ВЛИЯНИЕ САХАРНОГО ДИАБЕТА НА АКТИВНОСТЬ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ И ЭКСПРЕССИЮ SERCA2A В КАРДИОМИОЦИТАХ И ИХ ВЗАИМОСВЯЗЬ С ИНОТРОПНЫМИ РЕАКЦИЯМИ МИОКАРДА БОЛЬНЫХ ИБС

Полный текст

Введение В настоящее время увеличилась частота сочетанного развития ишемической болезни сердца (ИБС) и сахарного диабета (СД). Сахарный диабет вносит существенный вклад в развитие расстройств энергетического метаболизма в миокарде [1, 2]. Это ведёт к усугублению нарушения процесса электромеханического сопряжения в кардиомиоцитах [3]. Хорошо известно, что обратный захват ионов кальция во время диастолы осуществляется благодаря функционированию Са2+-АТФ-азы (SERCA2a) сарко-плазматического ретикулума (СР). Эффективность работы этого белка во многом определяется доступностью энергетических субстратов [3]. Опубликованы данные о снижении экспрессии и/или активности Са2+-АТФ-азы СР как при ишемичес-кой болезни сердца [4, 5], так и при сахарном диабете [6, 7]. Однако явно недостаточно данных о сопряжении энергетического метаболизма и уровня Са2+-транспортирующих белков с функциональной состоятельностью кардиомиоцитов при сочетанном развитии ИБС и сахарного диабета. Целью работы было изучить активность ферментов, участвующих в энергообеспечении миокарда, уровень экспрессии Са2+-АТФ-азы СР и оценить их связь с зависимостью интервал -сила миокарда человека при ИБС, сочетанной с сахарным диабетом 2 типа. Материалы и методы Работа одобрена Комитетом по биомедицинской этике НИИ кардиологии и проведена в соответствии с Хельсинской декларацией (1989). Все пациенты дали информированное согласие на проведение исследования. Сформировано 2 группы пациентов. В 1 группу включены 13 пациентов с диагнозом хроническая ишемическая болезнь сердца (ИБС), стенокардия напряжения III-IV класса по NYHA. Во 2 группу включили 23 пациента с ИБС (стенокардия напряжения III-IV класса по NYHA), ассоциированной с сахарным диабетом 2 типа (СД2). Длительность заболевания СД2 составляла на момент исследования 1-3 года, а значение гли-кированного гемоглобина (HbA1C) составляло 7,6%. Фракция выброса левого желудочка всей когорты пациентов была 49,0+17,3%, а средний возраст составлял 50,6+2,4 лет. Пациенты обеих групп получали оптимально подобранную терапию, а пациенты 2-й группы дополнительно наблюдались у эндокринолога. В работе использовали биопсийный материал сердца (фрагмент ушка правого предсердия), который иссекали при подключении аппарата искусственного кровообращения во время плановых операций коронарного шунтирования. Из каждого фрагмента выделяли по 2 трабекулы с поперечным сечением 0,5 - 0,7 мм и длиной 5 мм, а остальная часть была использована для биохимических и гистохимических исследований. Подготовленную мышцу помещали в термостабилизированную (36°С) проточную камеру (1 мл) (Scientific Instruments GmbH, Германия). Суперфузию мышц осуществляли раствором Кребса-Хензеляйта оксигенированным карбогеном (О2 - 95%, СО2 - 5%). Сократительную активность мышц регистрировали в изометрическом режиме, используя датчик Force transducer (Scientific Instruments GmbH, Германия). Оценивали напряжение, развиваемое мышцей в пересчете на площадь поперечного сечения мышцы (мН/ мм2). Стимуляцию мышц проводили электрическими импульсами прямоугольной формы длительностью 5 мс с частотой 0,5 Гц. Перед началом исследования мышцы адаптировали к условиям перфузии в течение 60 мин. Кривые одиночного цикла сокращение-расслабление мышц записывали и обрабатывали при помощи программы “MUSCLEDATA” (Scientific Instruments GmbH, Германия). Исследовали инотропную реакцию изолированного миокарда при выполнении теста «Post-rest». Этот тест позволяет оценить способность СР аккумулировать ионы кальция [8]. Для выполнения теста, на 4-60 секунд (периоды покоя) прекращали электрическую стимуляцию мышц [8]. Отроили кривую механической реституции как зависимость между амплитудой первого