Отправить статью по E-mail Разработка методов анализа однонуклеотидных полиморфизмов Plasmodium falciparum в генах PfCRT (А > C), PfMDR1 (A > T) и PfDHFR (G > A), определяющих резистентность к хинолиновой, диамино-пиримидиновой и сульфаниламидной группам противомалярийных препаратов
- Авторы: Арюков А.Р.1, Соловьев А.И.1, Капацина В.А.2, Крутикова А.А.1, Романенко В.А.1, Коваленко А.Н.1, Колесник А.А.1, Зинин А.С.1
-
Учреждения:
- Военно-медицинская академия
- Клиническая инфекционная больница им. С.П. Боткина
- Выпуск: Том 43, № 1 (2024)
- Страницы: 13-22
- Раздел: Оригинальные исследования
- URL: https://journals.eco-vector.com/RMMArep/article/view/625584
- DOI: https://doi.org/10.17816/rmmar625584
- ID: 625584
Цитировать
Полный текст
Аннотация
Актуальность. Единичные нуклеотидные полиморфизмы K76T (A403627C), S1034C (A960989T) и S108N (G748410A) ассоциированы с лекарственной резистентностью возбудителей тропической малярии к мефлохину, хлорохину, пириметамину и их производным. Эти мутации связаны с изменением структуры генов PfCRT и PfMDR1 Plasmodium falciparum.
Цель исследования. Разработка способов идентификации единичных нуклеотидных полиморфизмов, пригодных для ранней диагностики лекарственно устойчивых форм тропической малярии.
Результаты. Для выявления полиморфизма K76T (A403627C) разработан метод на основе анализа длин рестрикционых фрагментов с использованием эндонуклеазы ApoI. При этом критерием устойчивости паразитов к хлорохину служило появление на электорфореграмме одного бэнда 145 bp. Его разделение на два фрагмента (98 и 47 bp) свидетельствовало о неизмененном генотипе возбудителей и сохранении их лекарственной чувствительности. При разработке системы для обнаружения S108N (G748410A) использовалась эндонуклеаза Bse1I. В этом случае признаком мутантного генотипа возбудителей служило появление на электофореграмме единичного бэнда 507 bp. О неизмененном генотипе и сохранении лекарственной чувствительности плазмодиев свидетельствовало появление двух фрагментов (323 и 184 bp). Для идентификации полиморфизма A > T в гене PfMDR1 в позиции 960989 предложено использовать технологию полимеразной цепной реакции с двумя аллель-специфичными праймерами, один из которых служит для выявления аллеля дикого типа, другой — для мутантного генотипа. Амплифицируемый фрагмент гена PfMDR1 содержит последовательности 1034-го кодона. В зависимости от генотипа Plasmodium falciparum. будут получены фрагменты 261 bp c одним из аллель-специфичных праймеров.
Заключение. Исходя из анализа полученных данных, были разработаны критерии для оценки лекарственной устойчивости P. falciparum. Гаплотипы K76T (бэнд 145 bp), S1034C (бэнд 262 bp с прямым праймером S1034C-F2) служат признаками относительной устойчивости возбудителей к хлорохину, мефлохину и их производным. Положительные результаты обследования на гаплотип S108N (бэнды 323 и 184 bp) следует рассматривать как признак снижения чувствительности к пириметамину. Разработанные методики могут применяться в клинической практике, а также в целях эпидемиолгического мониторинга.
Ключевые слова
Полный текст
АКТУАЛЬНОСТЬ
Лекарственная устойчивость возбудителей тропической малярии является серьезной проблемой в борьбе с этим заболеванием. Она связана с высокой пролиферативной активностью паразитов, а также с изменчивостью генома плазмодиев, которая проявляется в мутациях внутри генетического материала.
Мутации в генах, ответственных за структуру транспортного белка мембраны пищеварительной вакуоли, являются одной из причин формирования устойчивости к действию хлорохина, мефлохина, хинина и хинидина, которые до недавнего времени наиболее часто применялись в лечении различных фор малярии [1, 2].
