Mitochondrial DNA d-loop polymorphism analysis for estimation of diversity in chicken flocks of Pavlov breed

Full Text

Введение На современном этапе развития науки изучение генетического разнообразия, центров происхождения, а также истории формирования пород домашних кур (Gallus gallus domesticus) тесно связано с внедрением и совершенствованием методов, основанных на применении молекулярно-филогенетических маркеров. К числу наиболее востребованных методов изучения доместификации сельскохозяйственных животных, в том числе кур, относится анализ полиморфизма последовательностей митохондриальной ДНК (мтДНК): либо некодирующей контрольной области (D-петли), либо полных митохондриальных геномов (Fumihito et al.,1994, 1996; Niu et al., 2002; Miao et al., 2013). Использование подобных маркеров позволяет определять количество материнских линий, участвовавших в формировании породы, оценивать их географическое происхождение, а также выявлять предполагаемые дикие предковые формы, послужившие основой для последующей селекции. МтДНК обладает рядом уникальных особенностей, позволяющих эффективно использовать маркеры на ее основе в филогенетических исследованиях широкого спектра организмов. МтДНК легко выделяется из биологических образцов, так как представлена в клетках большим числом копий. Гены мтДНК эволюционируют в 5-10 раз быстрее ядерных, при этом различные участки митохондриального генома изменяются с разной скоростью (Lynch, 2007), что позволяет выбирать наиболее подходящий маркер для исследований микро- и макроэволюционных процессов. МтДНК в большинстве случаев не рекомбинирует и наследуется по материнской линии, что значительно упрощает исследование и последующий анализ результатов. D-петля (D-loop, control region, CR) мтДНК курицы представляет собой некодирующую область длиной 1231/1232 п. н. (позиции 1-1231 в последовательности #AP003317 из базы данных GenBank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore). Здесь располагаются сайт инициации репликации и гипервариабельный домен размером 591 п. н. (Hoque et al., 2013), скорость накопления нуклеотидных замен в котором максимальна для мтДНК, что позволяет проводить филогенетические исследования с высоким разрешением, вплоть до дифференциации отдельных популяций (Stoneking et al., 1991). Гипервариабельный домен располагается в некодирующем участке ДНК, и возникшие в его последовательности мутации являются эволюционно нейтральными, что позволяет получать эволюционные схемы, максимально коррелирующие со временем дивергенции. Начиная с 2000 годов маркеры на основе мтДНК активно используются для изучения генетического разнообразия и истории происхождения современных пород кур. Особенно интенсивно исследуются популяции кур Юго-Восточной Азии, где располагались центры первоначального одомашнивания (Fumihito et al.,1994, 1996; Niu et al., 2002; Liu et al., 2004, 2006; Miao et al., 2013; Wu et al., 2014). В результате несколькими независимыми группами авторов (Liu et al., 2006; Miao et al., 2013) была разработана классификация гаплотипов мтДНК кур, основанная, в частности, на полиморфизме последовательности D-петли, что значительно упростило задачу изучения родственных связей между различными породами. Все многообразие существующих гаплотипов мтДНК кур согласно их генетическому сходству было сведено в 13 основных гаплогрупп (Miao et al., 2013). Отметим, что разработанная система гаплогрупп вместе с обширной базой данных секвенированных последовательностей D-петли мтДНК локальных популяций и традиционных пород кур из различных регионов мира (около 5000 последовательностей в базе данных GenBank) представляют ценный ресурс для детального изучения происхождения разных, в том числе и российских, пород домашней курицы. По данным лаборатории сравнительной генетики животных ИОГен РАН, где на протяжении многих лет проводились комплексные исследования генофондов отечественных пород и популяций одомашненных животных, на территории Российской Федерации