Аnalysis of the genetic variability of populations of land snail Сhondrula tridens Müll. (Gastropoda, Pulmonata) RAPD and ISSR markers

Full Text

Введение Настоящая работа является продолжением изучения популяционной структуры модельного вида наземных моллюсков Сhondrula tridens Müll. (трехзубая улитка) на территории Русской равнины. Исследования проводились в условиях лесостепного и степного ландшафтов юга Среднерусской возвышенности. Данный вид широко распространен в пределах Европы от юго-западной Франции до Урала, обитает в Крыму и на Кавказе, где населяет степные и полупустынные участки (Шилейко, 1984). В районе исследования моллюск обитает на меловых склонах, в балках, оврагах, а также в поймах рек. Вид относится к Средиземноморской реликтовой группе (Николаев, 1981). Благодаря своей эврибионтности и изменчивости конхиологических признаков Ch. tridens давно привлекает исследователей, анализирующих эволюционно-генетические процессы в природе (Матекин, 1950; Николаев, 1981; Гребенников, 1999; Крамаренко, Сверлова, 2003, 2006; Снегин, Гребенников, 2011; Комарова, Стойко, 2012). Но все эти работы были основаны только на морфометрических параметрах раковины. В наших предыдущих исследованиях популяционная структура этого вида на юге Среднерусской возвышенности была изучена с помощью анализа конхиологических признаков и аллозимов (Снегин, 2011 а). Но использование этих маркеров генетической структуры имеет ряд ограничений. Во-первых, морфометрические параметры раковины у этого моллюска не дискретны и подвержены модификационной изменчивости, что не позволяет проследить за генетическими процессами, протекающими в исследуемых группах. Во-вторых, известно, что белковые маркеры отражают изменчивость только в кодирующей части генома, которая по разным оценкам составляет около 10 % от общего количества ДНК, а остальная, так называемая «молчащая» ДНК, оставалась вне поля зрения. Поэтому, чтобы устранить этот недостаток, дальнейший анализ состояния популяционных генофондов Ch. tridens был проведен нами на основе RAPD-, ISSR-маркеров ДНК, применение которых основано на использовании одного праймера, имеющего множественные комплементарные участки, разбросанные по всему геному. Материал и методика Материалом для исследования послужили образцы тканей особей Ch. tridens, хранящиеся в криобанке, созданном при лаборатории популяционной генетики и генотоксикологии НИУ «БелГУ». Выборки из популяций были сделаны во время экспедиции в период с 2006 по 2010 годы. Моллюсков собирали вручную с поверхности почвы, со стеблей и листьев растений, иногда в подстилке. Всего было исследовано 1146 особей из двадцати пяти популяций Ch. tridens (табл. 1). Из них на территории Среднерусской возвышенности была изучена 21 естественная популяция, а также две адвентивные группы из г. Белгород, особи которых отличались наиболее крупными размерами [1], и сформировали в указанных пунктах репродуктивно обособленные от местных форм колонии. Особенно в пункте 21, где крупные особи живут в том же биотопе, что и аборигенные мелкие особи. Поэтому данный пункт мы условно разделили на две группы (21/1 и 21/2). Кроме того, для сопоставления нами были взяты выборки из популяций, обитающих на территории Урала и Причерноморья (пункты 23 и 24 соответственно). Анализ изменчивости проводили с использованием полимеразной цепной реакции — методы RAPD (Random amplified polymorphic DNA) (Welsh, McClelland, 1990) и ISSR (Inter simple sequence repeats) (Zietkiewicz et. al., 1994). Для анализа использовали три праймера (табл. 2). Амплификацию проводили в термоциклерах MJ Mini и MyCycler (Bio-Rad). Метод RAPD. Реакцию проводили в 20 мкл смеси, содержащей 20 нг геномной ДНК, ПЦР-буфер (10 мМ трис-НСl (рН 8,3), 50 мМ КСL, 2 мМ MgCl), 0,25 мМ dNTP, 0,5 мкМ праймера, 1 единица Taq ДНК-полимеразы (ингибированной для горячего старта). Реакция проходила в следующих условиях: «горячий старт» –2 мин/94 °С, 35 циклов (денатурация — –45 с/94 °С, отжиг праймера — 15 с/36 °С, 15 с/45 °С, синтез — 1 мин/72 °С), дополнительный синтез — 10 мин/72 °С, охлаждение до 4 °С. Метод ISSR. Реакцию проводили в 25 мкл смеси, содержащей 20 нг геномной ДНК, ПЦР-буфер (67 мМ трис-НСl (рН 8,8), 16 мМ (NH4)2SO4, 5 мМ β-меркаптоэтанол, 7 мМ ЭДТА, 3 мМ MgCl), 0,25 мМ dNTP, 0,5 мкМ праймера, 1 единица Taq ДНК полимеразы (ингибированной для горячего старта). Реакция проходила в следующих условиях: «горячий старт» — 2 мин/94 °С, 40 циклов (денатурация — 30 с/94 °С, отжиг праймера — 30 с/55 °С, синтез — 2 