培养的人脐带粘膜结缔组织（Wharton）细胞群的免疫表型

全文:

В настоящее время в литературе приводятся различные методы выделения и культивирования мезенхимальных стволовых клеток (МСК), а также их использования в клинике [1]. Установлено, что трансплантация МСК стимулирует регенерацию костной ткани, кожи, миокарда, периферической нервной системы, скелетной мускулатуры, тканей печени, а также МСК служат источником факторов роста и цитокинов [2]. Определяющим аспектом, играющим важную роль при выборе искусственного биомедицинского материала, является влияние имплантата на процессы регенерации поврежденных тканей реципиента, его иммуномодулирующие свойства [3]. На фоне множества существующих способов замещения дефектов при посттравматических повреждениях все более широкое распространение в медицинской практике получают методы репарации поврежденных тканей, основанные на способах, предполагающих использование продуктов тканевой инженерии и культур искусственно культивируемых клеток человека [4]. В этом случае преимущество в использовании имеют собственные ткани пациента либо ткани, обладающие слабой иммуногенностью. В ряде публикаций сообщается о слабой иммуногенной активности тканей пуповины человека [5]. В связи с этим перспективной для получения МСК является слизистая соединительная ткань пуповины человека (ССТПЧ, альтернативное название — вартонов студень, Wharton’s jelly). Существует большое количество литературных данных о подобном способе применения ССТПЧ и других тканей пуповины, в связи с чем существует необходимость в их систематизации и выборе оптимальных вариантов лабораторных и технологических решений для воспроизводимого культивирования МСК [6, 7]. Слизистая соединительная ткань пуповины человека предложена рядом исследователей в качестве альтернативного источника МСК. Поскольку ССТПЧ является тканью провизорного органа — пуповины, работа с этим объектом регламентирована минимальными этическими ограничениями, а получение эксплантов из ССТПЧ производится неинвазивным методом [8]. Получение таких эксплантов связано с диссекцией ткани, окружающей вену и артерию пуповины, и это может быть причиной эксплантации, наряду с ССТПЧ, фрагментов тканей другого типа и получения клеток, имеющих иной, чем МСК, статус. В связи с возможными ошибками при отборе экспланта и трансформации клеток в процессе культивирования, необходимо достоверное определение фенотипа клеток, полученных в результате эксплантации ткани и при дальнейшем их культивировании. Международным обществом по клеточной терапии определен иммунофенотип МСК, определяемый как CD90+; CD105+; CD44+; CD29+; CD105+; CD73+; CD166+; CD45–; CD34– [9]. Наиболее эффективным является флуоресцентный метод определения характеристичных белков поверхности клетки [10]. В нашей работе проведено определение поверхностных маркеров CD45, CD73, CD34, CD29, CD90, CD44, CD105 и оценка наличия клеток мышечной ткани сосудов по присутствию специфического маркера цитоскелета альфа-актина в популяции клеток, полученных из ССТПЧ.

Цель исследования — выявление мезенхимальных стволовых клеток в клеточной популяции, полученной из слизистой соединительной ткани пуповины человека с использованием иммуноферментного маркирования.

Задачи исследования:

1) для доказательства отсутствия гладкомышечных клеток сосудов в полученной культуре провести иммуногистохимическое окрашивание на наличие гладкомышечного актина (a-Smooth muscle actin) в цитоскелете клеток изучаемой популяции;

2) методом проточной цитофотометрии и прямым наблюдением флуоресценции на поверхности клеток при микроскопировании протестировать полученную клеточную популяцию на наличие мезенхимальных стволовых клеток с использованием поверхностных маркеров CD45, CD73, CD34, CD29, CD90, CD44, CD105.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение популяции клеток ССТПЧ