Гены PfMDR1 и PfCRT кодируют структуру транспортного белка, который играет важную роль в процессах обмена веществ внутри клетки паразита. Мутации в этих генах, например (A > C) в гене PfCRT и (A > T) в гене PfMDR1, могут приводить к выводу метаболитов лекарственных препаратов из клетки, что снижает их концентрацию и ослабляет эффективность лечения.
Еще одна мутация, которая может влиять на эффективность противомалярийных препаратов, связана с геном PfDHFR. Этот ген отвечает за синтез важного фермента, необходимого для синтеза нуклеиновых кислот малярийными плазмодиями. Показано, что мутация (G > A) может уменьшить чувствительность паразитов к пириметамину, который до настоящего времени применяется в комплексном лечении тяжелых форм малярии [3–6].
Идентификация мутаций в генах паразитов часто проводится с помощью полимеразной цепной реакции на основе аллель-специфических праймеров или анализа длин рестрикционных фрагментов (RFLP). Этот метод особенно эффективен при проведении эпидемиологических исследований [7, 8].
Однако для их широкого применения в практике нужны стандартизованные протоколы исследования. Опыт показывает, что точность и достоверность результатов зависят от качества используемого оборудования и реактивов, что создает определенные трудности. В связи с этим важной задачей является разработка методики для обнаружения маркеров лекарственной устойчивости в генах PfCRT (A > C), PfMDR1 (A > T) и PfDHFR (G > A) [9–12].
Эта методика будет полезна для оценки эффективности основных противомалярийных препаратов и контроля распространения лекарственной устойчивости тропической малярии в ходе эпидемиологического надзора за малярийной инфекцией.
Цель исследования — разработать способ эффективной идентификации единичных нуклеотидных полиморфизмов генов PfCRT (A > C), PfMDR1 (A > T) и PfDHFR (G > A) на основе аллель-специфичной ПЦР и метода рестрикционного анализа.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Пробоподготовка. В ходе подготовки образцов крови для анализа ДНК выделялась стандартно при помощи смеси, содержащей фенол-хлороформ [13].
Праймеры. Для разработки праймеров для ПЦР использовалась программа «BLAST» в сочетании с базами данных Plasmodium falciparum (далее P. falciparum) 3D7 assembly, а также NCBI — NC 004326.2.
Эндонуклеазы рестрикции. Для определения оптимальных эндонуклеаз рестрикции для генотипирования P. falciparum был проведен подбор в специализированой базе рестриктаз NEBCutter (https://nc3.neb.com/NEBcutter/).
Амплификация ДНК. Полимеразная цепная реакция проводилась на амплификаторе BioRad C1000. Реакционная смесь состояла из деионизированной воды (8 мкл), 5X ScreenMix-HS (ЗАО «Евроген», Россия) — 2,5 мкл, прямых и обратных праймеров (по 0,5 мкл, 20 мкм) и матрицы выделенной ДНК (1 мкл). Каждый ингредиент был добавлен в оптимальном количестве для достижения эффективной амплификации ДНК.
Для достижения максимальной специфичности и эффективности амплификации ДНК были индивидуально настроены параметры циклов амплификации, а именно температура и длительность начальной и основной денатурации, отжига праймеров, основной и финальной элонгации. Для разделения продуктов амплификации использовался электрофорез на 1,5 % агарозном геле. Для создания геля использовалась агароза, разведенная в TАЕ буфере, с добавлением SYBR Green I. При помощи стандартизированных маркеров длин ДНК определялись размеры амплифицированных участков ДНК. Результаты электрофореза были зафиксированы с помощью системы гель-документации GelDoc Go (Bio-Rad).
Клинический материал. В качестве исследуемых образцов использовались коллекционные препараты крови больных тропической малярией, собранные сотрудниками кафедры биологии Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова в различные годы на территории Африки, Юго-Восточной Азии и Океании. Это позволило адаптировать разрабатываемые диагностические системы применительно к различным штаммам малярийных плазмодиев с учетом особенностей их генома.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Мутация (A > C) (K76T) представляет собой замену аденина на цитозин в первом нуклеотиде 76 триплета гена PfCRT. Это приводит к изменению аминокислоты лизина на треонин в последовательности транспортного белка внутренней мембраны P. falciparum [14]. Для определения этой мутации использовалась техника RFLP. В процессе поиска подходящего участка в геноме паразита с мутацией (A > C) для проведения рестрикционного анализа нашлась только одна подходящая пара специфических праймеров: K76T-F: 5'-TGTGCTCATGTGTTTAAACTT-3' (21 нуклеотид) и K76T-R: 5'-CAAAACTATAGTTACCAATTTTG-3' (23 нуклеотида). Размер рассматриваемого участка ДНК, подлежащего амплификации, составляет 145 нуклеотидов. Праймеры, применяемые для этой цели, не обладают специфичностью к геному человека и другим известным организмам, что исключает возможность кросс-реакции. При выборе рестриктазы для выявления мутации (A > C) были обнаружены сайты двух эндонуклеаз: ApoI (5'-R↑AATTY-3'; 3'-YTTAA↓R-5') и MluCI (5'-↑AATT-3'; 3'-TTAA↓-5'). При этом ApoI имела только один сайт рестрикции в пределах аплифицируемого участка, в то время как MluCI — 2. Так как рестриктаза ApoI, в отличие от MluCI, не имеет других точек рестрикции, помимо мутантного участка 145 bp, это приводит к образованию двух фрагментов в геле (рис. 1).
Рис. 1. Места разреза ApoI и MluCI ампликона 145 bp (https://nc3.neb.com/NEBcutter/prj/PFCRT_K76T)
Fig. 1. ApoI and MluCI cut sites of the 145 bp amplicon (https://nc3.neb.com/NEBcutter/prj/PFCRT_K76T)
Поэтому в дальнейшей работе ApoI использовалась с целью выявления мутации (A > C) (рис. 2).
Рис. 2. Амплифицированный фрагмент гена. Сайт рестрикции эндонуклеазы ApoI находится в позиции 76-го кодона гена PfCRT. Места разреза фрагмента ДНК, обусловленные этим сайтом рестрикции, обозначены стрелками. Кодон 76-го фрагмента гена PfCRT выделен подчеркиванием
Fig. 2. Amplified gene fragment. The restriction site of the ApoI endonuclease is located at position 76 of the PfCRT codon. The DNA arrows indicate fragment cut sites caused by this restriction site. The 76th codon of the PfCRT gene fragment is underlined
Область действия эндонуклеазы ApoI содержит 76 триплет гена PfCRT только в случае неизмененного генотипа P. falciparum (рис. 3).
Рис. 3. Участок гена PfCRT, содержащий 76-й кодон и сайт рестрикции AcsI (ApoI). Точка 1 — 76-й триплет гена PfCRT, кодирую- щий лизин (дикий аллель) или треонин (мутантный аллель) в структуре транспортного белка внутренней мембраны P. falciparum. Точка 2 — место действия эндонуклеазы AcsI (ApoI) в гене PfCRT. Точка 3 — второй нуклеотид 76-го кодона (в данном случае аденин). Точка 4 — сайт рестрикции эндонуклеазы AcsI (ApoI)
Fig. 3. Location of the PfCRT gene containing the 76th codon and the AcsI (ApoI) restriction site. Point 1 — the 76th triplet of the PfCRT gene encoding lysine (wild type allele) or threonine (mutant allele) in the structure of the inner membrane transport protein of P. falciparum. Point 2 — is the site of action of the AcsI endonuclease (ApoI) in the PfCRT gene. Point 3 — the second nucleotide of the 76th codon (in this case adenine). Point 4 — restriction site of the AcsI endonuclease (ApoI)
Фрагмент гена PfCRT является амплифицируемым и содержит один локус, соответствующий сайту рестрикции ApoI, включающему последовательность кодона 76. В случае дикого генотипа плазмодиев амплифицированный фрагмент ДНК (145 bp) разрезается на два фрагмента (98 и 47 bp), а при мутации в 76-м кодоне участок длиной 145 bp остается неизменным. Сконструированная система для выявления мутации (A > C) была протестирована на клиническом материале. При обследовании контрольных проб ложноположительные результаты отсутствовали.
Методика показала способность распознавать различные штаммы P. falciparum, полученные из препаратов крови разных пациентов, что подтверждается клиническими наблюдениями. Это делает разработанную методику потенциальным индикатором лекарственной устойчивости паразитов. Дальнейшее исследование и применение этой системы могут быть полезны в диагностике и контроле эффективности лечения малярийной инфекции (рис. 4).
Рис. 4. Электрофореграмма результатов PCR по выявлению мутации (A > C) в гене PfCRT (эндонуклеаза ApoI) (1 — маркер длин фрагментов; 2–5 — отрицательный контроль; 6–8 — дикий генотип плазмодия (A); 9 — дикий и мутантный генотипы (A > C)
Fig. 4. Electrophoregram of PCR results on detection of mutation (A > C) in PfCRT gene (ApoI endonuclease) (1 — marker of lengths fragment length marker; 2–5 — negative control; 6–8 — wild plasmodium genotype (A); 9 — wild and mutant genotypes (A > C)
Мутация (A > T) (S1034C) в гене PfMDR1 характеризуется заменой первого нуклеотида 1034-го кодона с аденина на тимин. В результате этого изменения аминокислота серин заменяется на цистеин в структуре белка множественной лекарственной резистентности. Белок, содержащий эту мутацию, является компонентом мембраны пищеварительной вакуоли трофозоита P. falciparum [15].
Для идентификации SNP (A > T) предлагается использовать технологию аллель-специфичной ПЦР. Эта технология основана на включении мутантного нуклеотида в последовательность праймера. Длина каждого праймера составляла 21–23 bp, а в 3' конце находились различные варианты анализируемого 1034-го кодона: 5'-GCAGCTTTATGGGGATTC (A/Т)-3'.
В качестве обратных праймеров требуемым критериям отвечали три нуклеотидные последовательности (табл. 1).
Таблица 1. Обратные праймеры, включающие последовательность кодона 1034 Table 1. Reverse primers that include the sequence of codon 1034 | |||
№ | Нуклеотидная последовательность | Размер (bp) | Ампликон (bp) |
1 | 5'-TCCACCATCATCTCTTACATCAA-3' | 23 | 261 |
2 | 5'-ACCTGTTTCTCCAACGATTGC-3' | 21 | 411 |
3 | 5'-TGCAGATCCAGATTGGTTTGA-3' | 21 | 579 |
В качестве оптимального был выбран праймер (23 bp), обеспечивающий амплификацию фрагмента паразитарной ДНК с наименьшей длиной 261 bp (рис. 5).
Рис. 5. Амплифицируемый фрагмент гена PfMDR1. Праймеры, точковая мутация и 1034-й кодон выделены курсивом, жирным шрифтом и подчеркиванием соответственно
Fig. 5. Amplifiable fragment of the PfMDR1 gene. Primers, point mutation and 1034th codon are in italics, bold and underlined, respectively
Таким образом, окончательный набор праймеров включал два прямых аллель-специфичных и один обратный праймер (табл. 2).
Таблица 2. Праймеры для идентификации SNP (A > T) методом аллель-специфичной ПЦР Table 2. Primers for SNP (A > T) identification by allele-specific PCR | |||
Название | Нуклеотидная последовательность | Размер (bp) | Назначение праймера |
S1034C F1 | 5'-TGCAGCTTTATGGGGATTCA-3' | 22 | Прямой для неизмененного (дикого) аллеля |
S1034C F2 | 5'-TGCAGCTTTATGGGGATTCT-3' | 22 | Прямой для мутантного аллеля |
S1034C R | 5'-TGTTGTTGCCTGAGCTGTAGT-3' | 21 | Обратный |
Алгоритм исследования предполагает на первом этапе использование прямого праймера F1. На втором этапе обследуемые пробы вновь амплифицируются, при этом прямой праймер заменяется на F2 соответственно. На каждом из этапов амплификации используется один и тот же обратный праймер (табл. 3).
Таблица 3. Алгоритм использования праймеров на этапах амплификации Table 3. Algorithm of primers use at amplification stages | ||
Этапы | Праймеры | |
прямой | обратный | |
1-й | S1034C F1: 5'-GCAGCTTTATGGGGATTCA-3' | S1034C R: 5'-TGTTGTTGCCTGAGCTGTAGT-3' |
2-й | S1034C F2: 5'-TGCAGCTTTATGGGGATTCT-3' | S1034C R: 5'-TGTTGTTGCCTGAGCTGTAGT-3' |
Бэнд 261 bp появлялся на электофореграмме при использовании праймера F1 в случае дикого генотипа плазмодиев или праймера F2 как признак мутантного аллеля. Обследование препаратов крови больных тропической малярией подтвердило специфичность результатов разработанной системы (рис. 6).
Рис. 6. Электрофореграммы продуктов 1-го этапа аллель-специфичной ПЦР (1, 20 — маркер длин фрагментов; 2–5 — отрицательный контроль; 5–7 и 9 — дикий генотип плазмодия (A); 13, 15, 17–19 — мутантный генотип (T)
Fig. 6. Electrophoregrams of the products of the 1st step of allele-specific PCR (1, 20 — fragment length marker; 2–5 — negative control; 5–7 and 9 — wild plasmodium genotype (A); 13, 15, 17–19 — mutant genotype (T)
Мутация (G > A) (S108N) и связанные с ней изменения в гене PfDHFR. Мутация (G > A) (S108N) является заменой первого нуклеотида в 108-м кодоне гена PfDHFR. Гуанин на этой позиции заменяется на аденин, что приводит к замене серина на аспаргин в полипептиде дигидрофолатредуктазы [16].
Для идентификации мутации (G > A) предлагается использовать RFLP с применением ПЦР. На первом этапе исследования с помощью специфических праймеров производится увеличение количества ДНК-фрагментов, содержащих 108-й кодон гена PfDHFR. Выбор праймеров для амплификации основывался на известной последовательности этого гена[*].
Для специфического участка генома P. falciparum (507 bp), включающего (G > A), была подобрана пара специфических праймеров: S108N-F: 5'-ATGATGGAACAAGTCTGCGAC-3' (21 bp) и S108N-R: 5'-AACAACGGAACCTCCTATAATAAAACATT-3' (29 bp). При выборе рестриктазы для идентификации мутации (G > A) было установлено, что ее последовательность содержит сайт распознавания эндонуклеазы Bse1I. Это подтверждает возможность применения этой эндонуклеазы в рестрикционном анализе для обнаружения мутации (G > A) (рис. 7).
Рис. 7. Результаты PCR-RFLP для выявления S108N в гене PfDHFR с использованием фермента Bse1I (21, 40 — маркер длин фрагментов; 22–24 — отрицательный контроль; 25, 27, 31, 33, 37 — дикий генотип плазмодия (G); 26, 32 — мутантный генотип (A))
Fig. 7. PCR-RFLP results for detection of S108N in PfDHFR gene using Bse1I enzyme (21, 40 — marker of fragment lengths fragments; 22–24 — negative control; 25, 27, 31, 33, 37 — wild plasmodium genotype (G); 26, 32 — mutant genotype (A))
ОБСУЖДЕНИЕ
Анализ полученных данных использовался в целях разработки критериев для оценки и интерпретации результатов исследования биологических образцов, содержащих генетический материал P. falciparum. Анализ электрофоретического разделения фрагментов рестрикции ампликона, содержащего SNP (A > C) гена PfCRT, позволил выявить несколько ключевых показателей. Для определения положительного результата следует обратить внимание на фрагменты размером 145, 98 и 47 bp. Эти фрагменты генетического материала гена PFCRT являются индикаторами присутствия в биологической пробе возбудителей тропической малярии. При этом дикий генотип 76K (лизин) не сопровождается рестрикцией ApoI амплифицируемого фрагмента и проявляется одиночным бендом 145 bp. Мутантный аллель 76T (треонин) проявляется на электрофореграмме двумя бендами (98 и 47 bp), возникающими в результате рестрикции исходного фрагмента амплификации. Генотипу 76K/T (лизин/треонин) соответствуют 3 бенда (145, 98 и 47 bp), что указывает на присутствие в пробе как обычных штаммов P. falciparum, а также штаммов, устойчивых к лекарственным препаратам (рис. 8).
Рис. 8. PCR-RFLP расщепления фрагмента 76 с помощью ApoI
Fig. 8. PCR-RFLP cleavage of fragment 76 using ApoI
Mутация (A > T) (S1034C) гена PfMDR1 может быть выявлена путем обследования крови на наличие ампликона размером 262 bp. Положительный результат электрофореза продуктов первого этапа амплификации свидетельствует о сохранении лекарственной чувствительности паразитов и их неизмененном состоянии (1034S). В случае положительного результата электрофореза продуктов второго этапа амплификации можно говорить о наличии мутации (A > T) и возникновении лекарственной устойчивости у возбудителей (1034C). Если при использовании двух видов прямых праймеров обнаруживаются ампликоны размером 262 bp одновременно (1034S/1034C), это может указывать на наличие в биопробе паразитарных штаммов с различной чувствительностью к лекарственным препаратам. В случае отрицательных результатов в продуктах первого и второго этапов амплификации следует повторить исследование пробы (рис. 9).
Рис. 9. Схемы электрофореза продуктов ПЦР с аллель-специфичными праймерами
Fig. 9. Schemes for electrophoresis of PCR products with allele-specific primers
При анализе образцов крови на наличие мутации (G > A) гена PfDHFR положительным результатом считается обнаружение фрагментов ДНК с размером 507, 323 и 184 bp (рис. 10).
Рис. 10. Cтруктура PCR–RFLP и расщепление амплифицированного фрагмента с помощью Bse1I. 108S — кодон AGC (серин) не соответствует сайту рестрикции, сохраняется одиночный фрагмент 507 bp неизмененный генотип, признак отсутствия резистентности P. falciparum; 108N — кодон AAC (аспаргин), произошла рестрикция, появились фрагменты 323 и 184 bp, признак резистентности P. falciparum; 108S/G — серин/аспаргин (бенды 507, 323 и 184 bp, персистирование обычных штаммов P. falciparum, а также лекарственно устойчивых)
Fig. 10. Structure of PCR–RFLP and cleavage of the amplified fragment using Bse1I. 108S — AGC codon (serine) does not match the restriction site, single fragment 507 bp unaltered genotype is retained, evidence of lack of resistance P. falciparum; 108N — AAC codon (aspargin), restriction occurred, fragments 323 and 184 bp appeared, sign of resistance P. falciparum; 108S/G — serine/aspargin (bends 507, 323 and 184 bp, persistence of common P. falciparum strains as well as of drug-resistant strains)
Появление фрагмента длиной 507 bp на электрофорограмме указывает на наличие дикого (неизмененного) генотипа P. falciparum (108S) и сохранение чувствительности паразитов к лекарственным препаратам. Ампликоны длиной 323 и 184 bp являются признаками мутантного генотипа P. falciparum (108N) и резистентности паразитов к лекарствам. Если на электофорограмме одновременно обнаружены три фрагмента (507, 323 и 184 bp), это указывает на микстинфекцию (108S/G) и наличие в крови как чувствительных к лекарственным препаратам, так и резистентных P. falciparum. Другие варианты электрофореза следует считать ошибочными.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Полученные результаты демонстрирует высокую эффективность разработанных методик. Они могут быть успешно применены для генотипирования плазмодиев P. falciparum, содержащихся в образцах крови пациентов, страдающих тропической малярией. Для выявления плазмодиев P. falciparum со сниженной чувствительностью к препаратам хинолиновой группы используются генетические маркеры, такие как нуклеотидные полиморфизмы PfCRT (K76T) и PfMDR1 (S1034C). Эти маркеры указывают на устойчивость к лечению с помощью хлорохина и мефлохина, а также их производных. Мутация гена PfDHFR (S108N) может служить маркером резистентности возбудителей тропической малярии к производным пириметамина и сульфониламидным препаратам. Обнаружение положительных результатов гаплотипа S108N может свидетельствовать о пониженной чувствительности к пириметамину. Результаты выявления гаплотипов K76T, S1034C и S108N могут быть использованы, например, в ходе эпидемиологического надзора за распространением возбудителей тропической малярии, резистентных к основным противомалярийным препаратам.