мин/72 °С), дополнительный синтез — 10 мин/72 °С, охлаждение до 4 °С. Продукты ПЦР разделяли с помощью электрофореза в 2%-м агарозном геле с использованием ТАЕ буфера, 100 В — 45 мин. Блоки окрашивали бромистым этидием. По картинам амплифицированных фрагментов, полученных в ходе электрофореза составляли бинарные матрицы, где присутствие полосы обозначалось как «1» (аллель p), отсутствие «0» (аллель q). Ввиду того, что при использовании метода RAPD могут появляться неспецифические продукты амплификации, для анализа мы использовали четко просматриваемые и воспроизводимые ампликоны. Критерием воспроизводимости было повторное проявление ампликонов после ПЦР у одних и тех же исследуемых особей. У данного вида нами обнаружено 49 локусов: 13 с использованием праймера ОРС 8 (метод RAPD), и по 18 локусов с использованием праймеров SAS 1 и UBC 827 (метод ISSR). Полученные ДНК-паттерны и их расшифровка приведены на рисунке 1. Обработка полученных данных проводилась с использованием программы GenAlEx (Peakall, Smouse, 2001), POPGENE 32 (Yeh et al., 2000), MEGA5 (Tamura et al., 2011). Полигоны Дебеца были построены при помощи программы Statistica 6.0. Результаты и обсуждение В таблице 3 представлены уровни гетерозиготности сорока девяти локусов, вычисленные на основе анализа двадцати пяти популяций. Согласно представленным данным наиболее полиморфными среди RAPD-маркеров являются локусы 3, 4, 6, 8 и 10, а среди ISSR-маркеров более изменчивыми оказались локусы 7, 9 и 16 по праймеру SAS 1, и локусы 6, 11, 13, 14 по праймеру UBC 827. В группу более мономорфных локусов вошли: по праймеру OPС 8 — локусы 12 и 13, по праймеру SAS 1 — локусы 1, 12 и 18, по праймеру UBC 827– локусы 1, 2, 3 и 18. Причем стоит отметить, что средняя гетерозиготность по RAPD локусам (He = 0,306 ± 0,010) выше, чем по ISSR локусам (по SAS 1 He = 0,235 ± 0,010; по UBC 827 He = 0,225 ± 0,011). Уровни гетерозиготности, а также графические полигоны исследуемых популяций по различным праймерам приведены на рисунках 2, 3 и в таблице 4. Согласно полученным данным, уровни изменчивости в популяциях Ch. tridens неодинаковы по различным локусам ДНК (рис. 2). Например, по локусам UBC 827 наименьшие значения гетерозиготности отмечены в пунктах «Клименково» (№ 18) и «Проточное» (№ 8). В последнем пункте зафиксирован также самый низкий для естественных популяций лесостепи показатель гетерозиготности по локусам ОРС 8 и SAS 1. В адвентивной колонии 21/2 отмечен низкий уровень гетерозиготности по локусам SAS 1. Причем в популяции местных улиток, обитающей в том же биотопе (21/1), показатели гетерозиготности по всем локусам значительно превосходят таковую в адвентивной группе. По соотношению частот аллелей эти две колонии также попали в различные кластеры (рис. 4). Это косвенно подтверждает выдвинутое нами ранее предположение об отсутствии скрещивания между улитками двух форм (Снегин, 2011 б). По совокупности всех ДНК-локусов наиболее гетерогенными оказались естественные популяции, обитающие в черте г. Белгород (пункты № 1 и 21/1) (табл. 4). Немного им уступают группы «Купянск» (№ 16), «Лисья гора» (№ 15), «Сапрыкино» (№ 7) и «Бекарюковский бор» (№ 2). Самой мономорфной является уже упомянутая популяция «Проточное» (№ 8), которая относится к группе популяций, обитающих в зоне влияния Стойленского и Лебединского горно-обогатительных комбинатов, где отмечается чрезвычайная раздробленность популяций ввиду активного освоения территории (создание карьеров, строительство дорог и путепроводов). Тем не менее стоит отметить, что в других популяциях этого района (пункты № 6, 7, 9, 10, 20) достоверного снижения уровня изменчивости нами не выявлено. Особенно это касается пункта 20 («ГОК»), где улитки обитают в изолированном биотопе, сформировавшемся сравнительно недавно (30 лет назад) на отвалах горно-обогатительных комбинатов, но соотношение частот аллелей и уровень изменчивости здесь (особенно по RAPD локусам) сопоставим с аналогичным показателем из других популяций, включая исконные группы из реликтовых особо охраняемых природных территорий (12, 13, 17, 18, 19). Такое генетическое сходство групп обеспечивается, вероятнее всего, не миграцией особей между популяциями, а тем, что в условиях изоляции в популяциях Ch. tridens увеличивается частота гомозиготных комбинаций по одним и тем же аллелям, что было показано нами ранее на примере изоферментных маркеров (Снегин, 2011 а). Последнее, вероятно, обеспечивается сходными векторами естественного отбора в условиях лесостепи, а также