The assessment of micronucleus frequency in lymphocytes in the cohort of coal-miners characterized by different polymorphisms of double strand break reparation genes

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Уголь - один из наиболее распространенных полезных ископаемых, служащих для получения энергии. Россия занимает 6-е место в мире по добыче угля и 1-е место по его запасам. Работники угледобывающих предприятий, помимо риска развития различных профессиональных заболеваний, подвергаются также воздействию целого комплекса генотоксических факторов, способных оказать серьезное влияние на организм. В воздухе выработок отмечается наличие полициклических ароматических углеводородов, тяжелых металлов и радона. Частицы угольной пыли, являющиеся переносчиками радионуклидов, попадают в легкие шахтеров, создавая источники внутреннего облучения. Степень генетических повреждений в результате воздействия генотоксикантов на организм человека зависит от эффективности функционирования репаративных систем. Оценка полиморфных вариантов генов репарации ДНК позволяет определить индивидуальную чувствительность обследуемого к комплексу генотоксических факторов и снизить риски путем составления индивидуальных рекомендаций для каждого работника. Несмотря на актуальность данной проблемы как для России, так и для других угледобывающих стран, исследование уровня цитогенетических повреждений у шахтеров в нашей стране не проводилось, а в мировой литературе встречаются довольно ограниченные и противоречивые результаты (Donbak et al., 2005; Kvitko et al., 2012; León-Mejía et al., 2011; León-Mejía et al., 2014; Rohr et al., 2013). МАТЕРИАЛы И МЕТОДЫ Материалом исследований послужила венозная кровь 129 работников угольных шахт Кемеровской области. Средний возраст в выборке составил 53 года, средний стаж работы на угледобывающих предприятиях - 26 лет. Лица, на момент участия в обследовании страдающие онкологическими и инфекционными заболеваниями, принимающие лекарственные препараты, обладающие подтвержденным мутагенным эффектом, а также проходившие рентгенологические процедуры за 3 месяца до сбора материала, исключались из исследования. Каждый обследуемый подписывал протокол информированного согласия на участие в эксперименте. Все исследования были выполнены в соответствии с требованиями этического комитета Кемеровского государственного университета. Оценку степени повреждения ДНК проводили с помощью микроядерного теста в лимфоцитах периферической крови, культивируемой в условиях цитокинетического блока (Fenech, 1993). В каждый культуральный флакон, содержащий 3,8 мл культуральной среды, добавляли 200 мкл венозной крови и 30 мкг фитогемагглютенина («ПанЭко», г. Москва) и культивировали 44 часа при температуре 37 °C. Далее в каждый флакон вносили 24 мкл цитохалазина Б («ПанЭко», г. Москва) и культивировали еще 24 часа. После окончания культивирования препараты обрабатывали гипотоническим раствором KCl и фиксировали (с использованием фиксатора Карнуа). Затем проводили окрашивание с помощью 2%-го раствора красителя Гимза («ПанЭко», г. Москва) и анализировали препараты с помощью микроскопа Nikon Eclipse 80i при увеличении ×1000 (Ингель, 2006). Критерии отбора лимфоцитов, включаемых в анализ, а также критерии регистрируемых цитогенетических повреждений соответствовали общепринятым рекомендациям (Fenech, 2000). На каждом препарате анализировали ядра 1000 лимфоцитов, в которых отмечались микроядра (МЯ), нуклеоплазменные мосты и ядерные протрузии. Выделение геномной ДНК из лимфоцитов проводили с использованием стандартного метода фенол-хлороформной экстракции. Для определения полиморфных вариантов генов репарации ДНК проводили аллель-специфическую End-Point ПЦР с использованием наборов НПФ «Литех» (г. Москва). Статистическая обработка результатов исследования была проведена в программе STATISTICA 7.0. Распределение частот цитогенетических повреждений сравнивали с нормальным (с помощью теста Колмогорова-Смирнова). На основании этого в дальнейшем использовали методы непараметрической статистики - ранговый U-тест Манна-Уитни для парного сравнения групп и тест Краскела-Уоллиса для сравнения 3 групп (Закс, 1976). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ В качестве кандидатных генов в данном исследовании были использованы гены репарации двунитевых разрывов ДНК Lig4 Thr9Ile и XRCC4 G1394T. Данный выбор обусловлен литературными данными о том, что ведущую роль в образовании МЯ играют именно двунитевые разрывы ДНК (Fenech et al., 2011). Кроме того, частоты встречаемости аллелей изученных генов в популяции достаточно высоки, что позволяет обнаруживать в выборках достаточное (для проведения ассоциативных исследований) количество всех полиморфных вариантов данных генов. В результате учета цитогенетических повреждений у шахтеров нами было установлено, что главный показатель - количество двуядерных лимфоцитов с МЯ в нашем опыте составил 11,16 ‰, что несколько выше аналогичных показателей, полученных другими исследователями. Так, в исследовании ученых из Колумбии количество лимфоцитов с МЯ составило 8,6 ‰ (León-Mejía et al., 2011), ученых из Бразилии - 7,46 ‰ (Rohr et al., 2013). В работе турецких исследователей, напротив, был получен результат, более чем вдвое превышающий показатель, отмеченный в нашей работе, - 27,17 ‰ (Donbak et al., 2005). Таким образом, имеющиеся данные о частотах цитогенетических повреждений, регистрируемых у шахтеров с помощью микроядерного теста, очень ограничены и противоречивы, что обусловливает необходимость проведения дополнительных исследований в данной области. Анализ уровня цитогенетических повреждений у носителей различных аллелей гена Lig4 Thr9Ile показал ряд статистически достоверных различий (табл. 1). Таким образом, носители гомозигот по минорному аллелю гена Lig4 Thr9Ile характеризовались повышенной частотой ряда цитогенетических повреждений. МЯ образуются из ацентрических хромосомных и хроматидных фрагментов, появляющихся в клетке в результате дефектов ферментов репарации двойных разрывов (Fenech et al., 2011). Обнаруженное превышение уровня лимфоцитов с МЯ у носителей генотипа Ile/Ile, вероятно, связано с пониженной активностью фермента ДНК-лигазы IV, катализирующей окончательный этап негомологичного соединения двунитевых разрывов. Возникновение протрузий связывают с воздействием на клетку ионизирующей радиации - в ряде исследований отмечалось наличие белкового комплекса RAD51 в данных цитогенетических аномалиях (Fenech et al., 2011). Полученные нами результаты могут свидетельствовать о повышенной чувствительности к экспозиции радоном шахтеров с генотипом Ile/Ile. Следует отметить, что сопоставить полученные результаты с литературными данными не представляется возможным, так как на настоящий момент отсутствуют работы, посвященные оценке уровня цитогенетических маркеров у работников угольных шахт с различными полиморфными вариантами генов репарации двунитевых разрывов ДНК. Значимых различий по уровню цитогенетических повреждений у носителей различных генотипов по гену XRCC4 G1394T выявлено не было. Кроме того, не было получено значимых различий по частоте лимфоцитов с нуклеоплазменными мостами у носителей различных полиморфных вариантов генов репарации двунитевых разрывов ДНК. ВЫВОДЫ Носители генотипа Ile/Ile по гену Lig4 Thr9Ile обладают повышенной чувствительностью к воздействию генотоксических факторов в угольных шахтах. Данный ген потенциально может служить маркерным и, наряду с другими генами, быть включенным в биологическую тест-систему для определения индивидуальной чувствительности шахтеров к комплексу неблагоприятных факторов.

About the authors

Maxim Yur'yevich Sinitsky

Kemerovo State University

Email: max-sinitsky@rambler.ru
PhD student, Biology Faculty, Department of Genetics

Valentin P. Volobaev

Kemerovo State University

Author for correspondence.
Email: volobaev.vp@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-7355-9882
SPIN-code: 2805-5700

Junior Researcher

Russian Federation, 6 Krasnaya str., Kemerovo, 650000

Maxim Aydarovich Asanov

Kemerovo State University

Email: asmaks988@gmail.com
Student, Biology Faculty, Department of Genetics

References

Supplementary files