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
Источник финансирования. Финансирование данной работы не проводилось.
Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.
Этическая экспертиза. Этическая экспертиза не проводилась, так как статья носит обзорный характер.
Вклад авторов. А.Р. Арюков — разработка методик и написание текста статьи; А.И. Соловьев — анализ литературы и написание текста статьи; А.А. Крутикова — разработка методик и написание текста статьи; В.А. Капацына — анализ и работа с клиническим материалом; А.Н. Коваленко — анализ и работа с клиническим материалом; В.А. Романенко — разработка методик и работа с клиническим материалом; А.А. Колесник — анализ и работа с клиническим материалом; А.C. Зинин — анализ и работа с клиническим материалом. Все авторы внесли существенный вклад в проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.
[*] https://www.ncbi.nlm.nih.gov (NC_004318.2).
Об авторах
Артем Русланович Арюков
Военно-медицинская академия
Автор, ответственный за переписку.
Email: arukov.artem@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8774-5467
аспирант
Россия, Санкт-ПетербургАлексей Иванович Соловьев
Военно-медицинская академия
Email: solopiter@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-3731-1756
докт. мед. наук, профессор
Россия, Санкт-ПетербургВладимир Александрович Капацина
Клиническая инфекционная больница им. С.П. Боткина
Email: ingashi@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8959-0873
заведующий отделением
Россия, Санкт-ПетербургАнна Алексеевна Крутикова
Военно-медицинская академия
Email: anntim2575@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2561-145X
канд. биол. наук
Россия, Санкт-ПетербургВладимир Александрович Романенко
Военно-медицинская академия
Email: izvestiavmeda@mail.ru
Россия, Санкт-Петербург
Александр Николаевич Коваленко
Военно-медицинская академия
Email: ank561@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2976-8051
докт. мед. наук, доцент
Россия, Санкт-ПетербургАким Алексеевич Колесник
Военно-медицинская академия
Email: izvestiavmeda@mail.ru
ORCID iD: 0009-0001-5809-9694
Россия, Санкт-Петербург
Артём Сергеевич Зинин
Военно-медицинская академия
Email: izvestiavmeda@mail.ru
ORCID iD: 0009-0000-4308-7554
Россия, Санкт-Петербург
Список литературы
- Mulenga M.C., Sitali L., Ciubotariu I.I., et al. Decreased prevalence of the Plasmodium falciparum PfCRT K76T and Pfmdr1 and N86Y mutations post-chloroquine treatment withdrawal in Katete District, Eastern Zambia // Malar. J. 2021. Vol. 20, N. 1. P. 329. doi: 10.1186/s12936-021-03859-z
- Hassen J., Alemayehu G.S., Dinka H., Golassa L. High prevalence of PfCRT 76T and Pfmdr1 N86 genotypes in malaria infected patients attending health facilities in East Shewa zone, Oromia Regional State, Ethiopia // Malar. J. 2022. Vol. 21, N. 1. P. 286. doi: 10.1186/s12936-022-04304-5
- Njiro B.J., Mutagonda R.F., Chamani A.T., et al. Molecular surveillance of chloroquine-resistant Plasmodium falciparum in sub-Saharan African countries after withdrawal of chloroquine for treatment of uncomplicated malaria: A systematic review // J. Infect. Public Health. 2022. Vol. 15, N. 5. P. 550–557. doi: 10.1016/j.jiph.2022.03.015
- Yobi D.M., Kayiba N.K., Mvumbi D.M., et al. Assessment of Plasmodium falciparum anti-malarial drug resistance markers in pfk13-propeller, PfCRT and Pfmdr1 genes in isolates from treatment failure patients in Democratic Republic of Congo, 2018–2019 // Malar. J. 2021. Vol. 20, N. 1. P. 144. doi: 10.1186/s12936-021-03636-y