дрейфом генов и процессами генетической революции в изолированных группах (Майр, 1968). Кроме того, стоит подчеркнуть, что на юге лесостепи Среднерусской возвышенности площадь пригодных биотопов для Ch. tridens значительно больше, чем, например, для другого индикаторного моллюска Bradybaena fruticum (до 20 % от общей территории, против 9 %), т. к. трехзубая улитка, являясь ксеромезофилом, может обитать в разнообразном спектре условий: на меловых притеррасных склонах, в лесных массивах, в поймах рек, в балках и оврагах. Такая эвритопность способствует меньшей разобщенности популяций у этого вида по сравнению с кустарниковой улиткой. Но, обладая относительно слабой подвижностью, Ch. tridens в своем расселении по району исследования, вероятно, больше опирается на внешние для популяции факторы, такие как водные потоки, ветер, животные, а в последние столетия и человек. Тем не менее усиленная распашка территории и уничтожение естественных меловых сообществ нарушают миграционные процессы и ведут к повышению степени изоляции между группами, что находит свое отражение в рассчитываемых индексах подразделенности и среднего потока генов. Так, оценка степени дифференциации популяций Ch. tridens на основе модели, предложенной М. Неем (Nei, 1975), показала умеренную разобщенность изучаемых групп в условиях лесостепи (Gst = 0,177, табл. 5). При этом средний поток генов оказался больше единицы (Nm = 2,33) [2]. Известно, что средние величины Gst соответствуют уровню генетической дифференциации при селективно-нейтральном процессе. В таком случае локусы с большими значениями Gst, вероятнее всего, испытывают действие дизруптивного отбора, а локусы с низкими показателями индекса подразделенности подвержены влиянию стабилизирующего отбора (Динамика…, 2004). Согласно полученным данным (табл. 5), наибольшая дифференциация между популяциями зафиксирована по локусам OPC 8 — 11, SAS 1 — 17 и UBC 827 — 4, а наименьшая — OPC 8 — 3, SAS 1 — 8 и UBC 827 — 7. Анализ молекулярной дисперсии (AMOVA, Excoffier et al., 1992) (табл. 6) выявил также большее сходство между популяциями Ch. tridens. Только 19 % изменчивости пришлось на межпопуляционные различия, при этом Фst = 0,185, а Nm = 0,954. Данные свидетельствуют о сходных генетических процессах, протекающих в географически удаленных популяциях, но связанных единой ландшафтной структурой. Между тем кластерный анализ по ДНК-локусам, результаты которого показаны на рисунке 4, продемонстрировал отсутствие какой-либо географической привязки выделяемых кластеров, за исключением двух городских популяций из пунктов 1 и 21/1. То есть относительно большая генетическая дистанция наблюдалась, как между географически близко расположенными группами, так и удаленными. Это связано, как уже говорилось, с нарушением естественно сложившихся каналов миграции генов между популяциями в урбанизированном ландшафте. Данный вывод подтверждается тем, что попарные оценки индекса Фst не коррелируют со значениями географических расстояний между популяциями (рис. 5; R=0,082±0,069). Из групп улиток, взятых для сравнения, уральская популяция (№ 23) оказалась генетически более близкой к лесостепным популяциям, чем причерноморская группа (№ 24). Последняя сильно дистанцировалась от большинства изученных популяций лесостепного региона. Заключение Полученные результаты дают представление о структуре расселения и о состоянии популяционных генофондов Ch. tridens в условиях урбанизированного лесостепного ландшафта Среднерусской возвышенности. Согласно полученным данным, в популяциях этого моллюска, несмотря на давление со стороны человека, присутствует высокий уровень генетического полиморфизма, вероятно из-за обитания в широком диапазоне условий, включая весьма экстремальные для моллюсков открытые меловые склоны с резкими суточными колебаниями температуры и влажности. Тем не менее процессы инсуляризации, наблюдаемые на исследуемой территории, приводят к нарушению исторически сложившихся каналов миграции, что ведет к сильной изолированности популяций и к постепенной потере их аллельного разнообразия. Представленные результаты можно считать отправной точкой для дальнейшего мониторинга этого модельного вида с целью выяснения особенностей эволюционных процессов, происходящих в его популяциях.

About the authors

Eduard Anatolyevich Snegin

Belgorod national research university

Email: snegin@bsu.edu.ru
Doctor of Biological Sciences, Head of Department. Department of biocenology and ecological genetics

References

Supplementary files