Модифицирующее действие метформина на цитогенетические эффекты доксорубицина и циклофосфамида у мышей

Полный текст

АКТУАЛЬНОСТЬ

Метформин широко применяется для лечения сахарного диабета 2-го типа [1], которым страдают в мире около 500 млн человек с тенденцией к дальнейшему увеличению [2, 3]. Помимо гипогликемической активности у метформина выявлена способность к профилактике патологий, сопутствующих диабету 2-го типа: сердечно-сосудистых и нейродегенеративных заболеваний, ожирения, рака, старения. Их возникновение и/или развитие часто связывают с генотоксическими воздействиями [1, 4–6]. Обосновано мнение, что даже на фоне появления новых эффективных гипогликемических средств метформин сохранит ведущие позиции в лечении сахарного диабета 2-го типа и предупреждении сопутствующих заболеваний [4].

Ранее показано, что метформин способен снижать генотоксические эффекты, возникающие при моделировании сахарного диабета у животных [7, 8], и индукцию микроядер под действием адриамицина у мышей [9] и цисплатина у крыс [10].

Известные позитивные эффекты метформина при лечении и профилактике рака, этиология, патогенез и лечение которого тесно связаны с генотоксическими событиями, широко обсуждаются в литературе [5, 6] и могут быть обусловлены его возможными мутаген-модифицирующими свойствами. Отсюда, с учетом масштабов применения метформина, закономерен интерес к исследованиям его взаимодействий с мутагенными противоопухолевыми лекарствами.

В развитие исследований по мутаген-модифицирующему действию метформина in vivo целью настоящей работы явилась оценка его влияния на цитогенетические эффекты доксорубицина и циклофосфамида в клетках костного мозга мышей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты выполнены на самцах мышей-гибридов F₁ CBAхC57Bl/6 массой 20–22 г, в возрасте 8–9 нед., полученных из питомника «Столбовая» ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства» России.

Животные содержались в условиях вивария ФГБНУ «НИИ фармакологии им. В.В. Закусова», при 12-часовом световом режиме, при свободном доступе к воде и стандартному полнорационному гранулировано-экструдированному комбикорму для грызунов «Профгрызун» (Россия). Условия содержания животных и дизайн экспериментальных исследований были одобрены биоэтической комиссией ФГБНУ «НИИ фармакологии им. В.В. Закусова» и соответствовали ГОСТу 33215-2014 [11] «Правила оборудования помещений и организация процедур при работе с лабораторными животными», а также международным правилам, определенным Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза (16 августа 2020 г.) по охране животных, используемых в научных целях [12].

В работе использовались метформин (Тева, Россия), циклофосфамид (Sigma-Aldrich или Cayman Chemical, США), доксорубицин (Лэнс-Фарм, Россия). Метформин вводили внутрижелудочно в виде суспензии в 10 % растворе диметилацетамида. Циклофосфамид, являющийся непрямым мутагеном алкилирующего действия [6], и доксорубицин, сочетающий интеркалирующее и прооксидантное действие [6], вводили внутрибрюшинно в виде водного раствора. Контрольным животным вводили перорально 10 % раствор диметилацетамида. Во всех случаях объем введения не превышал 0,2 мл.

Оценку цитогенетической активности метформина выполняли в соответствии с требованиями OECD TG475 [13]. Для этого препарат вводили в дозах 500, 1000 и 2000 мг/кг однократно с эвтаназией животных через 18 ч после введения.

При исследовании мутаген-модифицирующего действия метформин в широком диапазоне доз вводили однократно или четырехкратно (предобработка), сочетая последнее введение с инъекцией мутагена. Выбор доз мутагенов основывался на собственном опыте предшествующих исследований [6], выбор доз метформина — на основании литературных данных [7–10]. Забой животных осуществляли через 24 ч после последнего введения. Цитогенетические препараты костного мозга бедренных костей готовили стандартным суховоздушным методом [14]. Во всех вариантах экспериментов животным за 2,5 ч до забоя вводили колхицин из расчета 4 мг/кг с целью подавления формирования ахроматинового веретена клеточного деления и накопления метафаз. Окрашивали азур-эозином.