после периода покоя сокращения и длительностью этих периодов. Определение уровня экспрессии Са2+-АТФ-азы СР (SERCA2a) проводили методом иммуно-блоттинга. Белки разделяли в ПААГ и переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Sigma), с последующей инкубацией с первичными моноклональными антителами специфичными к белку SERCA2a (Sigma) и вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (Sigma). Для детекции белков использовали BCIP/NBT (Sigma). Количество общего белка в образце определяли в ультрафиолетовом свете (280 нм) на спектрофотометре (NanoVueTM, Thermo Fisher Scientific, Финляндия). Клиническая практика № 4, 2017 http://clinpractice.ru 57 Оригинальные исследования Гистохимические исследования выполняли на срезах толщиной 10 мкм, полученных на криостате. Количественную оценку активности ферментов сукцинатдегидрогеназы (СДГ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) производили на микроскопе Axioskop 40 (Zeiss, Германия) в проходящем свете с длиной волны 546 нм [9]. Оптическую плотность измеряли не менее чем в 50 кардиомиоцитах каждого среза. Результаты представлены как M+SEM и Me (25-й процентиль; 75-й процентиль). Для выявления в группах однородных данных использовали метод кластерного анализа. Достоверность различий оценивали по непараметрическому критерию U Манна-Уитни. Результаты исследований и их обсуждение Определение активности метаболических ферментов показало, что ключевой фермент гликолиза ЛДГ был в 3 раза активнее (p<0.05) в миокарде пациентов 1 группы (рис.1). Активность СДГ (основной фермент аэробного синтеза АТФ цикла Кребса), также была выше в биоптатах 1 группы (в 1,8 раза, p<0.05). Это согласуется с представлениями о том, что при ишемических воздействиях в кардиомиоцитах повышается уровень гликолитического энергообразования, а СД, наоборот, подавляет окисление углеводов [10]. При оценке содержания SERCA2a в обеих группах были обнаружены пациенты с высоким и низким уровнем этого белка. Методом кластерного анализа мы выявили подгруппы пациентов с условно «высоким содержанием», и условно «низким содержанием» SERCA2a (рис.2). В 1 группе «высокое содержание» SERCA2a (15,32+1,2 ед/ мг белка) было выявлено у 7 пациентов, а «низ кое содержание» (4,53+1,01 ед/мг белка) у 6 пациентов. Во 2-й группе «высокое содержание» (20,87+2,22 ед/мг белка) обнаружено у 11 пациентов, а у остальных «низкое содержание» SERCA2a (7,05+ 0,92 ед/мг белка). При рассмотрении подгрупп пациентов с «высоким содержанием» SERCA2a оказалось, что в миокарде пациентов 1 группы содержание SERCA2a определялось на 27% (р<0,05) меньше, чем у пациентов 2 группы (рис. 2). В подгруппе пациентов с «низким содержанием» SERCA2a мы не выявили значимой разницы, но имелась тенденция к более высокому содержанию SERCA2a у пациентов 2 группы. Известно, что в диастолу SERCA2a осуществляет обратный захват Са2+ в СР кардиомиоци-тов. Благодаря преобладанию работы SERCA2a СР над Na+-Ca2+-обменником сарколеммы в интактном миокарде реализуется потенцирующий эффект теста «Post-rest» [6]. Мы обнаружили, что и в 1-й и во 2-й группах, реакция на тест «Post-rest» может быть 2-х типов (рис.3). Первый тип (I тип) инотропной реакции характеризовался тем, что инотропная реакция в ответ на периоды покоя либо оставалась на уровне базовых сокращений (1 группа пациентов), либо превышал их (2-я группа пациентов). При втором типе (II тип) инотропной реакции, с увеличением длительности периодов покоя, амплитуда сокращений значительно снижалась относительно базовых сокращений. При этом I тип инотропного ответа наблюдался у пациентов с высоким уровнем SERCA2a, а II тип - с низким содержанием белка. Поскольку в наших исследованиях I-й тип инотропной реакции на тест «Post-rest» коррелировал с более высоким содержанием SERCA2a, Рис. 1. Активность ферментов лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и сукцинатдегидрогеназы (СДГ) в миокарде пациентов с ИБС и больных ИБС, ассоциированной с СД2. Примечание: *р<0,05 - достоверность различий между группами. Низкое содержание Рис. 2. Уровень SERCA2a кардиомиоцитов пациентов с ИБС и больных ИБС, ассоциированной с СД2 Примечание: * р<0,05 - достоверность различий между группами, # р<0,05 - достоверность различий между подгруппами. 