разводятся около 50 пород домашних кур, созданных отечественной народной и промышленной селекцией (Моисеева, 2006). Среди них - широко известная за пределами России павловская порода, предположительно созданная в XVIII веке на территории Нижегородской губернии. Небольшой хохолок, большие борода и баки, крепкие оперенные ноги, черно-каемчатое золотистое или серебристое оперение придают этой породе экзотический, выразительный и запоминающийся вид. Обобщающее описание морфологических и генотипических характеристик, а также гипотез о происхождении этой декоративной породы дано в исчерпывающем обзоре И. Г. Моисеевой (Моисеева, 2006). Заметим, что после Октябрьской революции, событий Гражданской и Первой мировой войн, раскулачивания значительная часть поголовья павловской породы была утрачена, что привело к угрозе полного ее исчезновения (Серебровский, 1976). Долгое время существование породы поддерживалось лишь силами птицеводов-любителей, и только со второй половины ХХ века началась интенсивная работа по восстановлению павловской породы на базе научно-исследовательских институтов. В настоящий момент павловская порода активно разводится не только в России, но и за рубежом (Моисеева, 2006). Результаты исследования морфотипологических характеристик показали близость павловской породы с бентамками (русский королек) и тремя разновидностями шабо (японская бентамка), однако на весьма далеком от них расстоянии (Моисеева, 2006). Куры павловской породы из трех российских популяций были также протестированы по шести биохимическим локусам, контролирующим белки яйца и сыворотки крови. Сравнение частот локусов G (3) (вариант овоглобулина) и ES (1) (активность эстеразы-1 сыворотки крови) с аналогичными показателями европейских и азиатских пород выявило, что павловская относится к европейским курам. Коэффициент ожидаемой гетерозиготности (Нт) павловских кур составил 0,133 против 0,191 у «мирового» генофонда, 0,170 у европейских и 0,190 у азиатских пород (Моисеева, 2006). Таким образом, по морфологическим признакам куры павловской породы ближе к азиатским породам, а по биохимическим - к европейским. В настоящей работе проведен анализ полиморфизма D-петли мтДНК представителей павловской породы. Использование данного маркера в свете современных представлений о происхождении и генетическом разнообразии кур расширяет наши представления об истории формирования и современном состоянии генофонда одной из самых знаменитых российских пород кур. Материалы и методы Материалом исследования послужили образцы геномной ДНК 37 особей кур породы павловская из коллекции Федерального государственного унитарного предприятия «Генофонд» (ФГУП «Генофонд», г. Пушкин) - 10 особей, из популяции Всероссийского научно-исследовательского и технологического института птицеводства (ФГБНУ ВНИТИП, г. Сергиев Посад) - 18 особей, из частных хозяйств Алтая (г. Барнаул) - 9 особей. Амплификацию последовательности D-петли мтДНК (1231/1232 п. н.) кур выполняли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров 1F 5’-AGGACTACGGCTTGAAAAGC-3’ и 2R 5’-CATCTTGGCATCTTCAGTGCC-3’ (Niu et al., 2002). ПЦР проводили в 20 мкл реакционной смеси следующего состава: однократный буфер для Taq-полимеразы, 2 мМ MgCl2, 200 мкМ каждого нуклеотида дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ, 2,5 ед. Taq-полимеразы (все - НПО Силекс, Москва), 1 мкМ каждого праймера (НПО «Бигль», Санкт-Петербург), 100-400 нг геномной ДНК в качестве матрицы. Пробирки с реакционной смесью помещали в термоциклер MJ Mini (BioRad, США) и использовали следующую программу амплификации: денатурация 95 °C - 4’, далее 35 циклов 95 °C - 30”, 60 °C - 35”, 72 °C - 70”, завершающий синтез 72 °C - 10’. Электрофоретическая детекция полученных ПЦР-продуктов проводилась в 1 % агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. Секвенирование выполнялось с использованием анализатора ABI Prism 310 (Applied Biosystems, США). Помимо праймеров 1F и 2R для секвенирования применялись