ЭКСПРЕССИЯ OCT-4, P53, P16 И KI67 ПРИ ВПЧ-АССОЦИИРОВАННОМ ПРЕДРАКЕ И РАКЕ ШЕЙКИ МАТКИ

Полный текст

Введение Рак шейки матки (РШМ) является наибо- лее распространенной формой онкологической патологии репродуктивной системы женщин, занимающей 7-е место среди всех злокачествен- ных опухолей и 3-е место среди карцином [1]. Вирус папилломы человека (ВПЧ) в настоящее время признается в качестве этиологического фактора этого новообразования и обнаружива- ется в 98% случаев РШМ [2]. Согласно современной концепции канцеро- генеза полагают, что опухоль обычно возникает в зонах активных регенераторных процессов, в области ниш стволовых клеток (НСК) из транс- формированных тканевых стволовых клеток или путем перепрограммирования трансфор- мированных клеток очагов предраковых изме- нений [3, 4, 5]. В шейке матки НСК соответ- ствует зоне трансформации [6]. Остается откры- тым вопрос о роли стволовой тканевой и стволо- вой раковой клетки в канцерогенезе рака шейки матки. Полагают, что мутантный ген-супрессор рака p53 играет важную роль в развитии плоскокле- точного рака шейки матки и может использо- ваться для его диагностики [7, 8].Кроме того, онкобелок E6 ВПЧ связывается с диким типом p53 и инактивирует его [9]. В результате чего, клетки с поврежденным геномом не отправля- ются в апоптоз, сохраняются, дают потомство, что ведет к накоплению мутаций в клетках и их злокачественной трансформации [10, 11]. Ранее нами были описаны сфероид- ные эпителиально-мезенхимальные струк- туры (СЭМС), обнаруживаемые в пласте пло- ского эпителия по экспрессии маркера эмбри- ональных стволовых клеток Oct-4 при ВПЧ- ассоциированной патологии шейки матки, включая предрак и плоскоклеточный рак [12]. Как было установлено, СЭМС формируются в зоне НСК, при этом их клетки обладают про- лиферативной активностью. Часть сферо- идов не имеют признаков клеточного ати- пизма, экспрессируют только Ki-67, не содер- жат р16 и были названы нами репаратив- ными сфероидами [12], в то время как дру- гие построены из атипичных клеток и экспрес- сируют и Ki-67 и p16, за что получили назва- ние опухолевых сфероидов [12]. Данные об экс- прессии р53 в СЭМС в доступной литературе отсутствуют. Целью исследования явилось изучение экспрессии p53, Oct-4, p16 и Ki-67, в репара- тивных и опухолевых сфероидах при ВПЧ- ассоциированной патологии шейки матки: хро- нический цервицит, цервикальная интраэпи- телиальная неоплазия < II степень (ЦИН<II), цервикальная интраэпителиальная неоплазия ≥ II степень (ЦИН≥II), а также при микроинва- зивной плоскоклеточной карциноме. Материалы и методы исследования Проведено клинико-морфологическое и им- муногистохимическое исследование биопсий- ного материала, полученного от 61 пациентки репродуктивного возраста, проходивших обсле- дование и лечение в ФГБУ «Научный центр аку- шерства, гинекологии и перинатологии им. ака- демика В.И. Кулакова» Минздрава РФ за 2013- 2015 год. Обследованные женщины были в воз- расте от 17 до 56 лет (средний возраст 36,5 лет). Всем женщинам проводили ВПЧ-тестирование цервикального содержимого, полученного при заборе цитологического материала, на приборе Cobas 4800 методом ПЦР-НВ, представляющем собой полностью автоматизированную систему, выдающую результат по трем отдельным кана- лам: индивидуально ДНК ВПЧ16, ДНК ВПЧ18 и общий пул ДНК других 12 высокоонкогенных генотипов ВПЧ (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68) [13, 14]. Во всех образцах получили положительные результаты, причем ДНК ВПЧ 16 типа обнаружена в 19 случаях (31,15%), ДНК ВПЧ 18 типа в 4 случаях (6,55%), ДНК ВПЧ других 12 