Influence of mutation in pea (Pisum sativum L.) cdt (cadmium tolerance) gene on histological and ultrastructural nodule organization

Cover Page

Abstract


Background. A comparative analysis out of the structural organization of the symbiotic nodules of the pea initial line SGE and the mutant line SGECdt, characterized by increased tolerance to cadmium and increased its accumulation, was carried out.

Materials and methods.Nodules of initial line SGE and mutant SGECdt were analyzed using light and transmission electron microscopy.

Results. The non-treated nodules of SGE and SGECdt were characterized by a similar histological and ultrastructural organization. In the nodules of SGE exposed to 100 µM CdCl2 in infected cells, the following abnormalities were observed: expansion of the peribacteroid space, destruction of the symbiosome membrane, fusion of symbiosomes and, as a result, the formation of symbiosomes containing several bacteroids. In the nodules of SGECdt, infected cells did not undergo pronounced changes. In the nodules of SGE exposed to 1 mM CdCl2, at the base of the nodule, senescent infected cells with completely destroyed cytoplasm and degrading bacteroids appeared. Also there were present cells in which the contents of symbiosomes were lysing, and only the “ghosts” of the bacteroids remained in them. In SGECdt, in some infected cells, abnormalities were manifested in an increase in the peribacteroid space, partial destruction of symbiosome membranes, fusion of symbiosomes, and release of bacteroids into the vacuole.

Conclusions. The tolerance of pea nodules to cadmium can be significantly increased due to a single recessive cdt mutation.


Введение

Кадмий попадает в окружающую среду в результате естественных процессов, а также из-за постоянно увеличивающейся антропогенной деятельности [1]. Из почвы кадмий поглощается корнями, откуда он поступает в наземные части растений. При этом кадмий — это токсичный элемент, который вызывает различные аномалии в развитии растений [2, 3]. Растения отличаются по степени устойчивости к кадмию, большинство из них проявляют основную устойчивость, но встречаются растения, демонстрирующие гиперустойчивость, которая может сопровождаться гипераккумуляцией [4, 5]. Оба вида устойчивости характеризуются разнообразными молекулярно-генетическими, биохимическими и клеточными механизмами [6].

Кадмий влияет не только на развитие и функционирование растений, но и на их взаимодействие с симбио тическими микроорганизмами [7–12]. Было установлено, что развитие растений гороха, а особенно рост ризобий, ингибируется при значительно более высоких концентрациях кадмия по сравнению с развитием клубеньков [13]. Очевидно, что для создания резистентных к кадмию растительно-микробных систем необходимо повысить устойчивость к нему процесса образования клубеньков. Поскольку ризобиям свойственен высокий уровень устойчивости к кадмию [13], представляется целесообразным повысить уровень устойчивости симбиотической системы за счет изменений в геноме растения.

Мутантная линия гороха SGECdt, характеризующаяся как повышенной устойчивостью к кадмию, так и увеличенным его накоплением в тканях растения, была получена в результате использования ЭМС-мутагенеза. Мутантная линия SGECdt несет рецессивную мутацию cdt[14], локализованную в VI группе сцепления гороха [15, 16]. В результате прививочных экспериментов было показано, что генотип корня определяет повышенную устойчивость к кадмию и увеличенное его накопление в тканях мутантной линии [17].

Мутантная линия SGECdt обладает повышенной устойчивостью к действию кадмия в процессе образования клубеньков по сравнению с исходной линией SGE [13, 18]. Однако влияние кадмия на структурную организацию зрелых клубеньков у мутантной линии не изучено.

Цель данной работы заключалась в анализе влияния кадмия на структурную организацию симбиотических клубеньков у исходной линии SGE и мутантной линии SGECdt.

Материал и методы исследований

Растительный материал

В исследовании были использованы мутантная линия гороха посевного (Pisum sativum L.) SGECdt (cdt), характеризующаяся повышенной устойчивостью к кадмию и увеличенной его аккумуляцией [14], и исходная линия SGE [19] из коллекции ФГБНУ ВНИИСХМ.

Штамм бактерий

Растения были инокулированы коммерческим штаммом Rhizobium leguminosarum bv. viciae RCAM 1026 (= CIAM 1026) [20] из коллекции ФГБНУ ВНИИСХМ.

