Genetic control of chlorophyll metabolism

Full Text

Список нестандартных сокращений: БХЛ — бактериохлорофиллы; МХ — магний-протопорфирин IX-хелатаза; Mg-ПП — магний-протопорфирин IX; Mg-ППМЭ — монометиловый эфир магний-протопорфирина IX; ОРС — открытая рамка считывания; ПБК — пигмент-белковые комплексы; ПБК2 — ПБК фотосистемы II; ПП — протопорфирин IX; Пд — протохлорофиллид; сПОР — светозависимая Пд-оксидоредуктаза; тПОР — светонезависимая Пд-оксидоредуктаза; ФГК — фотосинтетический генный кластер; ХД — хлорофиллид; ХЛ — хлорофиллы. ХЛОРОФИЛЛЫ В основе строения основных пигментов фотосинтеза — хлорофиллов (ХЛ) две составляющие: Mg-порфириновый скелет с различными заместителями и «хвост» — дитерпеновый спирт фитол, придающий молекуле способность встраиваться в липидный слой биологических мембран (рис. 1). Из фотосинтезирующих организмов выделено более 50 форм ХЛ. Небольшие различия в химическом строении приводят к существенным изменениям в спектральных свойствах этих пигментов, позволяя расширить диапазон светового излучения, используемого при фотосинтезе (табл. 1). XЛа и ХЛb — это пигменты растений и зеленых водорослей. У бурых и диатомовых водорослей, а также динофлагеллят, вместо ХЛb функционирует ХЛс, а у багрянок и некоторых цианобактерий — ХЛd. ХЛf, недавно обнаруженный в строматолитах (ископаемых остатках цианобактерий), способен поглощать инфракрасное излучение до 720 нм (Chen et al., 2010). Эубактерии, осуществляющие бескислородный фотосинтез (пурпурные и зеленые бактерии, гелиобактерии), содержат особые формы ХЛ — бактериохлорофиллы (БХЛ). Идентифицировано 6 основных видов БХЛ: а, b, с, d, e и g. Наличие БХЛа позволяет бактериям поглощать свет с длиной волны до 890 нм, а БХЛb сдвигает максимум поглощения в длинноволновую область инфракрасного излучения (табл. 1). Основные пигменты зеленых бактерий — это БХЛ с, d или е. БХЛg с максимумом поглощения 790 нм обнаружен у гелиобактерий (Brockmann, 1983). Ежегодно на Земле синтезируется (и подвергается деградации) около 10 9 тонн ХЛ, большая часть из которых формируется в океане. Растительный и бактериальный фотосинтез, в котором ХЛ участвуют в качестве светосборщиков и фотохимически-активных молекул, служит основным поставщиком органического материала для гетеротрофов, включая животных и человека. ХЛ функционируют в составе пигмент-белковых комплексов (ПБК) фотосинтетических мембран хлоропластов или хроматофоров. ИСТОРИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ. ДОСТИЖЕНИЯ И ПРОБЛЕМЫ Начало генетике пигментов растений было положено опытами Грегора Менделя по изучению наследования окраски семян и проростков гороха (Mendel, 1885). Этот «менделевский» ген удалось найти более 140 лет спустя — им оказался ген SGR (stay green), кодирующий один из белков системы деградации ХЛ (Armstead et al., 2007). В середине 20 века Самуэль Граник впервые показал, что гем и ХЛ имеют общий путь биосинтеза (Granick, 1950). Полученные им бесхлорофильные мутанты хлореллы накапливали протопорфирин IX (ПП) — биосинтетический предшественник гема. Спустя 18 лет, в лаборатории А. Сесермана (Săsărman et al., 1968) установили, что мутации, вызывающие дыхательную недостаточность у E. coli, нарушают гены ферментов биосинтеза гема, начиная от универсального предшественника всех тетрапирролов — 5-аминолевулиновой кислоты (АЛК) до ПП — последнего общего предшественника ХЛ и гема (рис. 2). Мутантные штаммы E. coli с дефектами отдельных шагов биосинтеза тетрапирролов в дальнейшем использовали для поиска гомологичных генов у других видов. Важным событием в генетике фотосинтеза стало обнаружение в геноме пурпурной несерной бактерии Rhodobacter (R.) capsulatus фотосинтетического генного кластера (ФГК) — участка хромосомы размером около 45 тпн, содержащего близко-сцепленные гены структурных белков аппарата фотосинтеза и всех ферментов биосинтеза каротиноидов и БХЛа (Zsebo and Hearst, 1984). Секвенирование ФГК и эксперименты по направленной инактивации открытых рамок считывания (ОРС) с последующей проверкой мутантного фенотипа позволили впервые получить нуклеотидные последовательности генов, контролирующих реакции биосинтеза ХЛ. Позднее, их ортологи были найдены в геномах растений и водорослей. Для клонирования генов, кодирующих все ферменты биосинтеза ХЛ у высших растений (табл. 2), потребовалось около 20 лет. В 1989 году была опубликована первая нуклеотидная последовательность гена POR ячменя (Schulz et al., 1989), а через 17 лет удалось прочитать последний в этом ряду ген арабидопсиса DVR, который кодирует фермент, превращающий дивинильные формы ХЛа в моновинильные (Nagata et al., 2005). Несмотря на хорошую изученность ферментативного аппарата (Миронов, 1998; Шестаков, 1998, Tanaka, 2007), ряд вопросов в генетике биосинтеза ХЛ остаются открытыми до сих пор. Некоторые