Для цитогенетического анализа использовали микроскоп Standart-20 (Carl Zeiss, Germany) при маслоиммерсионном увеличении ×1000. Учитывали клетки с ахроматическими пробелами (гепами), одиночными (хроматидными) и парными (хромосомными) фрагментами хромосом и обменами различного типа [15]. В отдельную категорию «клетки со множественными повреждениями» выделяли метафазы, имеющие более пяти хромосомных повреждений. Каждая экспериментальная группа включала 4–5 мышей, от каждого животного анализировалось по 100 метафаз.

Статистическую обработку данных проводили в соответствии с принятыми подходами к обсчету цитогенетических результатов с нормальным распределением [16] с использованием углового φ-критерия Фишера путем сравнения долей аберрантных метафаз в контрольной и экспериментальной группах. Результаты представлены в виде среднего и его ошибки.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Установлено, что метформин в диапазоне доз 500–2000 мг/кг не вызывает увеличения выхода каких-либо категорий хромосомных аберраций и ахроматических пробелов или суммы клеток с аберрациями хромосом (табл. 1).

 

Таблица 1. Цитогенетическая активность метформина в клетках костного мозга мышей

Table 1. Cytogenetic activity of metformin in mouse bone marrow cells

Группа	Количество клеток	На 100 клеток					Всего поврежденных метафаз, % (M ± m)
		гепов	хроматидных фрагментов	хромосомных фрагментов	обменов	клеток с МП*
Контроль	500	0	0,4	0	0	0	0,4 ± 0,3
Метформин 500 мг/кг	500	0	0,8	0	0	0	0,8 ± 0,4
Метформин 1000 мг/кг	500	0.2	0,4	0	0	0	0,6 ± 0,3
Метформин 2000 мг/кг	500	0	0,4	0	0	0	0,4 ± 0,3

*Клеток со множественными повреждениями хромосом (>5 на метафазу).

 

Доксорубицин в дозе 10 мг/кг индуцировал хромосомные повреждения 10,2 ± 1,4 % клеток. При этом в спектре хромосомных аберраций наряду с одиночными (хроматидные) и парными (хромосомные) фрагментами выявляли большое количество хромосомных обменов (5,2 на 100 исследованных метафаз), не было установлено клеток со множественными повреждениями хромосом. На фоне введения метформина во всех использованных дозах наблюдалась тенденция к снижению выхода клеток с хромосомными повреждениями. Однако статистически значимый результат был достигнут только при использовании метформина в дозе 500 мг/кг (табл. 2).

 

Таблица 2. Влияние метформина на цитогенетические эффекты доксорубицина в клетках костного мозга мышей

Table 2. Effect of metformin on the cytogenetic effects of doxorubicin in mouse bone marrow cells

Группа	Количество клеток	На 100 клеток					Всего поврежденных метафаз, % (M ± m)
		гепов	хроматидных фрагментов	хромосомных фрагментов	обменов	клеток с МП*
Контроль	500	0	0,4	0	0	0	0,4 ± 0,3
Доксорубицин 10 мг/кг	500	0.2	5,2	0,2	5,2	0	10,2 ± 1,4, p < 0,001**
+Метформин 100 мг/кг	500	0	3,8	0	5,6	0	8,8 ± 1,3, p > 0,05†
+Метформин 250 мг/кг	500	0	3,6	0	4,2	0	7,4 ± 1,2, p > 0,05†
+Метформин 500 мг/кг	500	0	2,8	0	2,8	0	5,2 ± 1,0, p < 0,01†

*Клеток со множественными повреждениями хромосом (>5 на метафазу); **по сравнению с контролем; ^†по сравнению с эффектом мутагена.

