм кислорода все большее количество внутриклеточных элементов оказываются поврежденными, что приводит к более активному отделению от сети митохондрий с поврежденными комплексами электронно-транспортной сети в результате модификации активности аппарата деления митохондрий [9]. Средняя длина ветви митохондриальной сети при этом также несколько уменьшается.

Развитие научно-технического прогресса за счет внедрения молекулярно-генетических методов диагностики качества эмбриона в виде предимплантационной генетической диагностики решило вопрос эмбриональной селекции, т. е. отбора генетически полноценных эмбрионов и выбраковывания анеуплоидных эмбрионов. Однако в настоящее время достаточно остро стоит проблема отсутствия имплантации генетически полноценных эмбрионов даже при нормальном состоянии эндометрия, что при достаточном количестве репродуктивного материала еще больше усложняет процесс селекции эмбриона для переноса. Настоящая работа является пилотным проектом по оценке митохондриального потенциала ооцитов, основанным на оценке структуры митохондриальной сети основных клеток, окружающих ооцит, — клеток кумулюса, которые извлекаются вместе с яйцеклеткой при пункции фолликулов в протоколах ВРТ. Отсутствие возможности, за исключением морфологических данных, выполнить оценку ооцита стимулирует научный поиск маркеров качества репродуктивного материала. В первые часы эмбриогенеза митохондрии ооцита являются источником энергии для развивающегося эмбриона, который получает минимальное количество питательных веществ до момента инвазии трофобласта в эндометрий [10].

Любой вариант неинвазивной для эмбриона диагностики его возможного качества может рассматриваться как вариант предиктивной аналитики в вопросах эмбриональной селекции, базирующийся на оценке их перспективности. В дополнении к информации об отсутствии генетических аномалий у эмбриона сведения о качестве эмбриона, основанные на данных о состоянии митохондриальных сетей клеток кумулюса, могут быть крайне полезными для выбора эмбриона-кандидата для переноса в полость матки.

Если состояние митохондриальных сетей клеток кумулюса имеет достаточную степень корреляции с качеством и количеством митохондрий ооцита, это может быть вариантом неинвазивной диагностики определения качества эмбриона, полученного при оплодотворении in vitro ооцитов с известными данными.

Вывод. На основании флюоресценции митохондрий в клетках кумулюса установлено, что структура митохондриальных сетей в клетках, формирующих непосредственное окружение ооцита при созревании фолликула, коррелирует с качеством ооцитов и, соответственно, качеством эмбрионов.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Финансирование данной работы не проводилось.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Этическая экспертиза. Исследование выполнено на биологическом материала, подлежащем обязательной утилизации, в силе чего одобрение локального этического комитета не требуется.

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

Об авторах

Егор Валерьевич Панферов

Институт цитологии РАН

Email: panferov.aux@gmail.com

магистр Института цитологии РАН

Россия, Санкт-Петербург

Наталья Игоревна Тапильская

Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта

Автор, ответственный за переписку.
Email: tapnatalia@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-5309-0087
SPIN-код: 3605-0413
Scopus Author ID: 23013489000
ResearcherId: A-7504-2016

докт. мед. наук, профессор, ведущий научный сотрудник

Россия, Санкт-Петербург

Кристина Сабухиевна Масиева

Военно-медицинская академия

Email: masieva98@mail.ru

студентка 6 курса

Россия, Санкт-Петербург

Ксения Владимировна Объедкова

Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта

Email: obedkova_ks@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2056-7907
SPIN-код: 2709-2890

канд. мед. наук, научный сотрудник отдела репродукции

Россия, Санкт-Петербург

Александр Мкртичевич Гзгзян

Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта

Email: iagmail@ott.ru
ORCID iD: 0000-0003-3917-9493
SPIN-код: 6412-4801
Scopus Author ID: 56232643300

докт. мед. наук, заведующий отделом репродукции

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы