Research of the influence of LIG4 gene polimorphism on chromosomal aberrations level in human lymphocytes, with background and excessive exposure to radon

Cover Page

Abstract


Effects of the LIG4 gene polymorphisms rs1805388 (Thr9Ile) and rs1805389 (Ala3Val) on the level of chromosomal aberrations in peripheral blood lymphocytes have been estimated in children, that live and study in conditions of normal and excessive exposure to radon in several localitions of the Kemerovo region. There was no statistically significant difference between genotypic groups on the marker rs1805388 with regard to frequencies of cytogenetic indexes. At the same time, in the group of Val carriers (marker rs1805389) from second cohort our analysis revealed significant increase in the amount of paired fragments in comparison with homozygotes Ala/Ala.

Введение Генетические основы индивидуальной чувствительности человека к радиационному воздействию в настоящее время остаются изученными крайне слабо. И хотя имеются данные о наследственной предрасположенности к повышенной радиочувствительности (Kadhim et al., 2010), многие молекулярные аспекты процессов повреждения ДНК и компенсаторных механизмов еще предстоит установить. В этой связи актуальным является поиск ассоциаций между индуцированными радиацией цитогенетическими повреждениями в соматических клетках человека и отдельными полиморфными вариантами генов репарации ДНК, обеспечивающими стабильность генома. В ряде исследований (Минина и др., 2011; Сальникова и др., 2010; Au et al., 2003; Sram et al., 2006; Wilding et al., 2005) в качестве возможных маркеров повышенной чувствительности к радиационному воздействию рассматривались полиморфные участки генов эксцизионной репарации оснований (BER) и нуклеотидов (NER): XRCC1, XRCC3, APE1, XPD, hOGG1, ADPRT и др. Однако, по нашим сведениям, влияние полиморфизма гена лигазы-4 (LIG4), участвующего в процессах негомологичного воссоединения концов ДНК (NHEJ) (Jeggo, 1998), на показатели цитогенетического гомеостаза до сих пор не изучали. В данном исследовании мы оценили значение двух полиморфных маркеров гена LIG4 (rs1805388 и rs1805389) для формирования индивидуального уровня хромосомных аберраций в лимфоцитах крови лиц, подверженных хроническому воздействию излучений радона, и в контрольной группе. Вариабельность этих маркеров связана с нуклеотидными заменами C4044T и C4062T в экзонах, что приводит к замене одного аминокислотного остатка в зрелом белке Ala3Val и Thr9Ile соответственно. Материал и методы Обследованы две выборки детей и подростков, проживающих в условиях фонового уровня α-излучения (контрольная группа), и подвергающихся избыточному α-излучению за счет сверхнормативного воздействия радона и продуктов его распада («группа Rn»). Первая группа включала 185 мальчиков и девочек из сел Красное, Пача и Зарубино Кемеровской области (средний возраст обследованных составил 14,4 ± 0,19 года). Вторая группа сформирована из 368 детей и подростков обоих полов, постоянно проживающих и обучающихся в школе-интернате г. Таштагол Кемеровской области. Средний возраст детей данной группы составил 12,4 ± 0,14 года. На момент исследования все доноры были практически здоровы, не проходили медикаментозное лечение и не подвергались медицинским рентгенологическим процедурам в течение 3 месяцев, предшествовавших обследованию. На каждого обследуемого был оформлен протокол информированного согласия, подписанный родителями или лицами, осуществляющими опеку несовершеннолетних. Замеры удельной объемной активности радона в воздухе жилых и учебных помещений выполнены с использованием радиометра радона РРА-01 М-01 «Альфарад» в режиме Air 1 в период 2007–2011 гг. При проведении измерений ориентировались на нормативно-методическую документацию Минздрава России (2003) и Федерального центра гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора (2009). Культивирование клеток крови и подготовку препаратов хромосом проводили по стандартному протоколу, описанному ранее (Дружинин, 2003). Отбор метафаз, включаемых в анализ, и критерии для регистрации цитогенетических нарушений соответствовали общепринятым рекомендациям (Бочков и др., 1972). В среднем анализировали по 190 метафаз на каждого донора. Регистрировали все типы хромосомных аберраций, ахроматические пробелы в число аберраций не включали и фиксировали отдельно. В дальнейшем для каждого обследованного осуществляли пересчет общего числа аберраций на 100 клеток, что позволяет обобщать цитогенетические показатели, установленные для лиц с неравным количеством проанализированных метафаз. После соответствующей группировки данных единицей варьирования становились индивидуальные значения учитываемых цитогенетических показателей. Соответственно, вычисляемые при статистическом анализе ошибки средних значений отражали внутригрупповую изменчивость числа аберраций в пересчете на 100 клеток. Очистку геномной ДНК проводили путем экстракции смесью хлороформ/фенол (Sambrook et al., 1989). Для генотипирования аллелей rs1805388 и rs1805389 гена LIG4 использовали коммерческие наборы реагентов «SNP-экспресс» производства НПФ «Литех», г. Москва. Затем проводили аллель-специфическую ПЦР с последующей визуализацией результатов в 3%-м агарозном геле с добавлением бромистого этидия. Статистический анализ первичных данных выполняли с помощью ППП «STATISTICA v.6». Сопоставление групп осуществляли с использованием непараметрического метода Манна–Уитни. Статистически значимыми считали различия, соответствующие величине p < 0,05. Результаты исследования Результаты многолетнего мониторинга состояния радиационной обстановки на территориях, где проводилось исследование, были подробно изложены в ранее опубликованной работе (Минина и др., 2011). В ходе исследования было установлено, что средняя удельная объемная активность радона в воздухе помещений школы-интерната (г. Таштагол) на протяжении всего периода проведения радиологического мониторинга достоверно превышала соответствующий уровень, зарегистрированный на контрольных территориях. Расчеты с использованием норм радиационной безопасности (НРБ 99/2009) показали, что при постоянном пребывании на территории школы-интерната индивидуальная эффективная доза ингаляционного облучения детей только за счет изотопов радона и их короткоживущих дочерних продуктов в воздухе составляет около 20 мЗв/год. При этом доза, обусловленная растворением газообразного 222Rn в крови и последующим облучением внутренних органов, достигает 1 мЗв/год. Таким образом, результаты радиологических исследований позволили заключить, что условия проживания и обучения воспитанников школы-интерната г. Таштагола не соответствуют санитарно-эпидемиологическим нормам по параметрам радиационной безопасности. Установлено, что данная популяция подвержена хроническому воздействию сверхнормативных доз радонового излучения, что в свою очередь может вызывать выраженные генотоксические последствия. Сопоставление значений цитогенетических показателей, характеризующих уровень мутагенных эффектов, в двух группах обследованных позволило установить ряд статистических различий. Средняя частота аберраций у лиц из «группы Rn» достигала 4,4 ± 0,13, тогда как в контрольной выборке лишь 2,7 ± 0,11 (Um-w = 20654; p < 0,001) (табл. 1). Из всех выявляемых вариантов цитогенетических повреждений лишь обмены хроматидного типа имели в сравниваемых группах близкие значения, не отличающиеся достоверно. Особенно важен тот факт, что количество обменов хромосомного типа: дицентрических и кольцевых хромосом, являющихся маркерами радиационного воздействия, оказалось достоверно выше в выборке со сверхнормативным воздействием радона относительно соответствующего значения в контрольной группе (Um-w = 26924; p < 0,001). В ходе дальнейшего анализа были сопоставлены цитогенетические показатели у лиц, носителей различных аллелей LIG4 (маркер rs1805389, полиморфный вариант Ala3Val и маркер rs1805388, полиморфный вариант Thr9Ile), находящихся в условиях различающегося радиационного воздействия. В контрольной группе среди носителей генотипа Ala/Ala частота аберраций составила 2,4 ± 0,17, а среди представителей генотипической группы Ala/Val — 2,0 ± 0,28 (рис. 1). Отличие не являлось статистически значимым. По итогам генотипирования в «группе Rn» был выявлен только один носитель варианта Val/Val полиморфизма rs1805389, поэтому в дальнейшем он был включен в группу гетерозиготных доноров. Частота аберраций у гомозигот Ala/Ala из данной экологической группы в среднем составила 4,3 ± 0,15 (рис. 1). Среди носителей генотипов Ala/Val и Val/Val эта величина достигла 4,8 ± 0,44, но достоверно не отличалась от предыдущего значения. При дальнейшем рассмотрении количества и спектра выявленных хромосомных аберраций у представителей двух когорт с различным уровнем радиационного воздействия было установлено, что в обеих группах существенно преобладали аберрации хроматидного типа (табл. 2). В контрольной выборке у гомозигот Ala/Ala в среднем их выявлено 1,9 ± 0,14 на 100 клеток, у носителей варианта Ala/Val — 1,4 ± 0,23 на 100 клеток при отсутствии достоверного отличия по данному показателю. Среди аберраций хроматидного типа в обеих группах регистрировались одиночные фрагменты и крайне редко — обмены. Спектр хромосомных нарушений данного типа был сходный в двух группах, а численные значения отдельных типов аберраций достоверно не отличались. Как видно, в условиях сверхнормативного воздействия радона сохраняется преобладание аберраций хроматидного типа вне зависимости от генотипа обследованных (3,1 ± 0,13 и 3,3 ± 0,36 на 100 клеток в двух генотипических группах). Уровень аберраций хромосомного типа также повышается относительно контрольных значений как у гомозигот Ala/Ala, так и у прочих обследованных, достигая соответственно 1,2 ± 0,06 и 1,5 ± 0,15 на 100 метафаз. При этом в «группе Rn» среди лиц с генотипами Ala/Val и Val/Val наблюдается достоверное повышение количества парных фрагментов до 1,3 ± 0,13 по сравнению с уровнем, характерным для гомозигот Ala/Ala — 1,0 ± 0,05 (UM-U = 4456; p = 0,045). Значения прочих цитогенетических показателей статистически не отличались в двух генотипических группах. Мы оценили также количество спонтанных и индуцированных радоном хромосомных аберраций в лимфоцитах детей с различными полиморфными вариантами LIG4, маркер rs1805388 (аминокислотный полиморфизм Thr9Ile). Как и в случае маркера rs1805389, ввиду немногочисленности гомозигот по минорному варианту Ile (2 в контрольной и 4 в «группе Rn»), таких доноров в ходе дальнейшего исследования объединяли в одну группу с гетерозиготными обследованными. В контрольной группе среди носителей генотипа Thr/Thr средняя частота аберраций составила 2,8 ± 0,15, а среди представителей смешанной генотипической группы — 2,5 ± 0,22 (рис. 2) при отсутствии достоверного отличия. Количество аберраций у носителей сочетания Thr/Thr из «группы Rn» достигало в среднем 4,4 ± 0,16, а в когорте обследованных с прочими генотипами — 4,3 ± 0,31 при отсутствии статистического отличия между этими значениями (рис. 2). При анализе уровня хромосомных аберраций отдельных типов в группе сравнения установлено, что у гомозигот Thr/Thr число аберраций хроматидного типа составило в среднем 2,2 ± 0,12 на 100 клеток и статистически не отличалось от величины, характерной для носителей прочих генотипов — 1,9 ± 0,17 (табл. 3). Количество аберраций хромосомного типа практически совпадало в двух группах (0,7 ± 0,07 и 0,6 ± 0,09). У лиц, проживающих в условиях сверхнормативного воздействия радона, как среди гомозигот Thr/Thr, так и в смешанной генотипической группе, отмечено повышение частоты хроматидных аберраций (3,1 ± 0,13 и 2,9 ± 0,26 в двух группах соответственно) и хромосомных аберраций (1,3 ± 0,07 и 1,4 ± 0,12 в двух группах соответственно) относительно контрольных значений. Не было установлено статистически значимых отличий между величинами каких-либо цитогенетических показателей у обследованных из данной экологической группы с различными вариантами маркера rs1805388. Обсуждение результатов Анализ радиационной обстановки в местах обучения и проживания обследованных детей и подростков Кемеровской области показал, что в условиях школы-интерната г. Таштагол учащиеся испытывают хроническое сверхнормативное воздействие радона и продуктов его распада. Избыточное α-излучение, вероятно, стало причиной повышенного уровня хромосомных аберраций среди детей из этой группы (табл. 1). Причем в спектре аберраций, выявленных у представителей данной экологической группы, относительно большую долю составляют обмены хромосомного типа, их частота наиболее значительно отличалась от уровня, установленного в контрольной группе. Этот факт является дополнительным аргументом в пользу предположения о радиационном характере наблюдаемых хромосомных повреждений, так как именно перестройки хромосомного типа (в частности, дицентрические и кольцевые хромосомы) считаются цитогенетическими индикаторами воздействия радиации (Balakrishnan, Rao, 1999; Jha, Sharma, 1991). Сравнительный анализ цитогенетических показателей, характерных для выборок детей, проживающих и обучающихся в условиях фонового и сверхнормативного воздействия радона, показывает высокую значимость данного экологического фактора при формировании уровня хромосомных аберраций. При этом сверхнормативное воздействие излучений радона и продуктов его распада может являться своеобразным «проявителем» репарационных возможностей организма, находящихся в зависимости от генетической конституции индивидуума. Действительно, ранее было установлено, что при облучении культур лейкоцитов in vitro менее устойчивыми оказывались клетки доноров-носителей минорного аллель 977G гена hOGG1 и аллеля C589 и G1996 гена XRCC1 (Сальникова и др., 2010). В другой работе было выявлено дезадаптивное значение полиморфных вариантов 751Lys гена XPD, 194Trp и 399Gln гена XRCC1 и 241Met гена XRCC3 в условиях воздействия на клеточную культуру рентгеновских лучей (Kadhim et al., 2010). В нашем исследовании установлено, что в условиях фонового радиационного воздействия полиморфизм гена лигазы (маркеры rs1805388 и rs1805389), по-видимому, не имеет существенного значения при формировании индивидуального уровня хромосомных аберраций. Соотношение общего количества и отдельных типов повреждений хромосом у представителей разных генотипических групп из контрольной выборки достоверно не отличалось. Вне зависимости от сочетания аллелей rs1805388 и rs1805389 гена LIG4 сверхнормативное воздействие радона in vivo приводит к увеличению количества хромосомных нарушений (рис. 1, 2). При этом обращает на себя внимание широкий диапазон индивидуальных значений рассматриваемых цитогенетических показателей у представителей данной экологической группы, как у носителей маркера rs1805388, так и rs1805389. Очевидно, в сходных радиоэкологических условиях проживания индивидуумы с одинаковыми генотипами демонстрируют существенно отличающуюся резистентность к избыточному облучению. Причиной этого может являться специфика индивидуального сочетания аллелей прочих генов, а также влияние неучтенных экзогенных факторов. В то же время анализ количества аберраций отдельных типов на 100 клеток (табл. 2) позволил установить, что в условиях сверхнормативного воздействия радона наличие гомозиготного генотипа по маркеру rs1805389 может являться фактором более высокой устойчивости к избыточному радиационному воздействию установленного типа. Вместе с тем полиморфизм Ala3Val гена LIG4 нельзя считать ключевым фактором, определяющим варьирование индивидуальной чувствительности к воздействию излучений радона и продуктов его распада.

Aleksey Nikolayevich Volkov

volkov_alex@rambler.ru
Kemerovo State University

docent, candidate of biological sciences

Tatyana Aleksandrovna Golovina

druzhinin_vladim@mail.ru
Kemerovo State University

chief engineer, Chair of Genetics

Vladimir Gennadyevich Druzhinin

druzhinin_vladim@mail.ru
Kemerovo State University

professor, doctor of biological sciences

Aleksey Viktorovich Larionov

larionov@mail.ru
Kemerovo State University

engineer, candidate of biological sciences

Varvara Ivanovna Minina

vminina@mail.ru
Institute of Human Ecology SB RAS

senior research fellow, candidate of biological sciences

Anna Aleksandrovna Timofeyeva

vminina@mail.ru
Institute of Human Ecology SB RAS

engineer, Laboratory of Сytogenetics

Views

Abstract - 255

PDF (Russian) - 220

PlumX


Copyright (c) 2013 Volkov A.N., Golovina T.A., Druzhinin V.G., Larionov A.V., Minina V.I., Timofeyeva A.A.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.