 

В табл. 3 суммированы результаты нескольких серий исследований, направленных на оценку влияния метформина на эффекты циклофосфамида. В первой серии экспериментов было выявлено, что однократное введение циклофосфамида в сочетании с метформином в дозах 100, 250 и 500 мг/кг приводит к 2,0–2,6-кратному увеличению выхода аберрантных метафаз, преимущественно за счет увеличения количества клеток со множественными повреждениями хромосом. На фоне известных результатов, свидетельствующих в пользу антимутагенности метформина [9, 10], наблюдаемый эффект оказался неожиданным. В этой связи для проверки и подтверждения наблюдения были выполнены дополнительные серии экспериментов. Прежде всего метформин использовали в течение 4 дней в тех же дозах. В результате также наблюдали 2,6–3,4-кратное увеличение выхода аберрантных клеток за счет увеличения выхода метафаз со множественными повреждениями хромосом. Далее метформин применяли однократно, но в существенно меньших дозах. При использовании из расчета 10 и 50 мг/кг метформин в 2,3–2,6 раза увеличивал выход поврежденных метафаз, так же как в предыдущих случаях за счет существенного увеличения метафаз со множественными повреждениями хромосом. При применении в дозах 2,5 и 5 мг/кг метформин не влиял на проявление цитогенетического эффекта циклофосфамида.

 

Таблица 3. Влияние метформина на цитогенетические эффекты циклофосфамида в клетках костного мозга мышей

Table 3. Effect of metformin on the cytogenetic effects of cyclophosphamide in mouse bone marrow cells

Группа	Количество клеток	На 100 клеток					Всего поврежденных метафаз, % (M ± m)
		гепов	хроматидных фрагментов	хромосомных фрагментов	обменов	клеток с МП*
Контроль	500	0	0,4	0	0	0	0,4 ± 0,3
Однократное введение метформина
Циклофосфамид 20 мг/кг	500	0,4	11,8	0	2,0	6,2	16,0 ± 1,6, p < 0,001**
+Метформин 100 мг/кг	500	0,2	15,8	0,2	4,8	26,8	42,0 ± 2,2, p < 0,001†
+Метформин 250 мг/кг	500	0,4	17,2	0,4	3,0	18,6	33,2 ± 2,1, p < 0,001†
+Метформин 500 мг/кг	500	0,8	19,3	0,3	4,5	17,3	34,0 ± 2,4, p < 0,001†
Четырехдневное предварительное введение метформина
Циклофосфамид 20 мг/кг	500	0,4	10,0	0	0,6	2,4	10,6 ± 1,4, p < 0,001†
+Метформин 100 мг/кг	500	0,8	27,6	0	2,6	16,5	35,6 ± 2,1, p < 0,001†
+Метформин 250 мг/кг	400	0,8	21,0	0	1,6	12,0	27,6 ± 2,0, p < 0,001†
+Метформин 500 мг/кг	500	0,6	24,0	0,4	1,6	9,8	27,6 ± 2,0, p < 0,001†
Однократное введение метформина
Циклофосфамид 20 мг/кг	400	0,8	10,0	0	2,8	3,0	14,3 ± 1,7, p < 0,001**
+Метформин 10 мг/кг	400	0	25,3	0	4,8	16,5	36,5 ± 2,4, p < 0,001†
+Метформин 50 мг/кг	400	0	18,3	0,8	4,5	15,3	32,5 ± 2,3, p < 0,001†
Однократное введение метформина
Циклофосфамид 20 мг/кг	500	0,2	5,2	0,2	1,6	5,4	11,4 ± 1,4, p < 0,001**
+Метформин 2,5 мг/кг	500	0,8	13,6	0	2,0	2,0	14,8 ± 1,6, p > 0,05†
+Метформин 5 мг/кг	500	0,2	16,4	0,2	2,2	1,4	15,2 ± 1,8, p > 0,05†

*Клеток со множественными повреждениями хромосом (>5 на метафазу); **по сравнению с контролем; ^†по сравнению с эффектом мутагена.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Имеющиеся литературные сведения о цитогенетической активности метформина противоречивы. Кластогенная активность метформина ранее отмечалась в экспериментах в культуре лимфоцитов периферической крови человека при использовании препарата в концентрациях от 12,5 до 125 мкг/мл [17]. Увеличение числа микроядер обнаруживалось в отшелушенных уротелиальных клетках больных сахарным диабетом 2-го типа, леченых метформином [18].