праймеры 3F 5’-TGGTTCCTCGGTCAGGCACATCC-3’ и 4R 5’-CGCAACGCAGGTGTAGTC-3’ (Oka et al., 2007). Полученные последовательности опубликованы в базе данных GenBank под номерами: KP307061-KP307097. Первичный анализ нуклеотидных последовательностей проводили в программе BioEdit v.5.0.9 (Hall et al., 1999). Нуклеотидный полиморфизм (Nd) и гаплотипическое разнообразие (Hd) анализировали при помощи программы DnaSP v.4.0 (http://www.ub.edu/dnasp/) (Rozas et al., 2003). Для анализа распределения выявленных гаплотипов по известным гаплогруппам мтДНК конструировали генетическую сеть с использованием метода медианного соединения (Median Joining, MJ) в программе Network 4.613 (http://www.fluxus-engineering.com/sharenet.htm) (Bandelt et al., 1999). Для построения медианной сети были использованы 37 полученных в данном исследовании первичные последовательности D-петли мтДНК кур павловской породы и 80 последовательностей (табл. 1) из общедоступной базы NCBI GenBank, принадлежащих к 11 гаплогруппам по классификации, предложенной Миао и соавторами (Miao et al., 2013). Результаты и обсуждение Мы провели анализ полной последовательности контрольного региона (D-петли) мтДНК у 37 особей из трех популяций кур породы павловская. Все нуклеотидные последовательности имели длину 1231/1232 п. н. В суммарной выборке представителей трех изученных популяций последовательность D-петли содержала 22 полиморфных сайта, в 16 из которых замены были представлены только транзициями, в 5 - только трансверсиями, а сайт в 859-м положении охарактеризован нами как индел (табл. 2). Исследованные выборки кур павловской породы характеризуются высокой полиморфностью - в трех популяциях в общей сложности выявлено 11 самостоятельных гаплотипов. При этом в популяции ВНИТИП присутствует 4 гаплотипа, в популяции из Барнаула - 5, в популяции ФГУП «Генофонд» - тоже 5. Один из выявленных гаплотипов был обнаружен во всех популяциях и оказался полностью идентичным эталонной последовательности D-петли белого леггорна (#AB098668 в базе данных GenBank (Nishibori et al., 2005)), что предполагает наличие общего для изученных популяций предка по материнской линии. Еще один гаплотип является общим для популяций ВНИТИП и Барнаула, остальные 9 гаплотипов специфичны для разных популяций. Нуклеотидное разнообразие, рассчитанное на основе сравнения полученных первичных последовательностей как среднее число нуклеотидных замен на позицию между двумя случайно выбранными последовательностями (Nei, 1973), оказалось минимальным для популяции ВНИТИП (табл. 3), так же как и гаплотипическое разнообразие. В совокупности это может указывать на то, что данная популяция первоначально была сформирована из особей, объединенных общим происхождением. Высокий уровень нуклеотидного и гаплотипического разнообразия, наблюдаемый в выборке кур из популяции ФГУП «Генофонд» (табл. 3), косвенно свидетельствует о существовании горизонтального потока генов между данной популяцией и неродственными ей популяциями других пород либо может указывать на то, что в основе данной популяции первоначально находились особи, имевшие различную генетическую историю. Для анализа положения выявленных гаплотипов D-петли представителей павловской породы в современной системе гаплогрупп мтДНК кур, а также анализа родственных связей между популяциями павловской породы была построена генетическая сеть методом медианного соединения (MJ). Всего в реконструкции было использовано 117 последовательностей D-петли, из которых 80 представляли гаплотипы, маркерные для 11 гаплогрупп мтДНК кур, а 37 - последовательности, полученные в настоящей работе. Мы проанализировали наиболее изменчивый фрагмент гипервариабельного домена D-петли протяженностью 251 нуклеотид (позиции 141-391 в последовательности AP003317). Всего было выявлено 49 вариабельных сайтов, из которых парсимониально информативными оказались 38. Из анализа полученной схемы (рис. 1) следует, что генофонд павловской породы кур представлен вариантами