Условия выращивания и сбор материала для анализа

Семена стерилизовали концентрированной серной кислотой в течение 30 мин и промывали стерильной водой 10 раз. Семена располагали на плотиках, плавающих в гидропонном растворе, причем корневая система находилась в растворе, а семядоля и побег — на поверхности плотика. Гидропонный раствор имел следующий состав: KH2PO4 — 110 мМ; Ca(NO3)2 — 50 мМ; MgSO4 — 400 мМ; KCl — 300 мМ; CaCl2 — 70 мМ; H3BO3 — 1 мМ; MnSO4 — 1 мМ; ZnSO4 — 1 мМ; Na2MoO4 — 0,03 мМ; FeC4H4O6 — 2,5 мМ. Гидропонный раствор подвергали постоянному барботированию, смену раствора гидропоники проводили каждые 3 дня. Растения были выращены в климатической камере MLR-352H (Sanyo Electric Co., Ltd., Япония) в режиме день/ночь 16/8 ч при 21 °C, относительной влажности 75 %, освещенности 280 мкМ фотонов м–2 с–1. Через 23 дня после инокуляции в гидропонный раствор был добавлен CdCl2 до концентраций 100 мкМ и 1 мМ. Через 24 ч после добавления CdCl2 клубеньки с пяти растений были собраны для фиксации.

Микроскопический анализ

Для электронно-микроскопического анализа клубеньки подвергали мягкому вакуумированию и фиксировали в 2,5 % растворе глутаральдегида на 0,3 М фосфатном буфере (рН 7,2) при 4 °C в течение ночи. После фиксации образцы промывали в четырех сменах 0,3 М фосфатного буфера и дополнительно фиксировали в 1 % растворе четырехокиси осмия на 0,3 М фосфатном буфере в течение 2 ч. После промывания в трех сменах по 15 мин в дистиллированной воде образцы обезвоживали в этаноле возрастающей концентрации — 50 %, 70 % (оставляли на ночь при температуре 4 °C), 96 % по 15 мин в каждом, в двух сменах абсолютного этанола по 10 мин, в смеси абсолютного этанола и ацетона в соотношении 1 : 1 в течение 10 мин, в двух сменах ацетона по 10 мин.

В качестве заливочной среды применяли смолу Epon 812 с катализатором DMP-30 (Honeywell FlukaTM, Fisher Scientific, Великобритания). Ткани пропитывали в смесях абсолютного ацетона и заливочной среды в соотношении 1 : 1 и 1 : 3 в течение 1 ч каждая и далее в чистой смоле в течение ночи при комнатной температуре. Заливку клубеньков осуществляли путем переноса образцов в предварительно просушенные поли этиленовые капсулы, заполненные свежей заливочной средой. Полимеризацию выполняли при температуре 60 °C в течение двух суток в термостате IN55 (Memmert GmbH, Германия).

Полутонкие срезы (0,5–1 мкм) окрашивали тол луидиновым синим и изучали под микроскопом Leica DM LB2 (Leica Microsystems, Австрия), используя объективы ×5, ×10 и ×20. Ультратонкие срезы толщиной 90–100 нм готовили на ультратоме Leica Ultracut UCT (Leica Microsystems, Австрия) и собирали на медные сеточки, покрытые формваром. Ультратонкие срезы контрастировали 1 % водным раствором уранил ацетата в течение 20 мин и цитратом свинца по Рейнольдсу в течение 1 мин. Наблюдение и съемку ультратонких срезов проводили на трансмиссионном электронном микроскопе LEO 910 (LEO Electron Microscopy Group, Германия) при ускоряющем напряжении 60 кВ.

Результаты

Гистологическая и ультраструктурная организация симбиотических клубеньков гороха исходной линии SGE и мутантной линии SGECdt

Клубеньки линий SGE и SGECdt, выращенные в условиях гидропонной культуры без добавления CdCl2, обладали сходной гистологической организацией, типичной для клубеньков недетерминированного типа, в которых выделялись меристема, зона инфекции и зона азотфиксации (рис. 1, а, б). Тем не менее отдельные клетки подверглись деградации, вызванной, вероятно, условиями роста в гидропонной культуре (см. рис. 1, а, б). Ультраструктурная организация таких клубеньков была сходна у SGE и SGECdt и не отличалась от ранее описанной для клубеньков гороха. Наблюдались инфекционные нити, заполненные бактериями (рис. 1, ж), симбиосомы, содержащие единичные плейоморфные бактероиды (рис. 1, з).

 

Рис. 1. Гистологическая организация клубеньков гороха исходной линии SGE и мутантной линии SGECdt, не обработанных и обработанных 100 мкМ CdCl2, и ультраструктурная организация необработанных клубеньков SGECdt: а — гистологическая организация необработанных клубеньков SGE; б — гистологическая организация необработанных клубеньков SGECdt; в, д — гистологическая организация клубеньков SGE, обработанных 100 мкМ CdCl2; г, е — гистологическая организация клубеньков SGECdt, обработанных 100 мкМ CdCl2; ж — инфицированная клетка SGECdt из зоны инфекции с инфекционной нитью и ювенильными бактероидами; з — инфицированная клетка SGECdt из зоны азотфиксации с плейоморф ными бактероидами. I — меристема, II — зона инфекции, II–III — переходная зона между зонами инфекции и азотфиксации, III — зона азотфиксации, ИК — инфицированная клетка, НИК — неинфицированная клетка, ДИК — деградирующая инфицированная клетка, ИН — инфекционная нить, КС — клеточная стенка, Б — бактерия, Ба — бактероид, ЮБа — ювенильный бактероид; стрелки указывают на симбио сомную мембрану. Масштабная линейка: а–г — 100 мкм, д, е — 20 мкм, ж, з — 1 мкм

 

Гистологическая и ультраструктурная организация симбиотических клубеньков гороха исходной линии SGE и мутантной линии SGECdt при воздействии 100 мкМ CdCl2

При обработке корневых систем различными концентрациями CdCl2 воздействию подвергались клубеньки различного возраста, при этом зрелые клубеньки характеризовались бóльшим размером по сравнению с молодыми. Соответственно, они отличались большей устойчивостью к воздействию и были проанализированы в ходе данного исследования.

В зрелых клубеньках SGE и SGECdt присутствовали все гистологические зоны (рис. 1, в, г), но в клубеньках исходной линии выявлялись инфицированные клетки с признаками деградации (рис. 1, д). При этом в клубеньках у мутантной линии отмеченные нарушения отсутствовали (рис. 1, е).

В зрелых клубеньках SGE инфицированные клетки в зоне азотфиксации были заполнены многочисленными бактероидами (рис. 2, а). Мембраны бактероидов характеризовались повышенной складчатостью (рис. 2, б). Перибактероидное пространство в симбиосомах было увеличено, часто наблюдалось разрушение симбиосомных мембран и слияние симбиосом, что приводило к появлению симбиосом, содержащих несколько бактероидов (см. рис. 2, б). Инфекционные нити имели ультраструктурную организацию, близкую к норме, однако у некоторых присутствовали многочисленные выросты, окруженные клеточной стенкой и заполненные матриксом без бактерий (рис. 2, г). В инфицированных клетках с признаками деградации симбиосомные мембраны разрушались (см. рис. 2, г), в результате чего бактероиды высвобождались в просветленную цитоплазму (рис. 2, в, е) и претерпевали полную деградацию (рис. 2, д).

 

Рис. 2. Ультраструктурная организация клубеньков гороха исходной линии SGE, обработанных 100 мкМ CdCl2: а, б — инфицированные клетки из зоны азотфиксации с плейоморфными бактероидами; в, г — инфицированные клетки из зоны азотфиксации с первичными признаками старения (деградация цитоплазмы и нарушения строения инфекционных нитей); д, е — деградирующие инфицированные клетки из зоны старения. ИК — инфицированная клетка, ДИК — деградирующая инфицированная клетка, Я — ядро, А — амилопласт, ИН — инфекционная нить, Ба — бактероид, МС — «множественная» симбиосома, образующаяся в результате слияния симбиосом и содержащая несколько бактероидов; стрелки указывают на симбиосомную мембрану, наконечники стрелок — на разрушающиеся симбиосомные мембраны, звездочки — на выросты инфекционной нити, содержащие матрикс без бактерий. Масштабная линейка: а, в, д — 5 мкм; б, г, е — 1 мкм

 

В зрелых клубеньках SGECdt инфицированные клетки в зонах инфекции и азотфиксации не были подвержены сильным изменениям (рис. 3, а). Строение инфекционных нитей и капель не отличалось от таковых у необработанных растений (рис. 3, а, б). Однако в некоторых инфицированных клетках из зон инфекции и азотфиксации наблюдались симбиосомы с увеличенным перибактероидным пространством (рис. 3, б, в). Кроме того, в инфицированных клетках в зоне азотфиксации встречались признаки разрушения симбиосомных мембран и слияния симбиосом (рис. 3, г). В основании клубенька в отдельных клетках были заметны признаки деградации: разрушение цитоплазмы и органелл растительных клеток, высвобождение бактероидов из симбио сом (данные не представлены).