В противовес было показано, что метформин в терапевтически значимых концентрациях 12,5, 25 или 50 мкМ (2,1–8,3 мкг/мл) не влиял на уровни хромосомных аберраций и микроядер в культуре лимфоцитов человека [19]. Препарат в диапазоне доз 62,5–332,9 мг/кг не индуцировал микроядра в клетках костного мозга мышей [9, 20], при использовании в дозе 100–2500 мг/кг не вызывал увеличения уровней микроядер и хромосомных аберраций у крыс [21].

Данные настоящего исследования, полученные в соответствии с общепринятой методикой цитогенетической оценки новых лекарств [6, 13], являются важным новым свидетельством в пользу отсутствия у метформина кластогенной активности in vivo.

Метформин при однократном введении в дозе 500 мг/кг статистически значимо на 50 % уменьшал проявление цитогенетического эффекта доксорубицина, но был не эффективен в меньших дозах.

Ранее было показано, что при 7-дневном введении в дозах 125 и 250 мг/кг препарат со сходной эффективностью снижает индукцию доксорубицином (адриамицин, 15 мг/кг) микроядер в костном мозге мышей [9]. Предварительное 7-дневное введение метформина в дозах 50 и 100 мг/кг уменьшало индукцию микроядер в полихроматофильных эритроцитах крыс, вызываемую однократным введением цисплатина в дозе 5 мг/кг [10]. Данные, полученные в настоящем исследовании, подтверждают наличие у метформина антимутагенной активности.

В доступной литературе не обнаружено сведений о влиянии метформина на цитогенетические эффекты циклофосфамида. В настоящем исследовании метформин в широком диапазоне доз от 10 до 500 мг/кг продемонстрировал способность к выраженному усилению цитогенетических эффектов циклофосфамида, что свидетельствует о его комутагенной активности в отношении этого мутагена. Выход клеток с хромосомными повреждениями, возникающими под действием циклофосфамида, был увеличен метформином в 2–3,4 раза. Эффект был наиболее выражен при многократном введении препарата в дозе 100 мг/кг. Полученные данные предполагают наличие некого триггерного механизма комутагенного действия метформина в отношении циклофосфамида.

Методом ДНК-комет было показано, что метформин усиливает индуцируемую комбинацией 5-фторурацила, эпирубицина и циклофосфамида поврежденность ДНК опухолевых клеток in vitro путем ингибирования репарации двунитевых разрывов [22]. Возникновение последних является основным механизмом кластогенного действия циклофосфамида. Установлена способность метформина индуцировать апоптоз на фоне экзогенного повреждения ДНК путем ингибирования синтеза ДНК, активации про-апоптотического белка р53 и выхода митохондриального цитохрома С [23]. В связи с этим важно отметить, что в представленном наблюдении усиление кластогенных эффектов циклофосфамида происходило преимущественно за счет увеличения уровня клеток со множественными повреждениями хромосом. К этому следует добавить, что за рамками стандартного цитогенетического протокола, в ходе микроскопического анализа в значительном количестве выявлялись метафазы с полной деструкцией хроматина, которые не наблюдались у животных, получавших метформин per se. Наличие таких метафаз служит косвенным свидетельством цитотоксического действия на клетки костного мозга. В контексте выполненной работы это может свидетельствовать об усилении гибели клеток с поврежденной ДНК под действием метформина.