этапы биосинтеза у водорослей и растений требуют наличия кислорода (табл. 2). Вместе с тем, многие бактерии синтезируют БХЛ в отсутствие О2. Такие анаэробные ферменты и кодирующие их гены найдены далеко не во всех известных случаях. Мало исследованы и механизмы формирования ХЛ в темноте. У покрытосеменных растений это светозависимый процесс (Беляева, Литвин, 2007), поскольку превращение протохлорофиллида (Пд) в хлорофиллид (ХД) осуществляет хорошо изученный фотоэнзим НАДФ: протохлорофиллидоксидоредуктаза (сПОР). Способность большинства фотосинтетиков (в том числе голосеменных, мхов, водорослей и фототрофных бактерий) зеленеть и в темноте обеспечивает альтернативный светонезависимый ферментный комплекс тПОР, кодируемый у эукариот хлоропластными генами. При этом у зеленой водоросли хламидомонады известны мутации (yellow1-10 и lts3) ядерных генов, нарушающие светонезависимый биосинтез ХЛ (Timko, 1998; Шалыго и др., 1990). Идентификация этих генов позволит обнаружить еще неизвестные факторы, участвующие в темновых процессах формирования ХЛ. В настоящее время активно ведется и поиск генетических детерминантов, контролирующих регуляцию метаболизма пигментов и связанных с ним процессов биогенеза хлоропластов (Masuda and Fujita, 2008). Значительный вклад в решение этой проблемы внесли исследования мутантов с нарушенной регуляцией синтеза ХЛ таких модельных объектов генетики фотосинтеза, как арабидопсис (Arabidopsis thalianum), зеленая водоросль хламидомонада Chlamydomonas (С.) reinhardtii и бактерии R. cupsulatus и Synechocystis sp. PCC. С накоплением экспериментальных данных становится все более очевидным, что ферменты и интермедиаты биосинтеза ХЛ являются участниками регуляторных процессов, обеспечивающих системный контроль, — сложный аппарат факторов и сигналов, необходимых для оптимальной работы генетических механизмов растительной клетки в меняющихся условиях ее существования. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ФЕРМЕНТОВ БИОСИНТЕЗА ХЛОРОФИЛЛОВ Генетические исследования позволили не только найти гены ферментов метаболизма природных тетрапирролов: ХЛ и гема, но и охарактеризовать их структуру и свойства. У фотосинтезирующих эукариот формирование ХЛ и каротиноидов проходит в хлоропласте. Подавляющее большинство ферментов их биосинтеза кодируются ядерными генами и синтезируются в цитоплазме как предшественники, имеющие N-концевые хлоропластные транзитные пептиды, которые обеспечивают их транспорт через мембраны пластид. В пути биосинтеза молекул ХЛ можно выделить 3 основных этапа: 1. синтез 5-аминолевулиновой кислоты (АЛК) — первого предшественника всех тетрапирролов; 2. превращение АЛК в протопорфирин IX (ПП) — последний общий предшественник гема и хлорофиллов; 3. специфические реакции синтеза ХЛ. Последовательно рассмотрим каждый из них. 1. Синтез АЛК Известны два способа образования АЛК, которые носят названия С4 и С5 пути. Все эукариоты, не имеющие хлоропластов, и α-протеобактерии (включая фототрофные бактерии рода Rhodobacter) используют С4 — путь Шемина, который состоит в конденсации глицина и сукцинил-КоА ферментом АЛК-синтетазой (Astner et. al., 2005). В клетках нефотосинтезирующих эукариот АЛК образуется в митохондриях и служит для биосинтеза гема и цитохромов. Формирование АЛК у ХЛ-содержащих организмов (за исключением α-протеобактерий) идет по С5-пути из 5-углеродного предшественника — глутаминовой кислоты. Он включает три энзиматические реакции, в которых участвуют 4 функционально-активные молекулы, локализованные в строме пластид: 3 фермента и глутаминовая транспортная РНК (тРНКГлу). Оба пути (С4 и С5) функционируют у зеленых водорослей: Scenedesmus obliquus и Euglena gracilis (Foley et al., 1982). На первом этапе С5-биосинтеза фермент глутамил-тРНК-синтетаза (glutamyl-tRNA synthase, GluRS) присоединяет тРНКГлу к глутамату. Затем следует превращение глутамил-тРНКГлу в глутамат-1-полуальдегид с освобождением тРНКГлу ферментом глутамил-тРНК-редуктазой (glutamyl-tRNAGlu reductase, GluTR) в присутствии NADPH и Mg2+. Далее, глутамат-1-полуальдегидаминотрансфераза (glutamate-1-semialdehyde aminotransferase, GSA-АT) c кофактором пиридоксальфосфатом осуществляют транс-аминирование глутамат-1-полуальдегида за счет переноса С4 аминогруппы в положение С5 с образованием АЛК. Ферменты С5-пути оказались настолько сходными для всех, изученных к настоящему времени видов растений, водорослей и бактерий, что реакционные компоненты из разных биологических источников, объединенные in vitro, способны синтезировать АЛК. Активируя глутамат, тРНКГлу запускает биосинтез тетрапирролов (Huang et al., 1984). Её критическая роль в формировании ХЛ была показана при изучении бесхлорофильного оранжевого мутанта эвглены, у которого причиной отсутствия пигмента оказалась точковая мутация — замена (С-56-U) в Т-петле тРНКGLU (Stange-Thomann et al., 1994). Гены тРНКГлу у всех фотосинтезирующих эукариот консервативны и локализованы в хлоропластной ДНК (хлДНК). Поиски тРНК, специфичных для синтеза тетрапирролов, к настоящему времени не увенчались успехом, и представление о том, что одни и те же молекулы участвуют в образовании ХЛ и синтезе белков, остается актуальным. Исключением из этого правила стала бактерия Acidithiobacillus ferrooxidans, у которой один из трех генов тRNAГлу кодирует молекулу, не имеющую сродства к ферменту GluTR (Levicán et al., 2005). В хлоропласте тРНКГлу узнается тремя белками: GluRS, GluTR и фактором элонгации EF-Tu, и, по-видимому, служит предметом конкурирования синтезов белков и тетрапирролов, координируя тем самым оба этих процесса при формировании ПБК фотосинтетических мембран. Установлено ее участие в регуляции транскрипции генов хлоропласта (Hanaoka et al., 2005), которую ведут две РНК-полимеразы: NEP (nuclear encoding RNA polimerase) и PEP (plastid encoding RNA polimerase), кодируемые, соответственно, геномами ядра и хлоропласта. В процессе индуцируемого светом синтеза хлоропластных мембран тРНКГлу связывается с NEP, ингибируя ее активность, и тем самым осуществляет переключение на PEP, которая преимущественно транскрибирует гены, контролирующие фотосинтез. GluRS как и остальные аминоацил-тРНК-синтетазы, участвует в синтезе белков. Первый специфичный для синтеза тетрапирролов фермент — это GluTR. История клонирования кодирующих его генов началась с экспериментов по трансформации мутанта E. coli hemA, ауксотрофного по АЛК, геномной библиотекой E. coli. В результате были получены прототрофные трансформанты, у которых фрагмент ДНК, встраивание которого вело к компенсации эффекта мутации hemA — восстановлению синтеза АЛК, содержал ген, кодирующий GluTR. Он получил название HemA (Li et al., 1989). Этим методом геномной комплементации, — по способности компенсировать мутантный фенотип штамма E. coli hemA (Pontoppidan and Kannangara, 1994), гены, гомологичные HemA, были найдены у целого ряда растений (арабидопсиса, ячменя, огурцов и др.). GluTR — ключевой фермент в регуляции биосинтеза ХЛ (рис. 3). Его активность ингибируется гемом и Пд через регуляторные белки (Srivastava et al., 2005). Экспрессию генов, кодирующих GluTR, контролируют свет и растительные гормоны (McCormac et al., 2001). Фермент GSA-AT впервые был выделен из стромы хлоропластов ячменя (Grimm et al., 1989). Вслед за установлением первичной структуры, по последовательности аминокислот этого белка были сконструированы праймеры для ПЦР-амплификации фрагмента кДНК кодирующего его гена, который послужил зондом для скрининга библиотеки кДНК. Итогом работы стало получение полной нуклеотидной последовательности гена GSA, которую далее использовали для поиска ортологичных генов у E. coli и цианобактерии Synechococcus PCC 6311 (Grimm et al., 1991). К ауксотрофности по АЛК у E. coli приводят мутации в двух генах: уже упомянутом HemA, кодирующем GluTR, и HemL, первоначально названным PopC (Wulff, 1967). Геномная комплементация мутанта popC показала, что дефектный у него ген HemL кодирует фермент GSA-АT (Ilag et al., 1991). В дальнейшем, его ортологи были изолированы у многих объектов (Timko,1998). Белок GluTR представляет собой V-образный димер, и его пространственная структура предполагает способность к образованию стабильного комплекса с молекулой GSA-AT (рис. 4). Модель их совместного функционирования подтверждают результаты экспериментов in vitro — рекомбинантные белки обоих ферментов С. reinhardtii образуют физический и функциональный комплекс (Nogaj, Beale, 2005). 2. Синтез протопорфирина IX из АЛК При конденсации восьми молекул АЛК образуется первый порфирин порфобилиноген, который затем, в четыре энзиматических шага, превращается в ПП. Все имеющиеся данные указывают на абсолютную универсальность этих биосинтетических реакций как у про- так и у эукариот. На этом этапе порфирины становятся гидрофобными и фотореактивными, что делает их опасными для растительной клетки. ПП и его производные — сильные фотосенсибилизаторы, — соединения, способные под действием света генерировать активные формы кислорода: синглетный кислород и (или) перекисные радикалы. Они, окисляя липиды, разрушают мембраны хлоропласта (Шалыго, 2004). 