SOVREMENNYE TEKhNOLOGII IZUChENIYa PREPARATOV, VLIYaYuShchIKh NA KOGNITIVNYE FUNKTsII

Abstract

Full Text

Проблема нарушений когнитивных функций остается одной из наиболее значимых в современной невро- логии, поскольку когнитивный дефицит сопровождает развитие многих неврологических заболеваний, включая болезни Альцгеймера, Паркинсона и другие нейродегенеративные патологии, а также церебровавскулярные рас- стройства. Для коррекции когнитивных нарушений используют фармакологические препараты, объединяемые под общим названием «ноотропы», представляющие собой большой круг веществ с разными фармакологическими свойствами, оказывающими активирующее влияние на обучение, улучшающие память и умственную деятель- ность. В настоящее время активно разрабатываются и внедряются в клиническую практику новые препараты этого класса, однако для многих из них механизмы действия остаются неясными. Выявление свойств и отбор веществ с ноотропными свойствами осуществляются главным образом на основании эмпирических наблюдений и поведен- ческих экспериментов на животных, в то время как их клеточные и рецепторные мишени остаются неизученными. Понимание нейрональных механизмов действия этих препаратов, включая данные об изменениях эффективности синапсов, модуляции рецепторов и ионных каналов, несомненно, будет способствовать их более эффективному использованию и созданию новых соединений с ноотропными свойствами. Одной из современных технологий, применяемых для изучения клеточных механизмов действия ноотро- пов, наряду с молекулярно-биологическими, фармакологическими и другими подходами, является использование широкого спектра электрофизиологических методов, позволяющих получить важную информацию о механизмах действия лекарственных средств этого класса. Одним из наиболее современных электрофизиологических под- ходов, используемых для изучения свойств рецепторов, ионных каналов и механизмов действия лекарственных препаратов, является метод регистрации токов в условиях фиксации напряжения - так называемый пэтч-кламп метод (patch clamp method) или метод локальной фиксации потенциала [4]. Этот метод даёт возможность экспери- ментатору контролировать разность потенциалов между сторонами мембраны нейрона и измерять ионные токи, проходящие через нее, что, в конечном итоге, позволяет делать выводы о том, как ионные каналы реагируют на электрическое и химическое воздействие. Одна из существующих конфигураций этого метода - регистрация от целой клетки (“whole-cell record- ing”) наиболее часто применяется для записи активности нейронов в срезах мозга, сохраняющих синаптические связи с другими клетками. На рис 1 представлена микрофотография расположения клеток в пирамидном слое поля СА1 гиппокампа и пирамидной клетки в месте с регистрирующей микропипеткой. На том же рисунке показана типичная запись спонтанных ионных токов в нейроне, показанном на фотографии. Видно, что активность состоит из миниатюрных токов амплитудой от 10-15 до 300-400 пА, которые являются результатом воздействия на клеточ- ную мембрану квантов ГАМК, спонтанно выделяющихся из терминалей тормозных интернейронов, расположен- ных в разных слоях поля СА1. Технология регистрации ионных токов в срезах мозга позволяет получить информацию о механизмах действия веществ с ноотропными свойствами. Нами получены данные о синаптических механизмах действия одного из ноотропных препаратов - Ноопепта. Этот препарат обладает ноотропным, нейропротекторным и анксио- литическим действием, он улучшает способность к обучению и память [2]. В опытах на срезах гиппокампа мы обнаружили, что введение в проточную среду 1 мкМ Ноопепта приводит к существенному увеличению ампли- А туды и частоты миниатюрных токов, связанных с активацией ГАМК рецепторов. При блокаде синаптической передачи с помощью тетродотоксина изменений спонтанных тормозных токов под действием Ноопепта не наблю- дали, что позволило предположить, что мишенью Ноопепта являются не сами пирамидные нейроны, а тормозные интернейроны, заканчивающиеся на них. Это предположение нашло подтверждение в экспериментах с регист- рацией активности интернейронов радиального слоя поля СА1, в которых было обнаружено, что их спонтанная активность значительно усиливается в присутствии Ноопепта (рис. 2). Полученные результаты свидетельствуют о том, что одним из механизмов действия Ноопепта является усиление тормозных процессов в гиппокампе. Физио- логическое значение обнаруженного эффекта состоит в увеличении тонического торможения во внутригиппокам- пальных путях, что может лежать в основе анксиолитического действия препарата. Существенный прогресс в изучении рецепторных и молекулярных механизмов действия физиологи- чески активных веществ, включая препараты, улучшающие когнитивные функции, был достигнут благодаря внедрению в практику экспериментальных исследований технологии регистрации ионных токов в изолированных нейронах. Преимущество регистрации с помощью пэтч-кламп метода от изолированных нейронов по сравнению со срезами мозга состоит в возможности проведения исследований на нейронах, изолированных от синаптичес- ких воздействий со стороны других нейронов, а также исключать другие неконтролируемые влияния. Экспери- ментатор может помещать клетку в среду с определённым химическим составом, что обеспечивает возможность активировать определенный тип рецепторов и потенциал-управляемых ионных каналов и точно контролировать концентрацию исследуемых веществ. В лаборатории функциональной синаптологии была разработана оригиналь- ная методика изоляции клеток из срезов мозга с помощью вибродиссоциации [5], которая позволяет выделять нейроны без применения протеолитических ферментов. Эта методика нашла широкое применение в различных лабораториях по всему миру. С ее использованием нами были проведены исследования влияния на активность лиганд-управляемых каналов ряда препаратов, обладающих нейропротекторными и прокогнитивными свойства- ми. Одним из таких препаратов является лекарственное средство Семакс. Несмотря на то, что Семакс широко используется в неврологической практике при острой и хронической недостаточности мозгового кровообраще- ния, а также в качестве ноотропного и нейропротекторного лекарственного средства, механизм его действия до настоящего времени не выяснен. Используя технологию регистрации токов с помощью пэтч-кламп метода, мы обнаружили, что Семакс потенцирует ГАМК-активируемые токи в изолированных клетках Пуркинье мозжечка и угнетает активность глициновых рецепторов в пирамидных нейронах гиппокампа [3]. Обнаруженная модуляция А активности ГАМК рецепторов может быть одним из механизмов, обеспечивающих нейропротекторные и ноотропные эффекты Семакса. Для выявления клеточных мишеней и механизмов действия ноотропных препаратов используется так- же технология оптической регистрации активности нейронов, в частности, метод оптической регистрации Ca2+ сигнала, который позволяет количественно оценить влияние препарата на динамику изменений концентрации внутриклеточного Ca2+, а также выявить локализацию и клеточную специфичность действия этих веществ. Эта информация также важна для понимания механизмов действия исследуемых препаратов, поскольку изменение концентрации внутриклеточного Ca2+ является начальным звеном многих сигнальных каскадов, запускаемых при действии физиологически активных веществ. В опытах на культурах гиппокампа обнаружили, что под действием Ноопепта возрастает частота кальциевых сигналов в str. radiatum (область локализации тормозных интернейро- нов), в слое же пирамидных нейронов значимого изменения этого параметра не происходит [1]. Эти наблюдения находятся в соответствии с полученными ранее данными об усилении активности тормозных интенейронов ради- ального слоя и подтверждают сделанное ранее предположение о том, что первичной мишенью Ноопепта являются ГАМКергические интернейроны области str. radiatum. Одной из современных технологий, используемых для понимания механизмов функционирования ней- рональных рецепторов и ионных каналов, является молекулярное моделирование, которое стало одной из наибо- лее интенсивно развивающихся областей науки. Такой подход позволяет определить конкретное место связывания лиганда на белковой молекуле рецептора/канала, а также исследовать связь структура-активность, что имеет важ- ное практическое значение для разработки новых лекарственных препаратов. Таким образом, применение современных технологий исследования нейрональной активности мозга поз- воляет идентифицировать клеточные и молекулярные мишени действия препаратов, влияющих на когнитивные функции, а именно, типы нейронов, вовлеченных в реализацию эффектов, и рецепторные системы и ионные кана- лы, с которыми взаимодействуют эти препараты. Все это очень важно для совершенствования уже применяемых и создания новых отечественных препаратов, предотвращающих развитие разных форм нарушения когнитивной деятельности и способствующих улучшению памяти и обучения.