высокоонкогенных типов в 38 слу- чаях (62,30%). Все женщины были разделены на 4 группы в зависимости от патологического процесса в шейке матки: хронический цервицит (15), ЦИН<II (12), ЦИН≥II (25), микроинвазивный рак шейки матки (9). Биопсийный мате- риал был представлен соскобами цервикального канала, биоптатами шейки матки в случаях хро- нического цервицита и ЦИН<II, а также опера- ционным материалом (резецированные конусы шейки матки) при ЦИН≥II и микроинвазив- ном раке. Ткань фиксировали в 10% нейтраль- ном формалине, заливали в парафин и готовили серийные парафиновые срезы, которые окраши- вали гематоксилином и эозином и инкубиро- вали в ретривере для восстановления антиген- ности тканей. Ставили иммуногистохимические реакции с использованием моноклонных анти- тел к Oct-4 (MRQ-10, 309M-15,CELL MARQUE CORPORATION), p53 (RTU, клон DO-7 RTU, N158187-2, DAKO), и антител для двойной окра- ски p16/Ki67 (CINtec PLUS cytology kit, Рош). Докрашивание ядер осуществлялось гематокси- лином и эозином. Ставились положительные и отрицательные контрольные реакции. Резуль- таты реакций оценили в процентах окрашенных эпителиальных клеток из расчета на 300 клеток. Для статистического анализа применялся непа- раметрический метод для малых выборок по Манну-Уитни. Результаты и их обсуждение При гистологическом исследовании биоп- татов шейки матки морфологический диагноз хронического ВПЧ-ассоциированного церви- цита ставился при обнаружении лимфогисти- оцитарной инфильтрации подслизистого слоя, лейкопедеза в эпителиальном пласте, явлении акантоза, очаговой плоскоклеточной метапла- зии и койлоцитоза. При ЦИН < II и ЦИН ≥ II, также выявля- лись признаки хронического воспаления с кой- лоцитозом в сочетании с появлением атипич- ных клеток, распространяющихся не более чем на 1/3 толщины плоского эпителия при ЦИН < II и более 2/3 толщины эпителия при ЦИН ≥ II. Микроинвазивный плоскоклеточный рак отли- чался наличием разрушения базальной мем- браны с микроинвазией раковых клеток в под- слизистый слой на глубину менее 3 мм. СЭМС идентифицированы при исполь- зовании имуногистохимической реакции на Oct-4, который экспрессируется во всех клет- ках сфероидов. В среднем данный маркер опре- деляется в эпителии шейки матки при хрони- ческом цервиците в 13.5% клеток, при ЦИН < II в 33.5% клетках, при ЦИН ≥ II в 43.75% клеток и при микроинвазивном раке в 48.5% клеток. При гистологическом исследовании выяв- ляли 3 типа СЭМС: 1тип небольших разме- ров, построенные из крупных эпителиальных клеток типа базальных, в центре, как правило, можно быть увидеть кровеносный сосуд; 2 тип более крупных размеров, построенные из кле- ток с признаком атипизма, часто не имеющие сосудов; 3 тип крупные и сливающиеся между собой, образованные резко атипичными рако- выми клетками. При хроническом цервиците обнаруживались СЭМС 1 типа, при ЦИН < II - преобладали СЭМС 1 типа в сочетании с СЭМС 2 типа, при ЦИН ≥ II - СЭМС 2 типа, а при микроинвазивной карциноме - СЭМС 3 типа (в окружающей ткани с морфологией ЦИН<II и ЦИН≥II обнаруживались также СЭМС 2 типа). При двойной окраске p16/Ki67 СЭМС 1 типа содержали клетки, экспрессирующие только Ki67, что наблюдалось при хроническом церви- ците. В СЭМС 2 типа клетки экспрессировали одновременно оба маркера. При этом одновре- менная экспрессия p16/Ki67 определялась в 7.5% клеток СЭМС при ЦИН<II, и в 72,5 % кле- ток СЭМС при ЦИН≥II, а при микроинвазивной карциноме в 55% (Рис.1). p53 не обнаруживался в СЭМС 1 типа (Рис. 2 А, Б), выявлялся в 10% клеток СЭМС 2 типа (Рис. 2С) и в 70% клеток СЭМС 3 типа (Рис. 2Д.). В целом в эпителиальном