Примечательно, что результаты настоящего исследования согласуются с экспериментальными данными о снижении выживаемости мышей при сочетанном применении циклофосфамида и метформина [24], а также данными, демонстрирующими снижение под влиянием метформина резистентности опухолей к циклофосфамиду [25], паклитакселу и цисплатину [26].

Способность к активации клеточной гибели определяет возможность применения метформина в качестве средства химиотерапии злокачественных опухолей, однако его влияние на различные опухоли малоизучено, а механизмы противоопухолевого действия до конца не ясны [26, 27]. Более перспективным на сегодня представляется применение метформина в комплексе противоопухолевой химиотерапии цитостатиками с целью усиления их эффективности и снижения терапевтических дозировок и, как следствие, токсических побочных эффектов [23].

В заключение можно сказать, что, совокупность собственных и литературных данных указывает на способность метформина проявлять разнонаправленную модифицирующую активность в зависимости от механизма мутагенного действия — антимутагенную или комутагенную, что определяет широкий спектр его потенциального применения помимо основного в качестве антидиабетического средства. Полученные в настоящем исследовании данные определяют необходимость осторожного подхода при назначении метформина пациентам, находящимся на терапии циклофосфамидом и его аналогами, в частности, при иммуносупрессивной терапии аутоиммунных заболеваний и в трансплантологии.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Благодарности. Авторы выражают свою признательность кандидату биологических наук, старшему научному сотруднику отдела лекарственной токсикологии ФГБНУ «НИИ фармакологии им. В.В. Закусова» Н.В. Ереминой за помощь в оформлении рукописи при подготовке к публикации.

Вклад авторов. Все авторы внесли равный вклад в подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией. Вклад каждого автора: А.К. Жанатаев — идея исследования, анализ результатов и источников, доработка текста, критическое рецензирование рукописи; А.В. Кулакова — микроскопический анализ, обработка первичного экспериментального материала, доработка текста; А.Д. Дурнев — концептуализация, анализ результатов и источников, написание первоначального текста, научное редактирование.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования. Работа выполнена при финансовой поддержке Министерство науки и высшего образования в рамках финансирования по теме № FGFG-2022-0002.

ADDITIONAL INFORMATION

Acknowledgements. The authors are grateful to senior research associate of the Department of Drug Toxicology N.V. Eremina for help in preparation of the manuscript for publication.

Author contribution. Thereby, all authors made a substantial contribution to the conception of the study, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the article, final approval of the version to be published, and agree to be accountable for all aspects of the study. The contributions of each author: A.K. Zhanataev — idea of the study, analysis of the results and literature data, finalizing the text, final critical review of the manuscript; A.V. Kulakova — microscopic analysis, processing of experimental material, finalizing the manuscript; A.D. Durnev — conceptualization, analysis of results and sources, initial text writing, scientific editing.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Funding source. This work was supported by the Ministry of Science and Higher Education through funding under No. FGFG-2022-0002.

Об авторах

Алий Курманович Жанатаев

Научно-исследовательский институт фармакологии им. В.В. Закусова

Автор, ответственный за переписку.
Email: zhanataev@academpharm.ru
ORCID iD: 0000-0002-7673-8672
SPIN-код: 7070-0510

канд. биол. наук, вед. научн. сотр. лаборатории фармакологии мутагенеза отдела лекарственной токсикологии

Россия, Москва

Алла Владимировна Кулакова

Научно-исследовательский институт фармакологии им. В.В. Закусова

Email: allakulak@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6959-2150
Scopus Author ID: 7006681153

канд. биол. наук, ст. научн. сотр. лаборатории фармакологии мутагенеза отдела лекарственной токсикологии

Россия, Москва

Андрей Дмитриевич Дурнев

Научно-исследовательский институт фармакологии им. В.В. Закусова

Email: addurnev@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0218-8580
SPIN-код: 8426-0380
Scopus Author ID: 7006060753

д-р мед. наук, профессор, чл.-корр. РАН, заведующий отделом лекарственной токсикологии

Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы