Comparasion of the effectiveness of anchor proteins ScAGα1p, KpCW51p, KpCW61p for surface display in yeast Komagataella phaffii

Full Text

АКТУАЛЬНОСТЬ

Дрожжевой дисплей (ДД) — эффективная технология выведения и закрепления на поверхности клетки целевых белков посредством их слияния с белками клеточной стенки. Принцип метода практически был опробован в 1985 г. на вирусных частицах, когда было показано, что за счет слияния последовательностей генов, кодирующих белок оболочки вируса и целевого пептида, можно получить вирусные частицы, несущие этот пептид на своей поверхности [1]. В случае экспонирования антител на поверхности фагов методика позволяла эффективно отбирать специфичные к определенному антигену антитела.

Однако, в виду небольших размеров вирусов и их геномов, помещать на их поверхность крупные белки оказалось невозможно. Тогда для экспонирования более крупных белков стали использовать клетки бактерий. Недостатком бактериальных систем является их неспособность производить многие белки эукариот, поэтому для экспонирования эукариотических белков стали использовать дрожжи [2].

Исследовательская группа Шредера в 1993 г. впервые получила штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae, экспонирующий на своей поверхности гетерологичный белок [3]. Несколькими годами позже в 1997 г. ДД использовали для отбора фрагментов антител с нужными свойствами из библиотеки случайных мутантов [4], открыв дорогу для применения ДД в белковой инженерии. Помимо S. cerevisiae в качестве платформ для экспонирования различных белков используются и другие виды дрожжей, такие как Komagataella phaffii (ранее известные как Pichia pastoris [5]), Hansenula polymorpha, Yarrowia lipolytica и дрожжи рода Kluyveromyces [6–8].

Сфера применения ДД необычайно широка. Он может быть использован для переработки отходов производств, например целлюлозы и крахмала, в производстве химических соединений и биотоплива, в процессах биоадсорбции тяжелых и редких металлов, для целей биоремедиации, в белковой инженерии, а также в медицине и чисто научных исследованиях, например в изучении белок-белковых взаимодействий [2].

Особенно следует отметить потенциал ДД для получения вакцинных препаратов для животноводства. На его основе уже ведутся работы по созданию оральных вакцин для птиц. Так, был разработан штамм K. phaffii, на поверхности клеток которого иммобилизован гемагглютинин высокопатогенного штамма вируса птичьего гриппа (подтип H5N1). Добавление этого штамма в куриный корм привело к появлению у куриц антител, нейтрализующих вирус [9]. Однако наиболее перспективной выглядит возможность применения клеток K. phaffii, экспонирующих антигены вирусов, в сочетании с инъекционным методом введения. В работе [10] клетки дрожжей S. cerevisiae, экспонирующие гемагглютинин вируса H5N1 в качестве антигена, использовали для вакцинации мышей. При этом проводилась инъекция непосредственно суспензии клеток, убитых температурной обработкой. Была показана 100 % защита вакцинированных таким образом мышей от вирулентного вируса птичьего гриппа H5N1 и не было обнаружено каких-либо побочных эффектов. При подобном подходе нет необходимости в очистке рекомбинантных белков, как в случае с субъединичными вакцинами. Таким образом, вакцины, полученные на основе метода ДД, могут быть необычайно дешевыми, оставаясь при этом эффективными.

ДД обладает рядом преимуществ перед другими клеточными системами и охарактеризован как один из наиболее перспективных подходов, в частности, для белковой инженерии [11, 12]. Дрожжи, будучи эукариотами, могут осуществлять различные посттрансляционные модификации, такие как гликозилирование и образование дисульфидных связей, фолдинг и секрецию эукариотических белков. ДД дает возможность катализировать реакции с использованием крупных субстратов, которые не могут попасть в клетку, а также в условиях, неоптимальных для работы фермента. Помимо этого, он позволяет повысить устойчивость целевого белка к изменениям pH, температуры, наличию органических растворителей, протеаз и даже улучшить его активность [13]. Дрожжи, как и бактерии, не требуют для культивирования особых технических затрат и способны расти в средах относительно простого состава. При этом, в связи с большим размером клеток дрожжей, на их поверхности размещается больше молекул целевого белка (порядка 10⁴–10⁵) [14], и их проще отделить от среды.

Как было отмечено ранее, для ДД используют разные виды дрожжей. Но особый интерес среди них представляют метилотрофные дрожжи K. phaffii, получившие широкое распространение в биотехнологии.