2.1. От АЛК к уропорфириногену III Конденсацию двух молекул АЛК с образованием пиррольного кольца порфобилиногена осуществляет фермент порфобилиногенсинтетаза, называемый АЛК-дегидратазой (ALA-dehydratase, ALAD). Реакция проходит в присутствии двухвалентных катионов цинка или магния. У высших растений и водорослей фермент активируется Mg 2+, тогда как у животных и цианобактерий — Zn 2+. Далее, порфобилиногендеаминаза (porphobilinogen deaminase, PBGD) ведет полимеризацию 4 молекул порфобилиногена с образованием нестабильного линейного тетрапиррола гидроксиметилбилана, — субстрата уропорфириноген III-синтетазы (uroporphyrinogen (co)synthase, UROS), формирующей макроцикл уропорфириногена III. Все эти ферменты локализованы в строме хлоропласта и имеют слабое сродство с мембранами. Первые работы по клонированию генов, кодирующих ALAD, PBGD и UROS, были выполнены на мутантах E. coli K12, неспособных синтезировать гем. Их отбирали по признаку дыхательной недостаточности (гем входит в состав цитохромов), с последующей проверкой ауксотрофности по АЛК и промежуточным субстратам биосинтеза гема (Alefounder et al., 1988). Гены E. coli: hemB, hemC, HemD, кодирующие вышеперечисленные ферменты, были найдены в результате экспериментов по трансдукции геномной библиотекой таких мутантов, образующих мелкие колонии, и оценке уровня соответствующей ферментативной активности у трансдуктантов, формирующих колонии нормального размера. Вскоре гены, кодирующие PBGD, были клонированы и у ХЛ- содержащих организмов: эвглены (Sharif et al., 1989), шпината и др. (Timko, 1998). Мутации в этом гене у арабидопсиса ведут к нарушениям вегетативного роста и репродуктивных функций растений (Quesada et al., 2013). У C. reinhardtii был клонирован только ген Alad АЛК-дегидратазы (Matters, Beale, 1995). Кодирующие UROS гены клонированы у цианобактерии Anacyistis nidulans (Jones et al., 1994) и ряда нефотосинтезирующих организмов. В ядерных геномах C. reinhardtii и арабидопсиса обнаружены их ортологи. 2.2. Путь от уропорфириногена III (УРО III) к протопорфирину IX (ПП) Превращения УРО III происходят или за счет его последовательного метилирования либо декарбоксилирования. В ходе метилирования синтезируются фактор F430 и корриноиды (производные витамина B12). Второй путь ведет к образованию гема и ХЛ (рис. 2). Молекулы ПП образуются из УРО III в результате трех ферментативных реакций. Фермент уропорфириноген III-декарбоксилаза (uroporphyrinogen III decarboxylase, UROD) конвертирует УРО III в копропорфириноген III. Затем копропорфириноген III-оксидаза (coproporphyrinogen III oxidase, CPOX) последовательно декарбоксилирует два остатка пропионовой кислоты боковых цепей колец I и II (при C3, а затем при С8) до винильных групп с образованием бесцветного протопорфириногена IX. Третий фермент — протопорфириноген IX-оксидаза (protoporphyrinogen IX oxidase, PPOX) окисляет его до красного пигмента ПП. При наличии молекулярного кислорода это окисление может происходить химически. UROD из клеток млекопитающих — предмет активного изучения медицинской генетики. Нарушения его функциональной активности в результате мутаций в гене UROD, ведут к развитию тяжелых заболеваний — порфирий, наследуемых по аутосомно-доминантному типу (Brancaleoni et al., 2007). Наряду с бесхлорофильными организмами, у которых фермент кодирует ген hemE, ортологичные ему гены были клонированы и секвенированы у Synechococcus PCC7942 (Kiel et al., 1992), табака и ячменя (Mock et al., 1995). Фермент CPOX у большинства фотосинтетиков активен только в присутствии кислорода. Способность некоторых анаэробных бактерий синтезировать гем и ХЛ, указывала на существование иных механизмов образования протопорфириногена IX. Изучение механизма окислительного декарбоксилирования у E. coli и S. typhimurium показало, что за аэробную и анаэробную реакции отвечают разные ферменты, кодируемые негомологичными генами hemF и hemN соответственно (Xu, Elliott, 1993; 1994). В геноме арабидопсиса есть последовательность, гомологичная бактериальному гену hemN анаэробного фермента, но не получено доказательств ее функциональной активности. У С. reinhardtii найден только ген аэробного фермента Cpx1, гомологичный hemF (Hill and Merchant, 1995). Гены, кодирующие UROD и CPOX, клонированы и секвенированы у ряда растений, начиная с сои (Madsen et al., 1993) и табака (Kruse et al., 1995). Два изоэнзима PPOX (хлоропластный и митохондриальный) первоначально были обнаружены в листьях ячменя (Jacobs, 1987), а гены, кодирующие этот фермент, впервые были клонированы у бактерий: E. coli (Sasarman et al., 1993) и Bacillus (B.) subtilis (Hansson, Hederstedt, 1994). Они получили названия hemG и hemY, соответственно. Это разные гены, контролирующие две ферментные системы. Впервые у растений нуклеотидная последовательность гена PPOX протопорфириноген IX- оксидазы была прочитана после секвенирования клона из к ДНК- библиотеки арабидопсиса, который компенсировал эффект мутации ауксотрофности hemG по гему у E. coli (Narita et al., 1996). Тем же методом геномной комплементации были найдены 2 гена PPOX1 и PPOX2 табака Nicotiana tabacum, кодирующие ферменты хлоропласта и митохондрий, соответственно (Lermontova et al., 1997). Для поиска этого гена у С. reinhardtii была использована иная стратегия, — когда мутанты по интересующему гену получают как штаммы, устойчивые к ингибиторам кодируемого им фермента. PPOX является мишенью для габакулина и ацифлюорфена — фототоксичных гербицидов из группы дифениловых эфиров. При обработке гербицидами в растительной клетке накапливается его субстрат — протопорфириноген IX, который, окисляясь химически, превращается в фотосенсибилизатор ПП. Был получен устойчивый к ацифлюорфену мутант Rs3, у которого доминантная мутация в ядерном гене нарушала взаимодействие фермента с гербицидом. Фрагмент геномной ДНК размером 10 тпн, содержащий ген устойчивости Rs3, был клонирован и секвенирован. Rs3 оказался геном PPX, кодирующим PPOX С. reinhardtii, точковая мутация G → A в котором определяет устойчивость к ацифлюорфену в результате замены V-389-M в аминокислотной последовательности белка (Randolph-Anderson et al., 1998). ПП — последний общий предшественник в биосинтезе гема и ХЛ становится субстратом для двух хелатаз, встраивающих в его молекулу катионы железа (Fe 2+) или магния (Mg 2+). Несмотря на сходные функции и один и тот же субстрат, Mg-ПП-хелатаза (МХ) и Fe-хелатаза — разные по структуре и свойствам ферменты. В условиях in vitro включение Fe 2+ происходит самопроизвольно и не требует энергии АТФ. Fe-хелатаза представляет собой полипептид длиной от 308 (у B. subtilis) до 466 (у арабидопсиса) аминокислотных остатков, кодируемый геном HemH. У фотосинтетиков фермент локализован в пластидах и в митохондриях, но основной синтез гема происходит в пластидах (Masuda et al., 2003). Напротив, встраивание Mg 2+ в порфириновое ядро является сложной АТФ-зависимой реакцией и осуществляется только в хлоропласте (Walker, Willows, 1997). 3. Специфические реакции образования хлорофиллов 3.1. Ранние этапы биосинтеза ХЛ К ним относят реакции, ведущие к формированию протохлорофиллида (Пд) из ПП. Они не требуют света и проходят одинаково у всех фотосинтезирующих организмов как про- так, и эукариот. Первый специфический фермент биосинтеза ХЛ — Мg-ПП-хелатаза (МХ) встраивает магний в молекулы ПП. Это гетеромультимерный комплекс, состоящий из трех субъединиц: I, D и H, кодируемых генами: CHLI, CHLD и CHLH соответственно. Энзиматическая реакция начинается с формирования Mg 2+- и АТФ-зависимого комплекса субъединиц I и D, который затем взаимодействует с субъединицей H, связывающей ПП. Продукт реакции — Mg-ПП. Метилирование остатка пропионовой кислоты в положении 6 макроцикла Mg-ПП, ведет к образованию его монометилового эфира. Реакцию осуществляет фермент S-аденозил-L-метионин: Mg-протопорфирин IX-метилтрансфераза (Mg-protoporphyrin IX methyltranspherase, Mg-PPMT), используя S-аденозил-L-метионин, как донор метильных групп. Циклизация монометилового эфира Mg-ПП (Mg-ППМЭ) с образованием дивинилпротохлорофиллида — трехступенчатая реакция, которую катализирует окислительная циклаза Mg-протопорфирин IX- монометилового эфира (Mg-protoporphyrin IX monomethyl ester cyclase, Mg-PPME). Белки CHLI и CHLD имеют в своем составе N-концевые Mg-АТФ-связывающие модули AAA+ (ATPases Associated with diverse cellular Activities), при объединении формирующие три димерных структуры, конформация которых зависит от присутствия АТФ или АДФ. Молекула D-белка содержит пролин-богатый участок и С-концевой домен интегрин I, через который происходит объединение субъединиц I и D с образованием комплекса АТФ-I-D (Lundqvist, 2010). Субъединица H образует комплекс с субстратом, связывая ПП своими N и С-концевыми участками. В отсутствии ПП белок подвергается деградации (Sirijovski et al., 2008). Работа фермента зависит не только от наличия АТФ, но и от целостности мембран хлоропластов — функциональный комплекс МХ ассоциирован с мембранами через регуляторный белок GUN4 (Adhikari, 2011). Этот фермент сходен с белками, вовлеченными в биосинтез двух других классов металлопорфиринов: корриноидов и фактора F430. Все три субъединицы МХ ортологичны белкам Ni-хелатазы (Beale, 1999). Помимо выполнения ферментативных функций МХ участвует в распределении молекул ПП по двум биосинтетическим «ветвям». При снижении ее активности, незадействованный ферментом ПП становится субстратом для биосинтеза гема, который, накапливаясь в избытке, репрессирует активность GluTR — первого фермента пути биосинтеза ХЛ. Так на метаболическом уровне происходит регулирование уровня синтеза молекул ХЛ (рис. 3). Первые данные о генах, кодирующих МХ, появились в связи с обнаружением ФГК в геномах бактерий R. capsulatus и R. sphaeroides. Он включает около 30 ОРС, которые были клонированы в составе плазмид и использованы для сайт-специфического мутагенеза. Блокирование трех ОРС приводило к появлению мутантов, накапливающих ПП (Bollivar et al., 1994). Эти три гена получили названия bchD, bchH и bchI, а кодируемые ими белки — BchD, BchH и BchI оказались субъединицами МХ, поскольку в экспериментах in vitro демонстрировали ферментативную активность в присутствии АТФ и катионов магния (Gibson et al., 1995). Гены, кодирующие МХ высших растений, были найдены при изучении бесхлорофильных инсерционных мутантов. У Т-ДНК-мутанта Ch42 (cs) арабидопсиса, инактивированным оказался ортолог гена bchI малой (I) субъединицы Rhodobacter (Koncz et al., 1990), а у мутанта Antirrhinum majus (львиный зев), полученного в результате Tam3-транспозонного мутагенеза, блокированный ген olive кодировал белок CHLH большой субъединицы МХ (Hadson et al., 1993). Генетические исследования бесхлорофильных оранжевых мутантов зеленой водоросли C. reinhardtii позволили идентифицировать 2 гена, блокирование которых ведет к накоплению ПП в темноте, — CHLH и LTS3 (Чекунова и Квитко, 1986; Wang et al., 1974). Мутации в гене CHLH вызывали гибель клеток при освещении, а lts3-мутанты сохраняли способность зеленеть на свету. Клонирование гена CHLH показало, что он кодирует большую субъединицу МХ, а мутации chl1 и brs-1 являются вставками (+1) в экзонах 9 и 10 этого гена (Chekunova et al., 2001). Фактор, кодируемый геном LTS3, оказался регулятором транскрипции генов, кодирующих белки МХ, — в темноте он активирует их экспрессию (Чекунова, Савельева, 2010). Если гены CHLH и CHLD у арабидопсиса и C. reinhardii однокопийны, то малую субъединицу CHLI у них, соответственно, кодируют два и три гена: CHLI (1–2) и CHLI (1–3), по-видимому, появившиеся в результате дупликации (Apchelinov et al., 2007). Субъединица CHLH, а также субстрат и продукт ее функционирования — ПП и Mg-ПП, задействованы в пути передачи сигналов из хлоропласта в ядро за счет взаимодействия со связывающим ПП белком GUN4 (Sobotka et al., 2008). Неспособность к образованию таких комплексов у большинства известных мутантов по гену CHLH арабидопсиса: cch (P-642-L), gun5 (A-990-L) и brs-1 хламидомонады ведет к блокированию этого сигнального пути (Masuda, Fujita, 2008). Фитогормон абсцизовая кислота (АБК) подавляет метаболизм фотосинтезирующей клетки, обеспечивая адаптацию растений к неблагоприятным условиям среды. Поиски рецепторов АБК у арабидопсиса привели к выделению белка, названного ABAR (abscisic acid receptor), который оказался молекулой CHLH (Shen et al., 2006). Эффекта связывания АБК с H-субъединицей МХ ячменя не было установлено (Müller, Hansson, 2009), и участие этого белка в гормональной регуляции еще предстоит выяснить. Малая субъединица МХ — CHLI оказалась способной связываться с тиоредоксинами, участвующими в редокс-регуляции белков хлоропласта (Ikegami et al., 2007). Недавно появились данные о взаимодействии CHLH и сигма фактора SigE, связывание которых у Synechocystis ингибирует транскрипцию SigE-зависимых генов (Osanai et al., 2009). По-видимому, CHLH — ключевой компонент в пути биосинтеза ХЛ. Помимо выполнения ферментативных функций, он участвует в передаче сигналов от хлоропласта к ядру, задействован в транскрипционной регуляции и является звеном в путях гормонального и редокс-контроля. Ген bchM, кодирующий Mg-PPMT, впервые был найден в геноме R. capsulatus при инсерционном анализе ФГК, — его продукт в экстрактах E. coli метилировал Mg-ПП (Gibson et al., 1995). Ортолог этого гена — chlM вскоре обнаружили у Synechocystis PCC 6803 методом функциональной комплементации мутанта bchM R. capsulatus (Smith et al., 1996). Сравнительно недавно ген CHLM, кодирующий этот фермент у арабидопсиса, был найден как гомолог гена chlM Synechocystis sp, — инсерционный мутант по этому гену накапливал Mg- ПП и белок CHLH и демонстрировал высокий уровень репрессии ядерных генов, участвующих в фотосинтезе (Pontier et al., 2007). Сниженный уровень экспрессии генов коровых белков обеих фотосистем и светособирающего комплекса установлен и для бесхлорофильных мутантов по гену CHLM C. reinhardtii, которые в темноте накапливали субстрат фермента — Mg-ПП и гибли на свету (Meinecke et al., 2010). Также как и МХ, фермент Mg-PPMT в клетке имеет «двойную» локализацию: в оболочке хлоропласта и в мембранах тилакоидов в соотношении, близком к 1:30 (Block et al., 2002). Накапливаются данные, свидетельствующие о тесном физическом взаимодействии этих ферментов (Alawady et al., 2005). При определении трехмерной структуры CHLH было показано, что продукт каталитической реакции — Mg-ПП подвергается метилированию, оставаясь связанным с CHLH (Sirijovski et al., 2008). Mg-PPME у растений и водорослей активен только в присутствии кислорода и при сохранении целостности хлоропластных мембран. У фототрофных бактерий его кодирует ген анаэробного фермента bchE (Yang, Bauer, 1990). При мутационном анализе ФГК пурпурной бактерии Rubrivivax gelatinosus был получен мутант acsF, который накапливал Mg-ППМЭ в условиях аэробного роста, а при анаэробном выращивании не отличался