пласте маркер не определялся при хроническом цервиците и при ЦИН<II, при ЦИН≥II в 7.5% клеток, а при микроинвазивном раке в 52.5% всего эпители- ального пласта. Таким образом, на основании всех получен- ных данных и данных литературы [8, 12], было установлено, что процесс канцерогенеза в шейке матки связан с формированием СЭМС, кото- рые могут быть разделены на 3 типа в соответ- ствии с иммунофенотипом, участием в репара- тивных СЭМС процессах и опухолевом росте: репаративные, не экспрессирующие р16 и р53, неопластические, экспрессирующие р16 и р53 в единичных клетках, и раковые СЭМС с высокой экспрессией клетками р16 и р53. В результате проведенного исследова- ния установлено, что высокая экспрессия р53 (70,0%) позволяет проводить дифференциаль- ный диагноз между ЦИН≥II и микроинвазив- ным раком шейки матки, что совпадает с дан- ными других авторов. Согласно работам Wang [8], Alan Storey [15], при злокачественной трансформации, экспрессия белка p53 увели- чивается. Нами получены новые данные о том, что р53 положительные клетки сосредоточены в основном в СЭМС 2 типа (10%) и в большей степени в СЭМС 3 типа (70%), относящихся к раковым СЭМС. Последнее может быть косвен- ным подтверждением развития злокачественной трансформации в клетках с признаками стволо- вости, экспрессирующих Oct-4, р16 и Ki-67. Выводы При патологии шейки матки на фоне ВПЧ инфекции обнаруживаются репаративные, нео- пластические и раковые СЭМС, участвующие в репаративных процессах и в опухолевом росте. Репаративные СЭМС встречаются при хроническом цервиците и ЦИН<II, имеют мор- Рис. 1. Экспрессия разных маркров в сфероиде на фоне ВПЧассоциированной патологии шейки матки. Рис. 2. Экспрессия p53 в СЭМС A B при ВПЧассоциированной патологии шейки матки, иммунопероксидазная реакция, Х600. Отсутствие экспрессии p53 в клетках репаративных СЭМС при хроническом ВПЧассоциированном цервиците. Отсутствие экспрессии p53 в клетках репаративных СЭМС при ЦИН < II. C D C. Экспрессия p53 в единичных клетках неопластических СЭМС при ЦИН  II. D. Экспрессия p53 в клетках раковых СЭМС при ВПЧассоциированной микроинвазивной карциноме шейки матки. фологические особенности: небольшие размеры, всегда формируются вокруг сосудов, построены из клеток типа базальных кератиноцитов, кле- точный атипизм отсутствует, в клетках сферо- идов имеется экспрессия Ki-67 при отсутствии экспрессии p16, отсутствует экспрессия p53. Неопластические СЭМС встречаются при ЦИН < II, ЦИН ≥ II и в окружающей ткани при плоскоклеточном раке шейки матки, имеют большие размеры, формируются вне зависи- мости от сосудов, построены из эпителиальных клеток с признаками атипии или из рако- вых клеток, отличаются высокой экспрессией Ki-67,p16, а также содержат p53. Целесообразно выделять также и раковые СЭМС, отличающиеся от неопластических не только более крупными размерами, но и тенден- цией к слиянию, а также высокой экспрессией p53. Экспрессия онкомаркеров p53, p16 и Ki67 может быть использована в ранней дифферен- циальной диагностике предрака и плоскокле- точного рака шейки матки.

Об авторах

Евгения Александровна Коган

ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова

д.м.н., профессор, заведующая кафедрой патологической анатомии ГБОУ Первый медицинский университет им. И.М.Сеченова

Дьзя Дзинь Ли

ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова

Нафиса Мануваровна Файзулина

ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава России

Андрей Владимирович Козаченко

ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава России

Список литературы

Дополнительные файлы