Метилотрофные дрожжи K. phaffii применяются в современной биотехнологии для производства самых разнообразных белков. Для них разработаны хорошо зарекомендовавшие себя методы генетической инженерии, а их секвенированный геном находится в открытом доступе [15]. Преимущество дрожжей K. phaffii как объекта биотехнологии состоит также в наличии необычайно сильных и при этом строго регулируемых промоторов [16]. Перечисленные факторы сделали K. phaffii одной из самых эффективных среди известных систем экспрессии гетерологичных генов. Опыт применения этих дрожжей в биотехнологии показал, что вероятность успешного синтеза любого чужеродного белка с помощью K. phaffii составляет около 75 %, что считается очень высоким показателем. Причем основной этап — получение штаммов, синтезирующих целевой белок на любом, даже самом минимальном уровне, поскольку использование K. phaffii предоставляет широкие возможности для дальнейшей оптимизации условий культивирования [16]. Во множестве работ с помощью K. phaffii были достигнуты высокие уровни синтеза целевых белков ≥1 г/л. При этом существуют примеры успешного синтеза внутриклеточных белков в количествах до 22 г/л, а секреторных белков — до 15 г/л. Дрожжи K. phaffii способны секретировать большее количество белка, чем S. cerevisiae [17]. Существует также ряд примеров успешного синтеза белков с помощью K. phaffii, которые ранее не удавалось синтезировать с помощью других систем на основе Baculovirus или S. cerevisiae [18].

Дрожжи K. phaffii имеют аэробный тип метаболизма и могут расти до высоких плотностей клеточной суспензии (>130 г/л сухой клеточной массы [19]; >400 г/л сырой клеточной массы; >500 OD600 Ед/мл суспензии [20]). Учитывая, что при производстве вакцинных препаратов на основе ДД важное значение имеет количество клеточной массы, а также, что количество гетерологичных белков в случае ДД напрямую зависит от количества клеток, выбор K. phaffii в качестве платформы для ДД выглядит особенно привлекательно.

В случае использования дрожжей для получения вакцинных препаратов для птиц и их перорального применения K. phaffii имеет еще одно преимущество. Как было установлено Габоарди K. phaffii оказался многообещающим пробиотиком для домашней птицы [21]. Клетки штамма X-33 дрожжей K. phaffii добавляли в рацион перепелок, вакцинированных против болезни Ньюкасла, инфекционного птичьего бронхита и инфекционной бурсальной болезни птиц. Добавление клеток дрожжей в рацион модулировало иммунную систему птиц, повышая уровни антител против этих болезней по сравнению с контролем, и увеличивало массу яиц.

Центральное место в технологии ДД занимают белки клеточной стенки или их фрагменты, благодаря которым и возможно экспонирование на клеточной поверхности других белков. Наиболее известны следующие белки: SсAGα1p, ScAga1p/ScAga2p, ScFlo1p, ScSed1p, ScTip1p, и KpPir1/2/3/4p. Все вышеперечисленные белки кроме семейства Pir являются белками дрожжей S. cerevisiae. Якорные белки отличаются друг от друга по механизму взаимодействия с клеточной стенкой, свободному N- или C-концу аминокислотной последовательности, к которому может быть присоединен целевой белок, по уровню синтеза в различные фазы клеточного цикла, а также наличию/отсутствию характерного для многих якорных белков гликозилфосфатидилинозитольного домена — GPI-якоря.

Первый дисплей на основе дрожжей K. phaffii, в котором якорным белком служил C-концевой фрагмент белка ScAGα1p дрожжей S. cerevisiae, был получен в 2004 г. [22]. Q. Wang в 2007 г. в своем исследовании также показал работоспособность C-фрагмента белка ScAGα1p используя последовательность гена с нативной 3'-некодирующей последовательностью S. cerevisiae [23]. В дальнейшем была подтверждена работоспособность в K. phaffii и других якорных белков S. cerevisiae, например ScAga2p, ScFlo1p, ScSed1p и ScTip1p [7].

L. Zhang и соавт. [24] провели скрининг белков из K. phaffii, обладающих доменом GPI и, таким образом, потенциально способных исполнять роль якорных белков для ДД. Авторы использовали репортерную систему на основе гена CALB, кодирующего липазу В Candida antarctica. В результате их исследования было отобрано несколько белков, продемонстрировавших наибольшую эффективность, — KpCW51p, KpCW61p. В отдельном исследовании была показана эффективность якорного белка KpCW61p для выведения на поверхность фермента липазы Thermomyces lanuginosus [25].

Несмотря на доказанную работоспособность некоторых белков клеточной стенки S. cerevisiae в K. phaffii, сравнение и выбор якорных белков, позволяющих эффективно экспонировать целевые белки на поверхности клеток K. phaffii, остается актуальной задачей.

Цель работы — сравнить эффективность белков клеточной стенки ScAGα1p S. cerevisiae, включая исследование нескольких вариантов кодирующей последовательности гена ScAGα1, и KpCW51p/KpCW61p K. phaffii для экспонирования репортерного белка на поверхности клеток. Для этого изучаемые последовательности генов были встроены в одну рамку считывания с геном репортерного белка eGFP (enhanced Green Fluorescent Protein — зеленый флуоресцентный белок улучшенный) под контролем промотора гена АОХ1, а затем интегрированы в геном штамма Х-33 дрожжей K. phaffii.

Результаты работы и сконструированные плазмиды позволят получить штаммы дрожжей K. phaffii, эффективно экспонирующие на своей поверхности белки, в том числе антигены. Такие штаммы можно будет использовать в качестве вакцинных препаратов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Плазмиды. В работе были использованы следующие плазмиды: pPICZαB (Thermo Fisher Scientific, США), pCMV-GFP (Addgene plasmid repository, США, plasmid #11153, [26]).

Штаммы. Для амплификации плазмидной ДНК использовали бактерии Escherichia coli, штамм DH5alpha — генотип F^– φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169 recA1 endA1 hsdR17(rK^–, mK⁺)phoA supE44 λ^– hi-1 gyrA96 relA1 (Thermo Fisher Scientific, США). Для получения дрожжевых штаммов-продуцентов использовали штаммы Komagataella phaffii Х-33 (wt) (Invitrogen, США).

Среды и условия культивирования. Для культивирования бактерий использовали среду LB: 1 % триптон, 0,5 % дрожжевой экстракт, 170 ммоль NaCl, 2,4 % агар (если среда твердая). Для отбора бактериальных трансформантов, устойчивых к антибиотику зеоцину (Invivogen), использовали среду LB low salt с содержанием 25 мг/л антибиотика зеоцина и пониженным содержанием NaCl — 90 ммоль. Для приготовления бактериальных компетентных клеток использовали среду TYM: 2 % триптон, 0,5 % дрожжевой экстракт, 100 ммоль NaCl, 10 ммоль MgSO₄. Для культивирования дрожжевых штаммов использовали среду YEPD: 1 % дрожжевой экстракт, 2 % пептон, 2 % D-глюкоза. Для индукции экспрессии гетерологичных генов под контролем промотора AOX1 использовали среду YEPM: 1 % дрожжевой экстракт, 2 % пептон, 1 % метанол. Бактериальные клетки при получении плазмид культивировали при 37 °C. При получении бактериальных компетентных клеток культивирование проводили при 30 °C. Дрожжевые штаммы культивировали при температуре 30 °C.

Выделение ДНК из клеток. Выделение плазмидной ДНК из клеток бактерий осуществляли с помощью набора Plasmid Miniprep (Евроген, Россия) согласно протоколу производителя. Выделение хромосомной ДНК из клеток дрожжей осуществляли с помощью универсального набора LumiPure from AnySample для выделения геномной ДНК (Люмипроб, Россия) согласно протоколу производителя.

Выделение ДНК из агарозного геля и реакционных смесей. Очистку ДНК из агарозных гелей и реакционных смесей проводили с помощью набора Cleanup Standard (Евроген, Россия).

ПЦР-скрининг бактериальных трансформантов. Раствор плазмидной ДНК предполагаемых бактериальных трансформантов для анализа получали следующим образом. В 10 мкл воды добавляли колонию бактерий и инкубировали 5 мин при 95 °C. Смесь центрифугировали 2 мин при 7000 об/мин и отбирали 1 мкл надосадочной жидкости в качестве матрицы для ПЦР.

Молекулярные методы. Лигирование фрагментов ДНК проводили с помощью T4 ДНК лигазы (Евроген, Россия) при условиях, рекомендованных фирмой-изготовителем фермента. Гидролиз ДНК проводили в буферных растворах, предложенных фирмами-производителями ферментов (Thermo Fisher Scientific, США или НПО «SibEnzyme», Россия). Рестрикционные смеси инкубировали в течение 30 мин при 37 °C.

Трансформация. Трансформацию дрожжей проводили методом электропорации по описанной ранее методике [27]. Трансформацию бактерий осуществялили по стандартной методике и культивировали в среде Луриа – Бертани [28]. Для отбора бактериальных трансформантов, устойчивых к зеоцину, в среду добавляли антибиотик в концентрации 25 мг/л. Штаммы E. coli выращивали при 37 °C. Для отбора дрожжевых трансформантов, устойчивых к антибиотику зеоцину, использовали среду YEPD, в которую добавляли антибиотик в концентрации 150 мг/л. При работе на чашках Петри во все среды добавляли 20 г агара на литр среды.

Амплификация генов, кодирующих белки ScAGα1p, KpCW51p, KpCW61p и eGFP. Амплификацию структурного гена белка eGFP проводили на основе плазмиды pCMV-GFP. В качестве матриц для амплификации генов, кодирующих белки клеточной стенки, использовали хромосомную ДНК дрожжей S. cerevisiae (1-GRF18) и K. phaffii (X-33). Использовали высокоточную полимеразу Tersus (Евроген, Россия). Режим реакции ПЦР: 1 цикл — 95 °C, 3 мин; 30 циклов — 95 °C, 60 с; 55 °C, 60 с; 72 °C, 120 с. Использованные праймеры приведены в табл. 1.

 

Таблица 1. Последовательности праймеров

Table 1. Primer sequences

Название	Последовательность
F-XbaI-ScAGα1long	5-ATTACATCTAGACGCCAAAAGCTCTTTTATC-3
R-ScAGα1long-AgeI	5-ATTACAACCGGTTTTGATTATGTTCTTTCTATTTGA-3
F-XbaI-ScAGα1	5-ATTACATCTAGACGCCAAAAGCTCTTTTATC-3
R-ScAGα1-AgeI	5-ATTACTACCGGTTTAGAATAGCAGGTACGAC-3
F-XbaI-KpCW51	5-ATTACATCTAGACGATGACGATGACTCATTACCTT-3
R-KpCW51-AgeI	5-ATAGTTTAACCGGTCTAGATCAATAGGGCAATGGCA-3
F-XbaI-KpCW61	5-ATTACATCTAGATAACAACCTATCAAACGAGAGTAATG-3
R-KpCW61-AgeI	5-ATAGTTTAACCGGTTTAAATCAATAGAGCAAC-3
F-XhoI-GFP	5-GATTACACTCGAGAAAAGAATGGTGAGCAAGGGCG-3
R-GFP-XbaI	5-GATTACATCTAGAACCTTGTACAGCTCGTCCATGC-3
F-AOX1	5-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3

Примечание. Подчеркнуты последовательности, соответствующие сайтам узнавания рестриктазами.

 

Определяли интенсивности флуоресценции белка еGFP и меченых флюорофором антител к белку EGFP. Штаммы с геном, кодирующим белок еGFP, проверяли на наличие флуоресценции с помощью конфокального микроскопа Leica TCS SP5 (Leica, Германия).

Для определения на поверхности клеток белка еGFP при помощи иммуноцитохимического анализа использовали кроличьи поликлональные антитела фирмы Евроген, Россия (cat#AB011). Мечение проводили флуоресцентным красителем Sulfo-Cyanine3 при помощи набора Sulfo-Cyanine3 antibody labeling kit (Люмипроб, Россия) по методике, указанной производителем. Клетки собирали центрифугированием и промывали 5 раз 0,1 М натрий-фосфатным буферным раствором (PBS), рН = 7,4 и блокировали 1 % раствором бычьего сывороточного альбумина (Bovine Serum Albumin, BSA) в течение 1 ч. Затем клетки инкубировали с антителами (разведение 1 : 20 в PBS, 1 % BSA) в течение 1 ч. После промывки 5 раз 0,1 М PBS анализировали свечение меченых антител к белку еGFP на поверхности клеток полученных штаммов с помощью микроскопа DM4000 (Leica, Германия). Работа на микроскопах проводилась в ресурсном центре «Развитие молекулярных и клеточных технологий» СПбГУ.

Биоинформатические методы. Статистическую обработку данных выполняли с использованием программ Excel и GraphPadPrizm 6 [29]. Межгрупповые различия оценивали с помощью U-критерия Манна – Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Конструирование плазмиды, содержащей репортерный ген eGFP

Для получения плазмид, содержащих репортерный ген, с помощью метода ПЦР была получена последовательность гена eGFP. Полученный фрагмент ДНК обрабатывали эндонуклеазами рестрикции XbaI и XhoI и встраивали в плазмиду pPICZαB, предварительно обработанную теми же рестриктазами. Лигазной смесью трансформировали клетки E. coli и отбирали трансформантов.

Плазмида pPICZα-eGFP (рис. 1, а) была проверена на наличие вставки с помощью ПЦР, а также с помощью рестрикционного анализа.

 

Рис. 1. Схема плазмид, полученных в работе: a — плазмида с репортерным геном eGFP; b — полученные плазмиды с геном eGFP и генами белков клеточной стенки. 5'AOX1 — промотор гена AOX1, α-factor — альфа-фактор дрожжей; PTEF1 — дрожжевой промотор гена TEF1; PEM7 — бактериальный промотор; CYC1 TT — терминаторная область дрожжевого гена CYC1; Zeocin — ген устойчивости к зеоцину; pUC ori — ориджин-репликации; AOX1 TT — область терминации транскрипции гена AOX1; eGFP — ген репортерного белка; ScAGα1l (long), ScAGα1, KpCW51, KpCW61 — белки клеточной стенки; XhoI, XbaI, AgeI — сайты узнавания рестриктаз

Fig. 1. Schematic representation of the plasmids used in the work. a — plasmid with the eGFP reporter gene; b — obtained plasmids with the eGFP gene and cell wall protein genes. 5'AOX1 — AOX1 gene promoter; α-factor — yeast alpha factor; P_TEF1 — yeast promoter of the TEF1 gene; P_EM7 — bacterial promoter; CYC1 TT — terminator region of the yeast CYC1 gene; Zeocin — zeocin resistance gene; pUC ori — origin replications; AOX1 TT — transcription termination region of the AOX1 gene; eGFP — reporter protein gene; ScAGα1l (long), ScAGα1, KpCW51, KpCW61 — cell wall proteins; XhoI, XbaI, AgeI — restriction enzyme recognition sites

 

Конструирование плазмид, содержащих структурные гены белков клеточной стенки дрожжей — ScAGα1p, KpCW51p, KpCW61p в одной рамке считывания с геном репортерного белка eGFP

В работе Q. Wang [23] была использована последовательность гена, кодирующего белок ScAGα1p вместе с фланкирующим 3'-участком, и показана ее функциональность. В нашей работе мы взяли последовательность гена, кодирующего белок ScAGα1p, как с 3'-фланкирующей областью, так и без нее. Последовательность гена, включающую 3'-некодирующую область, мы обозначаем как ScAGα1long.

На первом этапе для получения плазмид, содержащих гены белков клеточной стенки дрожжей — ScAGα1p, KpCW51p и KpCW61p, получали целевые последовательности методом ПЦР. На рис. 2 изображены результаты ПЦР.

 

Рис. 2. Электрофореграмма продуктов ПЦР с праймерами к генам ScAGα1long, ScAGα1, KpCW51, KpCW61. М — маркер NL001 (Евроген, Россия); 1 — ScAGα1long (ожидаемый фрагмент — 1421 п.н.), 2 — ScAGα1 (ожидаемый фрагмент — 985 п.н.), 3 — KpCW51 (ожидаемый фрагмент — 612 п.н.), 4 — KpCW61 (ожидаемый фрагмент — 171 п.н.)

Fig. 2. Electrophoregram of PCR products with primers to the genes ScAGa1long, ScAGa1, KpCW51, KpCW61. M — marker NL001 (Eurogene, Russia); 1 — ScAGa1long (expected fragment — 1421 bp), 2 — ScAGa1 (expected fragment — 985 bp), 3 — KpCW51 (expected fragment — 612 bp), 4 — KpCW61 (expected fragment — 171 bp)

 

Полученные фрагменты ДНК и ранее полученную плазмиду pPICZα-eGFP обрабатывали рестриктазами XbaI и AgeI. Проводили лигирование, а затем трансформацию лигазной смесью бактериальных клеток. Бактериальных трансформантов с целевыми конструкциями отбирали ПЦР-скринингом. Трансформанты с подтвержденным наличием целевого гена выбирали для наработки и последующего выделения плазмидной ДНК и анализа. ПЦР и рестрикционный анализ полученных плазмид подтвердил правильность встроек целевых конструкций. После этого правильность полученных конструкций было подтверждено секвенированием. Таким образом, на первом этапе мы получили плазмиды, несущие в своем составе последовательности генов, кодирующие белки клеточной стенки дрожжей, — ScAGα1long, ScAGα1, KpCW51, KpCW61 в одной рамке считывания с геном репортерного белка eGFP. Причем последовательность ScAGα1long содержит собственную 3'-некодирующую область гена ScAGα1 дрожжей S. cerevisiae. В случае второго варианта ScAGα1, в качестве 3'-терминирующей области представлена соответствующая последовательность гена AOX1 K. phaffii, которая содержится в векторе pPICZαB. Структура полученных плазмид представлена на рис. 1, b.

Получение штаммов дрожжей с последовательностями генов ScAGα1long, ScAGα1, KpCW51, KpCW61 в одной рамке считывания с геном репортерного белка eGFP

Полученными плазмидами (рис. 1, b) трансформировали штамм дрожжей K.phaffii (X-33). Выделяли из полученных трансформантов хромосомную ДНК и проверяли методом ПЦР наличие вставок целевых конструкций. Результаты ПЦР представлены на рис. 3.

 

Рис. 3. Электрофореграмма продуктов ПЦР на матрице хромосомной ДНК дрожжевых трансформантов с генами ScAGα1long, ScAGα1, KpCW51, KpCW61 в одной рамке считывания с геном репортерного белка eGFP с использованием обратных праймеров к соответствующим генам белков клеточной стенки и прямым праймером к гену белка eGFP (1–3) или праймером к фрагменту гена AOX1 (4). М — маркер NL001 (Евроген, Россия); K+ — положительные контроли (плазмиды, которыми трансформировали исходный дрожжевой штамм); K– — отрицательные контроли (ПЦР реакционные смеси не содержащие матриц ДНК); 1 — ScAGα1long (ожидаемый фрагмент — 2158 п.н.); 2 — ScAGα1 (ожидаемый фрагмент — 1717 п.н.); 3 — KpCW51 (ожидаемый фрагмент — 1344 п.н.), 4 — KpCW61 (ожидаемый фрагмент — 1225 п.н.)

Fig. 3. Electrophoregram of PCR products on a matrix of chromosomal DNA of yeast transformants with the ScAGα1long, ScAGα1, KpCW51, KpCW61 genes in the same reading frame with the eGFP reporter protein gene using reverse primers to the corresponding cell wall protein genes and a forward primer to the eGFP protein gene (1–3) or primer to the fragment of the AOX1 gene (4). M — NL001 marker (Evrogen, Russia); K⁺ — positive controls (plasmids used to transform the original yeast strain); K^– — negative controls (PCR reaction mixtures not containing DNA templates); 1 — ScAGα1long (expected fragment – 2158 bp); 2 — ScAGα1 (expected fragment — 1717 bp); 3 — KpCW51 (expected fragment — 1344 bp), 4 — KpCW61 (expected fragment — 1225 bp)

 

Анализ экспонирования репортерного белка eGFP на поверхности клеток методом конфокальной микроскопии

Полученные дрожжевые трансформанты выращивали в условиях индукции промотора гена AOX1 и анализировали клетки с помощью конфокальной микроскопии. Результаты представлены на рис. 4.

 

Рис. 4. Конфокальная микроскопия полученных штаммов с репортерным белком eGFP. В качестве контрольного варианта (K–) использовали клетки исходного штамма K. phaffii X-33

Fig. 4. Confocal microscopy of obtained strains with eGFP reporter protein. Cells of the original strain K. phaffii X-33 were used as a control variant (K^–)

 

Как видно из результатов микроскопии, все полученные штаммы кроме контрольного синтезируют и экспонируют репортерный белок eGFP. Можно сделать предварительный вывод, что наиболее эффективно репортерный белок eGFP выводит на клеточную поверхность вариант белка ScAGα1p, структурный ген которого был клонирован без 3'-нетранслируемой области, и собственный белок клеточной стенки дрожжей K. phaffii — KpCW51p. Наихудшие результаты показывает белок KpCW61p дрожжей K. phaffii и белок ScAGα1p, структурный ген которого был клонирован с собственной 3'-нетранслируемой областью.

Анализ содержания репортерного белка eGFP на поверхности клеток методом флуоресцентной спектрометрии

На следующем этапе проводили количественный анализ флуоресценции репортерного белка eGFP у полученных штаммов. Полученные дрожжевые трансформанты выращивали в условиях индукции промотора гена AOX1 и анализировали клетки и культуральную жидкость (КЖ) с помощью спектрофлуориметра (поглощение 485 нм, эмиссия 520 нм). Помимо этого, при помощи меченых красителем Cy3 антител к белку eGFP на поверхности клеток определяли относительную флуоресценцию на спектрофлуориметре (поглощение 540 нм, эмиссия 570 нм). Данные представлены на рис. 5.

 

Рис. 5. Флуоресценция клеток с белком eGFP (a) и меченых красителем Cy3-антител к белку eGFP (b). Данные представлены со стандартной ошибкой среднего. K– — исходный штамм X-33

Fig. 5. Cells fluorescence with the eGFP protein (a) and dye-labeled Cy3 antibodies to the eGFP protein (b). Data are presented with standard error of the mean. K^– — original strain X-33

 

Данные свидетельствуют, что вариант белка ScAGα1p, структурный ген которого не содержит нативной 3'-некодирующей области, во всех опытах показывает наилучшие результаты в качестве якорного белка. Во всех вариантах штаммов кроме контрольного в КЖ детектируется наличие репортерного белка eGFP. Доля секретируемого белка eGFP по отношению к закрепленному на поверхности составляет от 56 % c якорем KpCW51 до 68 % с якорем ScAGα1p.

ОБСУЖДЕНИЕ

Дрожжевой дисплей — эффективная технология выведения на поверхность клетки целевых белков посредством их слияния с белками клеточной стенки. Поиск и характеристика белков, позволяющих эффективно экспонировать целевые белки на поверхности клеток K. phaffii, является актуальной задачей. В нашей работе мы оценили эффективность двух вариантов белка клеточной стенки ScAGα1p дрожжей S. cerevisiae, кодирующая последовательность которых отличалась наличием/отсутствием 3'-фланкирующей области, и собственных белков K. phaffii — KpCW51p, KpCW61p для экспонирования белков на поверхности клеток K. phaffii.