 

Рис. 3. Ультраструктурная организация клубеньков гороха мутантной линии SGECdt, обработанных 100 мкМ CdCl2: а — инфицированная клетка из зоны азотфиксации с инфекционной нитью и инфекционной каплей; б — инфицированная клетка из зоны инфекции с инфекционной нитью и ювенильными бактероидами; в — инфицированные клетки из зоны азотфиксации, заполненные симбиосомами с расширенными перибактероидными пространствами; г — плейоморфные бактероиды из зоны азотфиксации. ИК — инфицированная клетка, Я — ядро, КС — клеточная стенка, ИН — инфекционная нить, Ика — инфекционная капля, Ба — бактероид, МС — «множественная» симбиосома, образующаяся в результате слияния симбиосом и содержащая несколько бактероидов; стрелки указывают на симбиосомную мембрану, наконечники стрелок — на разрушение симбиосомных мембран. Масштабная линейка: а — 5 мкм; б, г — 1 мкм; в — 2 мкм

 

Гистологическая и ультраструктурная организация симбиотических клубеньков гороха исходной линии SGE и мутантной линии SGECdt при воздействии 1 мМ CdCl2

В зрелых клубеньках SGE инфицированные клетки зоны азотфиксации часто имели неровную, складчатую поверхность (данные не представлены). Зрелые клубеньки SGECdt имели строение, сходное с клубеньками, обработанными 100 мкМ CdCl2 (данные не представлены).

При анализе ультраструктурной организации в зрелых клубеньках SGE наблюдались признаки преждевременной деградации симбиотических компартментов (рис. 4, а, в, д). В зоне азотфиксации в большинстве клеток симбиосомные мембраны были частично или полностью разрушены, встречались де градирующие бактероиды (рис. 4, б). В зоне старения присутствовали клетки с полностью разрушенной цитоплазмой и деградирующими, свободно расположенными бактероидами (рис. 4, в, г). Бактероиды приобретали нерегулярную форму, складчатую поверхность (см. рис. 4, г), матрикс в них частично или полностью просветлялся (рис. 4, в, е). Выявлялись клетки, в которых содержимое симбиосом было лизировано, и в них присутствовали лишь мембраны бактероидов (рис. 4, д).

 

Рис. 4. Ультраструктурная организация клубеньков гороха исходной линии SGE, обработанных 1 мМ CdCl2: а — инфицированные клетки из зоны азотфиксации с начальными признаками деградации; б — плейоморфные бактероиды из зоны азотфиксации; в — деградирующая инфицированная клетка из зоны старения с инфекционной нитью и инфекционной каплей; г — бактероиды нерегулярной формы и со складчатой поверхностью в деградирующей инфицированной клетке из зоны старения; д — деградирующая инфицированная клетка из зоны старения, заполненная «тенями» бактероидов; е — деградирующие бактероиды с частично просветленным матриксом и разрушенной симбиосомной мембраной. ИК — инфицированная клетка, ДИК — деградирующая инфицированная клетка, Я — ядро, В — вакуоль, КС — клеточная стенка, ИН — инфекционная нить, Ика — инфекционная капля, Ба — бактероид, ДБа — деградирующий бактероид, МС — «множественная» симбиосома, образующаяся в результате слияния симбиосом и содержащая несколько бактероидов; стрелки указывают на симбиосомную мембрану, наконечники стрелок — на разрушение симбиосомных мембран, треугольники — на «тени» бактероидов. Масштабная линейка: а, в, д — 5 мкм; б, г, е — 1 мкм

 

Анализ ультраструктурной организации зрелых клубеньков SGECdt показал, что в инфицированных клетках в зоне инфекции мембраны бактероидов характеризовались повышенной складчатостью (рис. 5, а). Перибактероидное пространство в симбиосомах было увеличено, симбиосомные мембраны в некоторых клетках зоны инфекции были частично разрушены, в результате чего ювенильные бактероиды высвобождались в вакуоль (см. рис. 5, а). В зоне азотфиксации в инфицированных клетках наблюдалось слияние симбиосом (рис. 5, б), при этом происходило увеличение перибактероидного пространства с разрушением симбиосомных мембран (рис. 5, в). В отдельных стареющих клетках была видна деструкция симбиосом и тонопласта инфицированных клеток (рис. 5, г).

 

Рис. 5. Ультраструктурная организация клубеньков гороха мутантной линии SGECdt, обработанных 1 мМ CdCl2: а — инфицированная клетка из зоны инфекции с ювенильными бактероидами; б — плейоморфные бактероиды в инфицированной клетке из зоны азотфиксации; в — инфицированная клетка из зоны азотфиксации с начальными признаками деградации симбиосом: расширением перибактероидного пространства, разрушением симбиосомной мембраны и слиянием симбиосом; г — деградирующая инфицированная клетка из зоны старения. ИК — инфицированная клетка, В — вакуоль, КС — клеточная стенка, А — амилопласт, Ба — бактероид, ЮБа — ювенильный бактероид, МС — «множественная» симбиосома, образующаяся в результате слияния симбиосом и содержащая несколько бактероидов, стрелки указывают на симбиосомную мембрану, наконечники стрелок — на разрушение симбиосомных мембран. Масштабная линейка: а, б — 1 мкм; в — 2 мкм; г — 5 мкм

 

Обсуждение

Исследования влияния кадмия на развитие и функционирование симбиотических клубеньков на структурном уровне немногочисленны. Так, при концентрации 18 мкМ Cd2+ происходили изменения в гистологической и ультраструктурной организации клубеньков у люпина белого (Lupinus albus L.) при выращивании растений в течение 49 дней. Наблюдались заполнение гликопротеинами межклеточных пространств в коре клубенька и деградация бактероидов в части инфицированных клеток [8]. В клубеньках сои (Glycine max (L.) Merr.) с увеличением концентрации кадмия уменьшались число инфицированных клеток в зоне азотфиксации и число бактероидов в симбиосомах [7]. Наиболее детально влияние кадмия на структуру клубеньков было изучено для люцерны (Medicago sativa L.) [9]. Было показано, что обработка кадмием приводит к нарушениям формы инфицированных и неинфицированных клеток, исчезновению в них органелл, при этом в инфицированных клетках сохранялись инфекционные нити. В зоне азотфиксации формировалось много мелких вакуолей вместо одной центральной. В результате анализа ультраструктурной организации клубеньков было установлено, что в зоне инфекции присутствуют клетки как с нормальными инфекционными нитями и бактероидами, так и сильно поврежденные, с разрушенными бактероидами и очень темной цитоплазмой. В зоне азотфиксации отмечались клетки с многочис ленными вакуолями и проявлениями плазмолиза. При этом, кроме симбиосом и митохондрий, другие органеллы не наблюдались. Бактероиды подвергались деградации, а симбиосомы характеризовались нерегулярной формой. В некоторых клубеньках влияние кадмия было менее выражено и симптомы деградации в инфицированных клетках в зоне азотфиксации проявлялись лишь в увеличении перибактероидного пространства и усилении слияния симбиосом, в результате чего они содержали несколько бактероидов [9]. В этой же работе изучалось влияние на устойчивость клубеньков к кадмию штамма Sinorhizobium meliloti со сверхэкспрессией флаводоксина. Такие клубеньки были более устойчивы к кадмию, симптомы повреждений в них были менее выражены. В некоторых клетках зоны инфекции они проявлялись в расширении перибактероидного пространства и захвате бактерий вакуолью, а в зоне азотфиксации деградации подвергались симбиосомы, содержащие несколько бактероидов [9]. Таким образом, как в клубеньках люцерны, так и в клубеньках гороха кадмий индуцирует слияние симбиосом и появление симбиосом, содержащих несколько бактероидов, что может рассматриваться как признак активации старения симбиотического клубенька [21]. Кроме того, в клетках обоих видов зафиксировано присутствие бактерий в вакуоли, что свидетельствует о потере тонопластом его целостности, служит одним из проявлений программируемой клеточной гибели [22] и часто наблюдается во время старения клубенька [23, 24].

Генетические модели практически не применяли при изучении функционирования клубеньков в условиях кадмиевого стресса. Лишь для гороха было проведено исследование, в котором изучали влияние кадмия на развитие клубеньков у двух контрастных генотипов: VIR8456 и VIR3429, различающихся по устойчивости к кадмию [25]. Клубеньки VIR8456 при концентрации в почве 4,4 ppm Cd были менее устойчивы, в инфицированных клетках происходила деградация перибактероидных мембран и аккумуляция электронно-плотных включений. При концентрации в почве 22 ppm Cd аномалии на ультраструктурном уровне наблюдались в клубеньках обоих генотипов, хотя у VIR8456 они были выражены в большей степени [26].

Таким образом, данная работа является пионерным исследованием генетического контроля функционирования симбиотических клубеньков в условиях кадмиевого стресса. Полученные результаты показали, что устойчивость клубеньков гороха к кадмию может быть значительно повышена за счет единичной рецессивной мутации cdt.

Данная работа поддержана грантом Российского научного фонда (17-76-30016).

Работа выполнена с использованием оборудования ЦКП «Геномные технологии, протеомика и клеточная биология» ФГБНУ ВНИИСХМ.