Получение первичного материала пуповины человека обеспечивалось сотрудниками кафедры акушерства и гинекологии Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова. Материал нативной пуповины человека получали, как правило, в процессе операции планового кесарева сечения. Анамнез доноров первичного материала фиксировался и хранился сотрудниками кафедры. От донора материала получали информированное согласие. Отбор первичного материала для дальнейшей обработки и получения фрагментов ткани для эксплантации проводили непосредственно в родовом зале с соблюдением правил асептики. Материал пуповины без обескровливания помещали в транспортную среду сразу после отделения от плаценты. В качестве транспортной среды использовали стандартный стерильный 0,9 % раствор хлористого натрия, помещенный в стерильный контейнер [11]. Транспортировка материала осуществлялась при температуре окружающей среды. Материал пуповины транспортировался в стерильное помещение Научно-исследовательской лаборатории клеточных технологий Научно-исследовательского отдела медико-биологических исследований Научно-исследовательского центра, где в стерильных условиях проводилось извлечение ССТПЧ и получение первичных эксплантов.

Для культивирования эксплантов использовали среду DMEM F/12, которая успешно применялась в наших предыдущих исследованиях для получения культуры клеток из ткани пуповины человека [11].

Иммунофенотипирование полученной популяции клеток и иммуногистохимическая детекция гладкомышечного актина

Для выявления гладкомышечных клеток сосудов в полученной культуре провели иммуногистохимическое окрашивание на наличие в цитоскелете гладкомышечного актина a-Smooth muscle actin (SMA). Использовали первичные антитела Monoclonal Mouse Anti-Human Smooth Muscle Actin (Dako, Дания), вторичные антитела, конъюгированные с флуорохромом AlexaFluor 488 (Abcam, Англия), докрашивание ядер производили средой для заключения препаратов SlowFade Glass Soft-set Antifade Mountant с DAPI-Nuclear (Invitrogen, США). Исследование проводили на конфокальном микроскопе LSM 880 (Carl Zeiss, Германия). Флуоресценцию возбуждали лазером с длиной волны 405 нм, с детекцией 410–495 нм и аргоновым лазером с длиной волны 488 нм, с детекцией 495–605 нм. В качестве положительного контроля антител использовали клетки миометрия крысы, полученные методом эксплантации из биоптатов матки крысы.

У клеток пуповины популяции МСК изучали экспрессию поверхностных маркеров стволовых клеток. Иммунофенотипирование проводили на проточном цитофлуориметре CytoFlex (Beckman Coulter, США). В качестве меток использовали антитела, меченные фикоэритрином (PE) или флуоресцеином (FITC): CD45-FITC, CD73-PE, CD34-PE, CD29-FITC, CD90-FITC, CD44-FITC, CD105-FITC (Bio Rad, США). Для этого клетки с поверхности культурального пластика снимали общепринятым способом (раствором трипсина–версена в соотношении 1 : 3), трижды отмывали фосфатным буферным раствором (рН 7,2–7,4), затем смешивали с разведенным (×20) раствором для разбавления антител, состоящим из 20 мкл фетальной бычьей сыворотки (Gibco), 10 мг NaN₃ и 50 мл фосфатного буфера. Полученная суспензия клеток вводилась в измерительные пробирки цитофлуориметра, пробирки размещались в автосемплере цитофлуориметра, далее измерения флуоресценции и обработка полученных сигналов производились автоматически. Для прямого наблюдения флуоресценции на поверхности клеток использовали флуоресцентный микроскоп AxioImager M2 (Carl Zeiss, Германия).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

При иммуноцитохимическом исследовании наличия в цитоплазме специфического маркера цитоскелета альфа-актина не выявлено, отмечалось появление автофлуоресценции. Специфического окрашивания цитоскелета, характерного для гладкомышечных клеток, в исследуемых популяциях клеток из ССТПЧ получено не было (рис. 1, В). В качестве положительного контроля SMA была окрашена популяция клеток миометрия крысы (рис. 1, Г).