ScAGα1p (α-агглютинин) — гликопротеин клеточной стенки, опосредующий адгезию клеток S. cerevisiae в процессе полового размножения, находится на поверхности α-клеток S. cerevisiae. Он взаимодействует с α-аглютинином из клеток α-типа через домен на своем N-конце. ScAGα1p был первым белком, использованным для экспонирования гетерологичных белков на поверхности клеток дрожжей [3]. Ранее в отдельных исследованиях была показана функциональность для K. phaffii вариантов белка ScAGα1p, кодирующие последовательности которых содержали 3'-фланкирующую последовательность или были лишены ее. Но в этих работах не проводили сравнение эффективности экспрессии вариантов гена. Мы предположили, что фланкирующая 3'-последовательность может оказывать влияние на экспрессию, так как известно, что она играет роль в реакции полиаденилирования и регуляции, может быть мишенью для регуляторных белков. Поэтому мы взяли две последовательности гена белка ScAGα1p: 1) с нативной 3'-некодирующей областью из S.cerevisiae (ScAGα1long), 2) с 3'-некодирующей областью от гена K. phaffii АОХ1, которая присутствует в исходном векторе для клонирования pPICZαB (ScAGα1).

Другие белки в нашем исследовании являются собственными белками K. phaffii — это KpCW51p и KpCW61p. KpCW51p — белок размером 211 аминокислот, KpCW61p — 65 аминокислот — самый маленький белок с GPI-якорем, который демонстрировал способность выводить на поверхность клеток K. phaffii репортерные белки в исследовании L. Zhang и соавт. [24]. В обоих случаях поиск авторами доменов по базам данным Interproscan не дал результатов, а база NCBI определяет их как «неизвестные гипотетические белки». Известно, что белки клеточной стенки дрожжей часто являются гликопротеинами. Анализ авторов показывает, что KpCW51p предположительно имеет 27 сайтов O-linked гликозилирования, а KpCW61p всего 6, из которых 3 O-linked и 3 N-linked. Эти два белка продемонстрировали самую высокую эффективность выведения на поверхность репортерного белка — CALB [24].

Сравнение флуоресценции репортерного белка eGFP у полученных штаммов

Результаты конфокальной микроскопии (рис. 4) показывают, что якорные белки KpCW51p и ScAGα1p наиболее эффективно выводят и задерживают на поверхности клетки репортерный белок eGFP. Причем за синтез белка ScAGα1p отвечает последовательность ScAGα1 — без собственной 3'-некодирующей области. Наихудшие результаты показал белок ScAGα1p, кодируемый последовательностью ScAGα1long, и белок KpCW61p. Можно заметить, что флуоресценция в случае с белком KpCW61p детектируется в основном в сферической области внутри клетки и лишь небольшое свечение наблюдается на поверхности. Вероятно, происходит накопление репортерного белка, слитого с белком KpCW61p, в эндоплазматическом ретикулуме, это свидетельствует о неэффективном прохождении секреторного пути по сравнению с другими представленными белками. Свечение репортерного белка ScAGα1p с кодирующей последовательностью ScAGα1long слабое и равномерно распределено по клетке.

Данные выводы подтверждает и количественная оценка флуоресценции белка eGFP, как в клетках, так и в культуральной жидкости. На рис. 5, а мы видим, что флуоресценция репортерного белка с вариантом гена ScAGα1 — максимальная, и в 9 раз более интенсивная, чем с вариантом гена ScAGα1long. Вероятно, что нативная последовательность 3'-некодирующей области S. cerevisiae в последовательности ScAGα1long оказывает негативное влияние на экспрессию гена в K. phaffii, что приводит к снижению уровня белка ScAGα1p.

Наихудший результат в выведении репортерного белка на поверхность клетки показывает белок KpCW61p, хотя ранее в публикациях он показывал хорошую эффективность для дисплея K. phaffii — для выведения репортерного белка CALB [24] и фермента липазы T. lanuginosus [25]. Вероятно, в случае небольших якорных белков — гликопротеинов — на эффективность может оказывать ряд факторов. Это гетерогенность углеводного компонента, линкер, связывающий целевой белок с якорным и сам целевой белок. В нашем исследовании совокупность негативных факторов резко понизила его эффективность в качестве якорного белка для дрожжевого дисплея белка eGFP у K. phaffii. Возможно, при использовании специального линкера и с другими целевыми белками KpCW61p будет более эффективным.

При всех вариантах исследуемых якорных белков мы видим, что в КЖ выращиваемых штаммов детектируется флуоресценция, а значит, репортерный белок eGFP не весь удерживается на поверхности клеток полученных штаммов, а «сваливается» в КЖ. Данные флуоресценции КЖ коррелируют с данными свечения клеток — наиболее сильная флуоресценция детектируется в штаммах с последовательностями ScAGα1 и KpCW51, кодирующими белки ScAGα1p и KpCW51p. Вероятно, это происходит из-за сильного промотора гена AOX1, который обеспечивает сверхэкспрессию генов под его контролем. Уровень синтеза белка eGFP, слитого с исследуемыми якорными белками, сильно превышает доступную емкость поверхности клетки. Известно, например, что ген ScAGα1 под контролем нативного промотора имеет низкий конститутивный уровень экспрессии, повышение которого вызывается лишь феромонами клеток противоположного типа спаривания [30].