Anna V. Tsyganova

All-Russia Research Institute for Agricultural Microbiology

Email: isaakij@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3505-4298

Russian Federation, 3, Podbelsky highway, Pushkin, Saint-Petersburg, 196608

Leading Scientist, Laboratory of Molecular and Cellular Biology

Elena V. Seliverstova

All-Russia Research Institute for Agricultural Microbiology; Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry of the RAS

Email: elena306@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2096-693X

Russian Federation, 3, Podbelsky highway, Pushkin, Saint-Petersburg, 196608; 44, Thorez prospekt, St.-Petersburg, 194223

Senior Scientist, Laboratory of Molecular and Cellular Biology; Senior Scientist, Laboratory of Kidney Physiology and Water-Salt Metabolism

Viktor E. Tsyganov

All-Russia Research Institute for Agricultural Microbiology

Author for correspondence.
Email: tsyganov@arriam.spb.ru
ORCID iD: 0000-0003-3105-8689
SPIN-code: 6532-1332
Scopus Author ID: 7006136325
ResearcherId: Q-5634-2016
Mendeley Profile: https://www.mendeley.com/profiles/viktor-tsyganov/
http://arriam.ru/departments/laboratoriya-molekulyarnoj-i-kletochnoj-biologii/

Russian Federation, 3, Podbelsky highway, Pushkin, Saint-Petersburg, 196608

Head of the Laboratory, Laboratory of Molecular and Cellular Biology

  1. Singh OV, Labana S, Pandey G, et al. Phytoremediation: an overview of metallic ion decontamination from soil. Appl Microbiol Biotechnol. 2003;61(5-6):405-412. https://doi.org/10.1007/s00253-003-1244-4.
  2. Sanità di Toppi L, Gabbrielli R. Response to cadmium in higher plants. Environ Exp Bot. 1999;41(2): 105-130. https://doi.org/10.1016/s0098-8472(98) 00058-6.
  3. He S, Yang X, He Z, Baligar VC. Morphological and physiological responses of plants to cadmium toxicity: A review. Pedosphere. 2017;27(3):421-438. https://doi.org/10.1016/s1002-0160(17)60339-4.
  4. Clemens S. Molecular mechanisms of plant me tal tolerance and homeostasis. Planta. 2001;212(4): 475-486. https://doi.org/10.1007/s004250000458.
  5. Clemens S. Toxic metal accumulation, responses to exposure and mechanisms of tolerance in plants. Biochimie. 2006;88(11):1707-1719. https://doi.org/10.1016/j.biochi.2006.07.003.
  6. Kulaeva OA, Tsyganov VE. Molecular-genetic basis of cadmium tolerance and accumulation in higher plants. Russ J Genet Appl Res. 2011;1(5):349-360. https://doi.org/10.1134/s2079059711050108.
  7. Chen YX, He YF, Yang Y, et al. Effect of cadmium on nodulation and N2-fixation of soybean in contaminated soils. Chemosphere. 2003;50(6):781-787. https://doi.org/10.1016/s0045-6535(02)00219-9.
  8. Carpena RO, Vázquez S, Esteban E, et al. Cadmium-stress in white lupin: effects on nodule structure and functioning. Plant Physiol Biochem. 2003;41(10):911-919. https://doi.org/10.1016/s0981-9428(03)00136-0.
  9. Shvaleva A, Coba de la Peña T, Rincón A, et al. Flavodoxin overexpression reduces cadmium-indu ced damage in alfalfa root nodules. Plant Soil. 2010;326(1-2):109-121. https://doi.org/10.1007/s11104-009-9985-1.
  10. Garg N, Bhandari P. Influence of cadmium stress and arbuscular mycorrhizal fungi on nodule senescence in Cajanus cajan (L.) Millsp. Int J Phytoremediation. 2012;14(1):62-74. https://doi.org/10.1080/15226514.2011.573822.
  11. Chubukova OV, Postrigan’ BN, Baimiev AK, Che meris AV. The effect of cadmium on the efficiency of development of legume-rhizobium symbiosis. Biol Bull. 2015;42(5):458-462. https://doi.org/10.1134/s1062359015050040.