гаплотипов, входящих в две широко распространенные гаплогруппы - E1 и A (Liu et al., 2006; Miao et al., 2013). При этом гаплотипы гаплогруппы E1 характерны для представителей всех исследованных популяций павловской породы. Согласно последним данным, именно куры - носители гаплотипов гаплогруппы E1 первыми попали в Европу (Storey et al., 2012; Girdland et al., 2014). Это обстоятельство позволяет предположить, что предковые популяции, на основе которых формировалась павловская порода, могли иметь европейское происхождение. Все варианты рассматриваемого фрагмента D-петли, выявленные в популяции ВНИТИП (г. Сергиев Посад), оказались связанными с единственным гаплотипом из гаплогруппы Е1, что свидетельствует о генетической однородности и стабильности данной популяции (рис. 1). Аналогичная ситуация наблюдается и в популяции из Барнаула, где три выявленных гаплотипа также оказались связанными с гаплогруппой E1. Очевидно, что на протяжении долгого времени использование генетически удаленных особей других пород для восстановления и поддержания данных популяций носило ограниченный характер. Наиболее неоднородной, генетически смешанной оказалась структура популяции ФГУП «Генофонд» (г. Пушкин). Гаплотипы, характерные для этой популяции, принадлежат двум гаплогруппам Е1 и А. При этом в анализируемой выборке доминировали носители гаплогруппы A. Подобная структура генофонда популяции ФГУП «Генофонд», по-видимому, отображает процесс селекционной работы по усилению породных признаков павловской породы за счет активного включения в популяцию представителей генетически удаленных пород неевропейского или смешанного происхождения. Таким образом, основываясь на данных анализа полиморфизма последовательностей D-петли, можно утверждать, что в многолетней работе по сохранению и восстановлению кур павловской породы на сегодняшний день стали четко различимы две основные стратегии. Условно их можно обозначить «консервативной» и «реконструктивной». Консервативная стратегия заключается в опоре преимущественно на имеющийся генетический материал с низким вкладом в генофонд неевропейских представителей. На уровне митохондриального генофонда это выражается в отсутствии гаплотипов, неродственных гаплогруппе E1. Реконструктивная стратегия связана с модернизацией имеющегося генетического материала за счет активного привлечения неродственных пород и популяций с целью воссоздания, улучшения и усиления описанных в литературе признаков павловской породы. На уровне митохондриального генофонда это проявляется в значительном возрастании доли гаплотипов, удаленных от гаплогруппы E1. В результате подобной селекционной работы реконструкция фенотипических особенностей павловской породы происходит за счет перераспределения и замещения исходного генетического материала, что полностью исключает возможность изучения ранней истории формирования павловской породы по генетическим данным. Развитие описанных стратегий в обозримом будущем неминуемо привет к генетической фрагментации павловской породы и формированию нескольких филогенетически не связанных пород. Благодарности. Авторы выражают признательность А. Ф. Яковлеву и А. Коциняну за помощь в получении образцов ДНК. Практическая часть исследования была выполнена на оборудовании ресурсных центров «ЦКП Хромас» и «Развитие молекулярных и клеточных технологий» Научного парка Санкт-Петербургского государственного университета. Работа поддержана РФФИ (грант № 14-04-01469) и частично СПбГУ (# 1.50.1043.2014).

About the authors

Alexander Gennadievich Demin

Saint Petersburg State University

Email: rustle.reed@gmail.com
Postdoc, PhD, Department of Histology and Cytology

Maria Igorevna Danilova

Saint Petersburg State University

Email: noxforest@yandex.ru
Student, BSc, Department of Histology and Cytology

Svetlana Anatolievna Galkina

Saint Petersburg State University

Email: svetlana.galkina@spbu.ru
Assistant professor, PhD, Department of Histology and Cytology

References

Supplementary files