Сравнение флуоресценции Cy3-антител к белку eGFP на поверхности клеток

Данные флуоресценции меченых антител к eGFP подтверждают, что самый эффективный якорный белок из сравниваемых — белок ScAGα1p из дрожжей S. cerevisiae, кодируемый последовательностью без собственной 3'-нетранслируемой области. Следует отметить, что флуоресценция Cy3-антител к белку eGFP, слитого с нативным белком KpCW51p, резко упала и перестала отличаться от данных флуоресценции контрольного штамма и штамма с белком KpCW61p. Вероятно, репортерный белок eGFP экспонируется и закрепляется при помощи белка KpCW51p таким образом, что становится недоступным для антител. Можно предположить, что определенную роль в этом могут играть углеводные остатки белка KpCW51p, которые экранируют участки белка eGFP, узнаваемые антителами. То, что синтез и секреция белка eGFP, слитого с KpCW51p, происходит эффективно, свидетельствуют данные флуоресценции клеток и культуральной жидкости. Данное обстоятельство надо учитывать при выборе якорных белков для дрожжевого дисплея — применение белка KpCW51p для вывода на поверхность клетки антител может оказаться неэффективным.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенной работы были получены плазмиды, содержащие последовательности генов якорных белков — ScAGα1p из дрожжей S. cerevisiae и KpCW51p, KpCW61p из K. phaffii в одной рамке считывания с геном репортерного белка eGFP. Получены штаммы дрожжей, экспонирующие на своей поверхности репортерный белок eGFP посредством исследуемых белков клеточной стенки.

В результате сравнения исследованных белков был выбран наиболее эффективный якорный белок для выведения на поверхность клетки целевого белка. Это белок ScAGα1p, причем последовательность его гена не должна содержать нативной 3'-нетранслируемой области из S. cerevisiae. Эффективность белка KpCW61p оказалась наихудшей, что отличается от известных данных. Вероятно, его эффективность в качестве якорного белка может зависеть от ряда факторов, в том числе — выводимого на поверхность клетки белка и линкера между ними.

Полученные в работе данные и плазмиды позволят получать штаммы дрожжей K. phaffii, эффективно экспонирующие на своей поверхности белки, в том числе антигены. Такие штаммы можно будет использовать в качестве вакцинных препаратов.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией. Вклад каждого автора: М.А. Цыганков — проведение экспериментов, написание текста рукописи; А.М. Румянцев — планирование и проведение экспериментов; А.С. Макеева — проведение экспериментов; М.В. Падкина — разработка концепции исследования.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования. Исследование выполнено при финансовой поддержке Санкт-Петербургского государственного университета (грант № 75428571).

ADDITIONAL INFORMATION

Author contribution. Thereby, all authors made a substantial contribution to the conception of the study, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the article, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the study. Contribution of each authors: M.A. Tsygankov — conducting experiments, writing the text of the manuscript, A.M. Rumyantsev — planning and conducting experiments, A.S. Makeeva — conducting experiments, M.V. Padkina — research concept.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Funding source. The study was carried out with the financial support of Saint Petersburg State University (grant No. 75428571).

About the authors

Miklhail A. Tsygankov

Saint Petersburg State University

Author for correspondence.
Email: mial.tsygankov@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2513-6655
SPIN-code: 1098-0995
Scopus Author ID: 56252740000

Engineer-Researcher, Faculty of Biology, Department of Genetics and Biotechnology, Laboratory of biochemical genetics

Russian Federation, Saint Petersburg

Andrey M. Rumyantsev

Saint Petersburg State University

Email: rumyantsev-am@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1744-3890
SPIN-code: 9335-1184
Scopus Author ID: 55370658800

Cand. Sci. (Med.), Senior Research Associate, Faculty of Biology, Department of Genetics and Biotechnology, Laboratory of biochemical genetics

Russian Federation, Saint Petersburg

Anastasiya S. Makeeva

Saint Petersburg State University

Email: anastasimakeeva@mail.ru
SPIN-code: 1412-8449

Engineer-Researcher, Postgraduate Student, Faculty of Biology, Department of Genetics and Biotechnology, Laboratory of biochemical genetics

Russian Federation, Saint Petersburg

Marina V. Padkina

Saint Petersburg State University

Email: mpadkina@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4051-4837
SPIN-code: 7709-0449
Scopus Author ID: 6602596755

Dr. Sci. (Biol.), Professor, Faculty of Biology, Department of Genetics and Biotechnology, Laboratory of biochemical genetics

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files