от дикого типа по уровню ХЛ (Pinta et al., 2002). Напротив, мутации в гене bchE приводили к такому фенотипу только в анаэробных условиях или при низком содержании О2. Двойной мутант acsF/bchE накапливал Mg-ППМЭ при всех условиях, демонстрируя, что за аэробную и анаэробную циклизацию отвечают разные гены. Нуклеотидные последовательности этих двух генов оказались различны, также как и характер их экспрессии: транскрипция гена acsF была чувствительной к кислороду, а bchE — не зависела от О2 (Ouchane et al., 2004). Так были получены генетические доказательства существования двух биосинтетических путей циклизации Mg-ППМЭ: аэробного и анаэробного. Ортологи «анаэробного гена» bchE не найдены у зеленых водорослей и высших растений. Последовательности, гомологичные гену AcsF обнаружены у многих организмов, включая пурпурные бактерии, цианобактерии (за исключением строгого анаэроба Chlorobium tepidum), зеленые водоросли и высшие растения. В геноме C. reinhardtii есть два ортолога гена AcsF: Crd1 и Cth1 (Moseley et al., 2000), а у арабидопсиса только один — CHL27 (Tottey et al., 2003). Первичная структура продукта гена AcsF позволяет отнести фермент к классу металлосодержащих монооксигеназ, к которым также относятся аэробные копропорфириногеноксидаза (HemF) и рибонуклеотидредуктаза (NrdB) E. сoli. У большинства фотосинтетиков ХЛa представляет собой гетерогенную смесь моно- и дивинильных форм молекул, финальная композиция которых зависит от вида, условий роста и стадии развития организма (Rebeiz et al., 1994). Конверсию 3,8-дивинил-тетрапирролов до 3-моновинилтетрапирролов осуществляет фермент 3,8-дивинилпротохлорофиллид-8-винил редуктаза, кодируемый геном DVR (Nagata et al., 2005). 3.2. Заключительные стадии синтеза ХЛ Они включают восстановление протохлорофиллида (Пд) до хлорофиллида (ХД) и этерификацию его фитолом с образованием ХЛ. Превращение Пд в ХД катализируют две различные Пд-оксидоредуктазы: светозависимая сПОР и функционирующий в темноте комплекс тПОР. У голосеменных, мхов, лишайников, водорослей и эубактерий, оба этих фермента определяют способность зеленеть как на свету, так и в темноте. Эволюционно более молодые покрытосеменные растения утратили тПОР, и при росте в темноте они формируют этиолированные ростки (желтые, накапливающие Пд). Свет активирует сПОР, запуская процесс зеленения — синтез ХД и далее ХЛ. Хотя оба фермента выполняют одну функцию — редукцию двойной связи в IV пиррольном кольце макроцикла, они различаются структурно и по механизму действия. Последний этап формирования молекулы ХЛ — это этерификация фитолом — присоединение фитольного «хвоста» к остатку пропионовой кислоты в позиции С17. Ген POR, кодирующий фотоэнзим сПОР, впервые был клонирован у ячменя (Schulz et al., 1989). Авторам удалось выделить фермент из листьев растений в количестве, достаточном для создания антител, которые далее использовали для изоляции гена POR из кДНК экспрессирующей библиотеки методом иммунодетекции. Позднее этот ген был найден по гомологии у различных растений: пшеницы, овса, гороха, арабидопсиса, сосны и др. (Reinbothe, 1996). История его клонирования у С. reinhardtii связана с мутантами класса yellow (желтый в темноте, зеленый на свету). Фенотип такого температурочувствительного мутанта y-1–4, неспособного зеленеть на свету при рестриктивной температуре, оказался результатом одной мутации pc-1 — сдвигу рамки считывания в ядерном гене POR1, кодирующем сПОР (Li, Timko, 1996). В геноме арабидопсиса найдено несколько паралогов этого гена: PORA, PORB, PORC (Oosawa et al., 2000), также как и у ячменя (Holtorf, Apel, 1996), и некоторых голосеменных (Skinner, Timko, 1999), а у цианобактерий и хламидомонады он уникален. С. Граник (Granick, 1959) первым обнаружил, что добавление экзогенной АЛК к растущим в темноте этиолированным проросткам, вызывает накопление предшественников ХЛ (от ПП до Пд). Позднее было установлено, что механизм, в норме препятствующий накоплению этих фототоксичных соединений, состоит в обратном ингибировании синтеза АЛК протохлорофиллидом (рис. 3), и обнаружен белок FLU, который через взаимодействие с ферментом GluTR ингибирует синтез АЛК (Meskauskiene et al., 2001). Мутанты арабидопсиса с нарушенной регуляцией хлорофиллобразования накапливали в темноте избыточное количество Пд и имели повышенную активность синтезирующих АЛК ферментов. Они были названы flu (fluorescent), из-за ярко-красной флюоресценции Пд при облучении этиолированных проростков синим светом (λ400–450 нм), и несли аллельные мутации в ядерном гене FLU. Для его изоляции использовали стратегию позиционного клонирования и установили, что этот ген кодирует белок размером 316 аминокислот. Вскоре два белка, гомологичные FLU, были найдены и у С. reinhardtii. Эти белки FLP (Flu-Like Protein) протяженностью 373 и 386 