  12. Rivera-Becerril F, Calantzis C, Turnau K, et al. Cadmium accumulation and buffering of cadmium-induced stress by arbuscular mycorrhiza in three Pisum sativum L. genotypes. J Exp Bot. 2002;53(371):1177-1185. https://doi.org/10.1093/jexbot/53.371.1177.
  13. Belimov AA, Puhalsky IV, Safronova VI, et al. Role of plant genotype and soil conditions in symbiotic plant-microbe interactions for adaptation of plants to cadmium-polluted soils. Water Air Soil Pollut. 2015;226(8):264. https://doi.org/10.1007/s11270-015-2537-9.
  14. Tsyganov VE, Belimov AA, Borisov AY, et al. A che mically induced new pea (Pisum sativum) mutant SGECdt with increased tolerance to, and accumulation of, cadmium. Ann Bot. 2007;99(2):227-237. https://doi.org/10.1093/aob/mcl261.
  15. Tsyganov VE, Kulaeva OA, Knox MR, et al. Using of SSAP analysis for primary localization of mutation cdt (cadmium tolerance) in pea linkage group VI. Russ J Genet Appl Res. 2013;3(2):152-155. https://doi.org/10.1134/s2079059713020081.
  16. Kulaeva OA, Tsyganov BE. Fine mapping of a cdt locus mutation that leads to an increase in the tolerance of pea (Pisum sativum L.) to cadmium. Russ J Genet Appl Res. 2013;3(2):120-126. https://doi.org/10.1134/s2079059713020020.
  17. Belimov AA, Malkov NV, Puhalsky JV, et al. The crucial role of roots in increased cadmium-tolerance and Cd-accumulation in the pea mutant SGECdt. Biol Plant. 2018;62(3):543-550. https://doi.org/10.1007/s10535-018-0789-0.
  18. Tsyganov VE, Zhernakov AI, Khodorenko AV, et al. Mutational analysis to study the role of genetic factors in pea adaptation to stresses during development its symbioses with Rhizobium and mycorrhizal fungi. In: Biological Nitrogen Fixation, Sustainable Agriculture and the Environment. Ed. by Y.P. Wang, M. Lin, Z.X. Tian, et al. Dordrecht: Springer; 2005. P. 279-281.
  19. Kosterin OE, Rozov SM. Mapping of the new mutation blb and the problem of integrity of linkage group I. Pisum Genet. 1993;25:27-31.
  20. Safronova VI, Novikova NI. Comparison of two me thods for root nodule bacteria preservation: Lyophilization and liquid nitrogen freezing. J Microbiol Methods. 1996;24(3):231-237. https://doi.org/10.1016/0167-7012(95)00042-9.
  21. Hernández-Jiménez MJ, Mercedes Lucas M, de Felipe MR. Antioxidant defence and damage in senescing lupin nodules. Plant Physiol Biochem. 2002;40 (6-8): 645-657.
  22. van Doorn WG. Classes of programmed cell death in plants, compared to those in animals. J Exp Bot. 2011;62(14):4749-4761. https://doi.org/10.1093/jxb/err196.
  23. Banba M, Siddique AB, Kouchi H, et al. Lotus japonicus forms early senescent root nodules with Rhizobium etli. Mol Plant Microbe Interact. 2001;14(2):173-180. https://doi.org/10.1094/MPMI.2001.14.2.173.
  24. Serova TA, Tsyganova AV, Tsyganov VE. Early nodule senescence is activated in symbiotic mutants of pea (Pisum sativum L.) forming ineffective nodules blocked at different nodule developmental stages. Protoplasma. 2018;255(5):1443-1459. https://doi.org/10.1007/s00709-018-1246-9.
  25. Belimov AA, Safronova VI, Tsyganov VE, et al. Genetic variability in tolerance to cadmium and accumulation of heavy metals in pea (Pisum sativum L.). Euphytica. 2003;131(1):25-35. https://doi.org/10.1023/a:1023048408148.
  26. Ausili P, Borisov A, Lindblad P, Mårtensson A. Cadmium affects the interaction between peas and root nodule bacteria. Acta Agric Scand B Soil Plant Sci. 2002;52(1):8-17. https://doi.org/10.1080/090647102320259992.

Supplementary files

Supplementary Files Action
1. Fig. 1. Histological organization of pea nodules of the original SGE line and mutant SGECdt line, untreated and treated with 100 μM CdCl2, and ultrastructural organization of untreated SGECdt nodules: a - histological organization of untreated SGE nodules; b - histological organization of unprocessed SGECdt nodules; b, d - histological organization of SGE nodules treated with 100 μM CdCl2; g, e — histological organization of SGECdt nodules treated with 100 μM CdCl2; g - infected SGECdt cell from the zone of infection with infectious floss and juvenile bacteroids; h - an infected SGECdt cell from the nitrogen fixation zone with pleomorphic bacteroids. I - meristem, II - infection zone, II – III - transition zone between infection and nitrogen fixation zones, III - nitrogen fixation zone, IR - infected cell, NICK - uninfected cell, DICK - degrading infected cell, IN - infectious thread, KS - cell wall, B - bacterium, Ba - bacteroid, UBa - juvenile bacteroid; arrows indicate symbiotic membrane. Scale bar: a – g - 100 µm, d, e - 20 µm, g, W - 1 µm View (4MB) Indexing metadata
2. Fig. 2. Ultrastructural organization of pea nodules of the original SGE line, treated with 100 μM CdCl2: a, b - infected cells from the nitrogen fixation zone with pleiomorphic bacteroids; c, d - infected cells from the zone of nitrogen fixation with the primary signs of aging (degradation of the cytoplasm and violation of the structure of infectious filaments); d, e - degrading infected cells from the zone of aging. IR - infected cell, DIC - degrading infected cell, I - nucleus, A - amyloplast, IN - infectious thread, Ba - bacteroid, MS - "multiple" symbiosome, formed as a result of symbiotic fusion and containing several bacteroids; arrows indicate a symbiosome membrane, arrowheads indicate decaying symbiosomal membranes, asterisks indicate infective outgrowths containing a matrix without bacteria. Scale bar: a, b, d - 5 microns; b, g, e - 1 micron View (5MB) Indexing metadata
3. Fig. 3. Ultrastructural organization of pea nodules of the mutant line SGECdt, treated with 100 μM CdCl2: a - an infected cell from the nitrogen fixation zone with an infectious thread and an infectious drop; b - an infected cell from the zone of infection with an infectious thread and juvenile bacteroids; (c) infected cells from the nitrogen fixation zone, filled with symbiosomes with expanded peribacteroid spaces; g - pleomorphic bacteroids from the zone of nitrogen fixation. IR - infected cell, I - the nucleus, KS - cell wall, IN - infectious thread, Ica - infectious drop, Ba - bacteroid, MS - "multiple" symbiosome, resulting from the fusion of symbiosomes and containing several bacteroids; arrows indicate a symbiosome membrane, arrowheads indicate the destruction of symbiosomal membranes. Scale bar: a - 5 microns; b, g - 1 micron; in - 2 microns View (3MB) Indexing metadata
4. Fig. 4. Ultrastructural organization of pea nodules of the initial SGE line, treated with 1 mM CdCl2: a - infected cells from the nitrogen fixation zone with initial signs of degradation; b - pleomorphic bacteroids from the zone of nitrogen fixation; c - a degrading infected cell from the zone of aging with an infectious thread and an infectious drop; (d) bacteroids of irregular shape and with a folded surface in a degrading infected cell from the zone of aging; e - a degrading infected cell from the aging zone, filled with the “shadows” of bacteroids; e - degrading bacteroids with a partially-coated matrix and a destroyed symbiosomal membrane. IR - infected cell, DICK - degrading infected cell, I - nucleus, B - vacuole, KS - cell wall, IN - infectious thread, Ika - infectious drop, Ba - bacteroid, DBA - degrading bacteroid, MS - "multiple" symbiosome, resulting from fusion of symbiosomes and containing several bacteroids; arrows indicate a symbiosome membrane, arrowheads indicate the destruction of symbiosomal membranes, and triangles indicate the “shadow” of bacteroids. Scale bar: a, b, d - 5 microns; b, g, e - 1 micron View (5MB) Indexing metadata
5. Fig. 5. Ultrastructural organization of pea nodules of the mutant line SGECdt, treated with 1 mM CdCl2: a - an infected cell from the infection zone with juvenile bacteroids; b - pleomorphic bacteroids in the infected cell from the zone of nitrogen fixation; c - infected cell from the zone of nitrogen fixation with initial signs of symbiosome degradation: expansion of the peribacteroid space, destruction of the symbiosome membrane and fusion of symbiosomes; d - degrading infected cell from the zone of aging. IR - infected cell, B - vacuole, KS - cell wall, A - amyloplast, Ba - bacteroid, UBa - juvenile bacteroid, MS - "multiple" symbiosome, resulting from the fusion of symbiosome and containing several bacteroids, arrows point to a symbiosomal membrane, arrowheads - on the destruction of symbiosomal membranes. Scale bar: a, b - 1 micron; in - 2 microns; g - 5 microns View (2MB) Indexing metadata

Views

Abstract - 42

PDF (Russian) - 56

PlumX


Copyright (c) 2019 Tsyganova A.V., Seliverstova E.V., Tsyganov V.E.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.