 

Рис. 1. Культура МСК: А, Б — окрашивание гематоксилином и эозином; В — иммуноцитохимическое окрашивание на наличие гладкомышечного альфа-актина в цитоскелете клеток, полученных из пуповины; Г — окрашенные клетки миометрия крысы

Fig. 1. MSC culture: А, Б — staining with haematoxylin and eosin; В — immunocytochemical staining for the presence of smooth muscle a-actin in the cytoskeleton of cells obtained from umbilical cord, Г — stained rat myometrial cells

 

Экспрессия поверхностных маркеров мезенхимальных клеток изучена путем иммунофенотипирования на проточном цитофлуориметре CytoFlex (Beckman Coulter, США). Для проверки эффективности конъюгации использованных антител, меченных фикоэритрином CD73-PE, CD34-PE и флуоресцеином CD45-FITC, CD29-FITC, CD90-FITC, CD105-FITC, снятые с поверхности культурального пластика и конъюгированные с антителами клетки помещали на предметные стекла и просматривали в эпифлуоресцентный микроскоп с использованием светофильтров FITC (зеленая область спектра — для антител, меченных флуоресцеином) и TRITC (красная область спектра — для антител, меченых фикоэритрином) при увеличении ×400, проводя фотофиксацию в аддитивном режиме. Результаты приведены на рис. 2.

 

Рис. 2. Результаты иммунофлуоресцентного мечения поверхностных антигенов (СD) мезенхимных клеток слизистой соединительной ткани пуповины человека. А — мезенхимальная клетка до мечения; Б, В, Г — имиджи клеток, меченых различными антителами: Б — отсутствие конъюгации с антителом (контрастирование DAPI); В, Г — наличие конъюгации с меченым антителом

Fig. 2. Results of immunofluorescence labelling of surface antigens (SD) of mesenchymal cells of human umbilical cord Warton’s stool tissue. А — mesenchymal cell before labelling; Б, В, Г — images of cells labelled with different antibodies: Б — absence of conjugation with antibody (DAPI contrasting); В, Г — presence of conjugation with labelled antibody

 

Нахождение клеток в растворах для снятия клеток с поверхности культивирования, конъюгация клеток с мечеными антителами и получение препаратов для микроскопии не приводят к разрушению большинства исследуемых мезенхимальных клеток пуповины человека. На рис. 2, А приведены имиджи исходной немеченой клетки в состоянии суспензии и клетки, позитивно конъюгирующие с флуоресцентно-мечеными антителами (рис. 2, В, 2, Г) и негативно конъюгирующие (неконъюгирующие) с мечеными антителами (рис. 2, Б). Локализацию флуоресцентно-меченых антител наблюдали на поверхности исследуемых клеток. Для получения изображения клеток, негативно конъюгирующих с мечеными антителами, их контрастировали DAPI после конъюгации с антителами.

Далее суспензия меченых клеток помещалась в пробирки диспенсера цитофлуориметра, и производился учет распределений поверхностных маркеров в оцениваемой популяции клеток. Результаты распределения поверхностных маркеров полученной культуры МСК представлены на рис. 3.

 

Рис. 3. Распределение поверхностных маркеров в полученной популяции МСК пуповины человека: А — CD34, CD44; Б — CD45, CD73; В — CD29, Г — CD90; Д — CD105

Fig. 3. Distribution of surface markers in the obtained population of human umbilical cord MSCs: А — CD34, CD44; Б — CD45, CD73; В — CD29, Г — CD90; Д — CD105

 

Положительная реакция выявлена на маркер 5-нуклеотидазы CD73 (55,61 %), маркер белков-интегринов CD29 (41,11 %), маркеры стволовых клеток и аксональных процессов в зрелых нейронах CD90 (6,45 %), маркер рецептора гиалуроновой кислоты CD44 (55,62 %), эндоглина CD105 (0,52 %). Негативная реакция выявлена на маркер общего лейкоцитарного антигена CD45 (24,59 %).

В литературе сообщается, что проточная цитометрия, иммунофлуоресценция и qRT-PCR-анализ показывают преобладающую экспрессию поверхностных маркеров CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 и CD166 в МСК пуповины, в то время как маркеры эндотелиальных клеток и клеток кроветворения отсутствуют [9, 10]. Экспрессия CD29, CD90, CD105 и CD166 сохраняется в МСК даже после адипогенной, остеогенной и хондрогенной индукции [9]. Сообщается также о снижении экспрессии CD44 и CD73 в ответ на индукцию трехлинейной дифференцировки [10]. Это позволяет предположить, что они являются наиболее надежными маркерами стволовых клеток, наблюдающихся только в недифференцированных МСК пуповины [8, 9]. Обнаруженная положительная реакция на поверхностные маркеры CD73 и CD44 свидетельствует о том, что в культуре, полученной нами методом экспланта, преобладали стволовые клетки. Кроме того, выявленная экспрессия маркера белков адгезии клеток системы кроветворения CD34 (27,19 %) указывает на наличие в составе полученной популяции гемопоэтических клеток.

ВЫВОДЫ

1. Соотношение примененных маркеров позволяет отнести популяцию клеток, полученную методом прямой эксплантации фрагментов ССТПЧ, к популяции мезенхимальных стволовых клеток.
2. Визуальный контроль и проточная цитофотометрия подтвердили локализацию меченых антител на поверхности культивируемых клеток.
3. Иммуногистохимическое окрашивание на наличие гладкомышечного актина (a-Smooth muscle actin) не выявило гладкомышечных клеток сосудов в полученной культуре клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате экспериментов по идентификации клеток, полученных при эксплантации фрагментов ССТПЧ и дальнейшего их культивирования, методом иммунофлуоресцентной цитофотометрии установлена их принадлежность к мезенхимальным стволовым клеткам. Показано, что в полученной культуре отсутствуют мышечные клетки сосудов. Установлено, что в составе полученной популяции находятся гемопоэтические клетки — клетки системы кроветворения, но преобладают недифференцированные стволовые клетки. Получение культуры клеток человека с преобладанием идентифицируемых стволовых клеток при использовании ткани провизорного органа позволяет применять метод изъятия МСК и извлеченные этим методом клетки в широком спектре исследований физиологии и биохимии человека с минимальными этическими ограничениями.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Финансирование. Поисково-аналитическая работа выполнена в рамках научно-исследовательской работы VMA.02.06.2022/026 «Эксплант».

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Этическая экспертиза. Проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом ФГБВОУ ВО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ (протокол № 230 от 17.12.2019).

Участие авторов. В.Е. Чернов — получение, поддержание культуры клеток, текст статьи; М.О. Соколова — получение результатов экспериментов по распределению поверхностных CD-маркеров популяции клеток, текст статьи; А.А. Кокорина — иммуноцитохимическая оценка наличия специфического маркера цитоскелета альфа-актина в популяции клеток методом конфокальной микроскопии; Г.И. Пендинен — визуальная оценка и фотофиксация иммунофлуоресцентного мечения поверхностных антигенов (СD) мезенхимных клеток ткани вартонова студня методом флуоресцентной микроскопии, редактирование текста статьи.

作者简介

Vladimir E. Chernov

Military Medical Academy

编辑信件的主要联系方式.
Email: vmeda-nio@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2440-3782
SPIN 代码: 8315-1161

Cand. Sci. (Biology)

俄罗斯联邦, Saint Petersburg

Margarita O. Sokolova

Military Medical Academy

Email: vmeda-nio@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3457-4788
SPIN 代码: 3683-6054
俄罗斯联邦, Saint Petersburg

Arina A. Kokorina

Military Medical Academy

Email: arina.alexandrovna.vmeda-nio@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6783-3088
SPIN 代码: 9371-3658
俄罗斯联邦, Saint Petersburg

Galina I. Pendinen

N.I. Vavilov All-Russian Institute of Plant Genetic Resources

Email: pendinen@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2814-7074
SPIN 代码: 2120-5925

Cand. Sci. (Biology)

俄罗斯联邦, Saint Petersburg

参考

补充文件