аминокислот — результат альтернативного сплайсинга транскриптов ядерного гена FLP (Falciatore et al., 2005). Иммунодетекция показала, что они локализованы в мембранах хлоропласта и способны специфически связывать фермент GluTR, ингибируя синтез АЛК. Экспрессия гена FLP позитивно регулируется светом, а в условиях темнового роста — интермедиатами биосинтеза хлорофилла: ПП, Mg-ПП и Пд. У описанного еще в 1974 году мутанта ячменя tigrina-d, накапливающего Пд в темноте (Nielsen, 1974), затронутый мутацией ген, оказался ортологом гена FLU арабидопсиса (Lee et al., 2003). Обнаружено три гена, обеспечивающих превращение Пд в темноте. У Rcapsulatus они были обозначены как: bchB, bchL и bchN, а их ортологи, позднее найденные в геномах хлоропластов эукариот, получили названия: chlB, chlL и chlN. Эти гены кодируют три субъединицы (B, L, N) фермента тПОР, аминокислотные последовательности которых сходны с субъединицами: NifK, NifH, NifD нитрогеназы соответственно (Armstrong, 1998). Недавно у R capsulatus был найден еще один, подобный нитрогеназам фермент, участвующий в биосинтезе БХЛа — ХДа-оксигеназа (chlorophyllide oxydoreductase, COR). Три гена: BchX, BchY, BchZ из ФГК бактерии кодируют его субъединицы (Nomata et al., 2006). Фермент, осуществляющий присоединение фитольного «хвоста» к молекуле ХД, был выделен из R. capsulatus и назван бактериохлорофилл а-синтетазой. Найден был и кодирующий его ген BchG (Bollivar et al., 1994). Впоследствии в геномах C. reinhardii и высших растений были обнаружены его ортологи — СHLG (Garcia-Gil et al., 2003). Фитол — мононенасыщенный спирт (С20 Н39 ОН) — синтезируется из геранилгеранил-дифосфата (ГГ-ДФ), который подвергается редукции ферментом геранилгеранилредуктазой с образованием фитил-дифосфата (фитил-ДФ). Он кодируется генами: bchP/CHLP (у бактерий и эукариот соответственно) и участвует также в биосинтезе каротиноидов. ХЛ-синтетаза в качестве субстрата может использовать оба изопрена: фитил-ДФ и ГГ-ДФ. На тилакоидных мембранах хлоропластов световая энергия адсорбируется светособирающими ПБК двух фотосистем. Типичный апопротеин ПБК2 связывает 17 молекул пигментов, из которых 3 — каротиноиды (ксантофилы) и 14 молекул хлорофиллов (8 — ХЛа и 6 — ХЛb). ХЛб — дополнительный пигмент растений, водорослей и прохлорофит, доля которого составляет 15–50 % от общего содержания ХЛ. В процессе его биосинтеза происходит последовательное двухступенчатое окисление метильной группы в положении 7 макроцикла до формильной. Реакцию катализирует фермент хлорофиллид/хлорофилл а-оксигеназа (chloropyllide/chlorophyll a oxygenase, CAO) в присутствии кислорода. Субстратом для него могут служить как ХДа, так и ХЛа. Мутанты без хлорофилла «б» впервые были получены на арабидопсисе (Hirono, Redei, 1963). Позднее их нашли у многих других высших растений, включая ячмень, кукурузу и рис. Генетический анализ таких мутантов ячменя показал, что к утрате ХЛб ведут мутации из одной группы комплементации, свидетельствуя, что синтез ХЛб контролируется одним генетическим локусом (Simpson et al., 1985). Первый мутант хламидомонады без ХЛб был описан в 1976 году (Ладыгин В. Г., 1976), а гибридологический анализ подобных мутантов показал, что отсутствие ХЛб обусловлено рецессивными мутациями в ядерном гене Cbn1 (Мирная и др., 1990). После молекулярной идентификации с помощью инсерционных мутантов C. reinhardii, не способных синтезировать ХЛб, ген получил название CAO (chlorophyll «a» oxygease) — по кодируемому ферменту хлорофиллид/хлорофилл а-оксигеназе (Tanaka et al., 1998). В дальнейшем его нуклеотидную последовательность использовали для поиска гомологичных генов у других объектов. Синтез ХЛб в растительной клетке регулируется на уровне транскрипции гена CAO и посттрансляционно, — избыточное его накопление запускает механизм протеалитической дестабилизации фермента хлоропластной протеазой CLP (Tanaka, 2007). КАТАБОЛИЗМ МОЛЕКУЛ ХЛОРОФИЛЛОВ Деградацию ХЛ наблюдают как потерю зеленой окраски (пожелтение) в разные периоды жизни растений: во время старения, созревания плодов и/или при гибели листьев от внешних факторов, включая экстремальные температуры и воздействия патогенов. Быстрое разрушение свободных ХЛ — адаптивное свойство, которое предотвращает фотодинамические повреждения, способствуя выживанию клетки. Ежегодно на планете подвергается распаду около 1,2 миллиардов тонн ХЛ (Hendry et al., 1987). В изучении механизмов этого процесса решающую роль сыграли мутанты с нарушенным катаболизмом пигмента, исследования которых позволили обнаружить ферменты деградации ХЛ (рис. 5) и кодирующие их гены (Hörtensteiner, 1999; 2006). ХЛ разрушается до водорастворимых

About the authors

Elena M Chekunova

Saint-Petersburg State University

Deptartament of Genetics and Biotechnology

References

Supplementary files