- Shrivastava S.K., Gupta R.K., Mahanta J., Dubey M.L. Correlation of molecular markers, Pfmdr1-N86Y and PfCRT-K76T, with in vitro chloroquine resistant Plasmodium falciparum, isolated in the malaria endemic states of Assam and Arunachal Pradesh, Northeast India // PLoS One. 2014. Vol. 9, N. 8. P. e103848. doi: 10.1371/journal.pone.0103848
- Wang X., Zhang X., Chen H., et al. Molecular determinants of sulfadoxine-pyrimethamine resistance in Plasmodium falciparum isolates from Central Africa between 2016 and 2021: wide geographic spread of highly mutated Pfdhfr and Pfdhps alleles // Microbiol. Spectr. 2022. Vol. 10, N. 5. P. e0200522. doi: 10.1128/spectrum.02005-22
- Amir A., Cheong F.W., De Silva J.R., Lau Y.L. Diagnostic tools in childhood malaria // Parasit. Vectors. 2018. Vol. 11, N. 1. P. 53. doi: 10.1186/s13071-018-2617-y
- Jiang T., Huang Y., Cheng W., et al. Multiple single-nucleotide polymorphism detection for antimalarial pyrimethamine resistance via allele-specific PCR coupled with gold nanoparticle-based lateral flow biosensor // Antimicrob. Agents Chemother. 2021. Vol. 65, N. 3. P. e01063–20. doi: 10.1128/aac.01063-20
- Sharma D., Lather M., Dykes C.L., et al. Disagreement in genotyping results of drug resistance alleles of the Plasmodium falciparum dihydrofolate reductase (Pfdhfr) gene by allele-specific PCR (ASPCR) assays and Sanger sequencing // Parasitol. Res. 2016. Vol. 115, N. 1. P. 323–328. doi: 10.1007/s00436-015-4750-2
- Jiang T., Cheng W., Yao Y., et al. Molecular surveillance of anti-malarial resistance Pfdhfr and Pfdhps polymorphisms in African and Southeast Asia Plasmodium falciparum imported parasites to Wuhan, China // Malar. J. 2020. Vol. 19, N. 1. P. 434. doi: 10.1186/s12936-020-03509-w
- Dalimi A., Mosawi S.H., Fotouhi-Ardakani R., Dalirghafari A. Evaluation of Drug Resistant Genotypes to Fansidar and Chloroquine by Studying Mutation in Pfdhfr and Pfmdr1 Genes in Plasmodium falciparum Isolates from Laghman Province, Afghanistan // Iran J. Parasitol. 2022. Vol. 17, N. 1. P. 18–27. doi: 10.18502/ijpa.v17i1.9012
- Cheng W., Song X., Zhu H., et al. A rapid and specific genotyping platform for Plasmodium falciparum chloroquine resistance via allele-specific PCR with a lateral flow assay // Microbiol. Spectr. 2022. Vol. 10, N. 2. P. e0271921. doi: 10.1128/spectrum.02719-21
- Sambrook J., Russell D.W. Purification of nucleic acids by extraction with phenol: chloroform // Cold Spring Harbor Protocols. 2006. Vol. 2006, N. 1. P. pdb. prot4455. doi: 10.1101/pdb.prot4455
- Lakshmanan V., Bray P.G., Verdier-Pinard D., et al. A critical role for PfCRT K76T in Plasmodium falciparum verapamil-reversible chloroquine resistance // EMBO J. 2005. Vol. 24, N. 13. P. 2294–2305. doi: 10.1038/sj.emboj.7600681
- Anderson T.J., Nair S., Qin H., et al. Are transporter genes other than the chloroquine resistance locus (PfCRT) and multidrug resistance gene (pfmdr) associated with antimalarial drug resistance? // Antimicrob. Agents Chemother. 2005. Vol. 49, N. 6. P. 2180–2188. doi: 10.1128/aac.49.6.2180-2188.2005
- Wernsdorfer W.H., Noedl H. Molecular markers for drug resistance in malaria: use in treatment, diagnosis and epidemiology // Curr. Opin. Infect. Dis. 2003. Vol. 16, N. 6. P. 553–558. doi: 10.1097/01.qco.0000104295.87920.fd
Дополнительные файлы
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).