58 Клиническая практика № 4, 2017 http://clinpractice.ru Оригинальные исследования можно предположить, что кардиомиоциты этих пациентов имеют большую функциональную состоятельность Са2+-транспортирующих систем СР. Видимо, выявленное нами более высокое содержание SERCA2a позволяет, во время периода покоя, ресеквестрировать обратно в СР большее количество Са2+. Проявление П-го типа инотропной реакции при выполнении теста «Post-rest» свидетельствует об угнетении обратного захвата Са2+ в СР и об истощении этого внутриклеточного депо Са2+ во время покоя. Последнее обстоятельство может быть обусловлено и нарушением функций рианодиновых рецепторов СР [11]. Сочетанная дисфункция SERCA2a и риа-нодиновых рецепторов СР представляется наиболее неблагоприятным состоянием. Вероятно, именно оно наблюдается при II типе инотроп-ной реакции миокарда на тест «Post-rest». Известно, что SERCA2a является энергозависимым ферментом [12]. По этой причине, его эффективность определяет и количество фермента, и доступность энергетического субстрата. Результаты оценки активности ключевых ферментов энергообразования указывают на то, что сочетанное развитие ИБС и СД характеризуется снижением активности процессов гликолиза и цикла Кребса, что согласуется с данными литературы [10]. Однако, по нашим данным, у пациентов с сочетанной патологией наблюдается явное преобладание функционального резерва систем, сопряженных с СР. Исходя из полученных данных можно предположить, что контрактильный резерв миокарда пациентов с сочетанной патологией сохраняется в большей степени благодаря более интенсивной экспрессии SERCA2a. Возможно, функциональ- ИБС+СДI тип -*- ИБС I тип 10 20 30 40 50 60 Периоды ПОКОЯ, сек Рис. 3. Механическая реституция мышечных полосок миокарда пациентов с I и II типом инотропной реакции Примечание: * р<0,05 - достоверность различий между группами, # р<0,05 - достоверность различий между типами реакций. ная активность этого белка обеспечивается благодаря энергии, синтезируемой в результате сохранения активности окислительного фосфо-рилирования в митохондриях. Это предположение не противоречит ранее полученным данным об активности дыхания митохондрий при экспериментальном ПИКС и сочетанном моделировании ПИКС и СД [13, 14]. Таким образом, на основании полученных данных можно заключить, что даже при сочетанном развитии ИБС и СД контрактильный резерв миокарда обеспечивается как направленной перестройкой энергетического метаболизма, так и сохранением более высокого уровня SERCA2a. Разная степень интенсивности экспрессии SERCA2a СР может быть связана с генетическим полиморфизмом.

Об авторах

Сергей Александрович Афанасьев

НИИ кардиологии Томского НИМЦ

заведующий лаборатории молекулярно-клеточной патологии и генодиагностики, д.м.н., профессор

Дина Степановна Кондратьева

НИИ кардиологии Томского НИМЦ

Email: dina@cardio-tomsk.ru
научный сотрудник лаборатории молекулярно-клеточной патологии и генодиагностики, к.б.н

Шамиль Джаманович Ахмедов

НИИ кардиологии Томского НИМЦ

ведущий научный сотрудник отделения сердечно-сосудистой хирургии, д.м.н., профессор

Эльвира Фаритовна Муслимова

НИИ кардиологии Томского НИМЦ

младший научный сотрудник лаборатории молекулярно-клеточной патологии и генодиагностики

Олеся Викторовна Будникова

НИИ кардиологии Томского НИМЦ

аспирант лаборатории молекулярно-клеточной патологии и генодиагностики

Алексей Николаевич Репин

НИИ кардиологии Томского НИМЦ

заведующий отделением реабилитации больных сердечно-сосудистых заболеваний, д.м.н., профессор

Список литературы

Дополнительные файлы