Combination of rice blast resistance genes in the genotypes of russian rice varieties with the use of marker assisted selection

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Рис — одна из основных продовольственных культур во всем мире, представляющая собой основной продукт питания для более чем 60 % населения мира. Его выращивают на всех континентах, за исключением Антарктиды. Он имеет огромное экономическое значение, более 23 % от потребляемых населением мира калорий получают из риса. Различные патогены приносят большие убытки при выращивании культуры. Самой вредоносной болезнью является пирикуляриоз, вызываемый грибом Pyricularia oryzae Cav., который представляет собой серьезную угрозу для мировой продовольственной безопасности. Снижение урожая от него в годы эпифитотий достигает иногда 100 % [1]. Это заболевание присутствует почти во всех странах и агроэкологических зонах, где выращивается рис, и вызывает поражение листьев, междоузлий и метелок. Количество риса, теряющееся от этой болезни ежегодно, таково, что можно обеспечить пищей 60 миллионов человек [2]. Ежегодно в мире применяется для борьбы с пирикуляриозом 20–30 тыс. тонн фунгицидов [2], в том числе 220–380 тонн в России [3]. Проводятся химические обработки против других патогенов, что оказывает неблагоприятное влияние на среду обитания и здоровье человека.

Выращивание сортов, резистентных к болезням, представляет собой перспективный способ защиты риса без применения химикатов. Выведение таких сортов и оперативное внедрение их в сельское хозяйство — самое эффективное действие для устранения этой болезни. Однако создание устойчивых сортов — наиболее сложное направление селекции. Pyricularia oryzae Cav. обладает огромным спектром вариабельности, что в комплексе с его большими способностями к размножению обусловливает успешную приспособляемость.

Линии, совмещающие в себе два и более локуса Pi, часто демонстрируют существенное повышение уровня устойчивости к этой болезни и имеют большую ценность при создании сортов. В связи с этим в сельскохозяйственном производстве нужно возделывать болезнеустойчивые сорта, совмещающие в одном генотипе несколько генов, каждый из которых вносит свой вклад по этому признаку.

Резистентность к пирикуляриозу обусловлена классической схемой «ген на ген» [4], когда основной аллель устойчивости эффективно действует против штаммов P. oryzae Cav., имеющих соответственный ген авирулентности [5]. Белки растений, определяющие устойчивость, кодируются семейством сцепленных генов. Высокая вариабельность продуктов этих генов позволяет препятствовать заражению новыми вирулентными видами и расами патогенов.

В ходе генетических экспериментов было определено более 100 генов, повышающих резистентность к этой болезни — Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-b, Pi-ta, Pi-z и др. [2, 6].

Обобщая информацию о локализации генов устойчивости риса к пирикуляриозу в геноме, была построена генетическая карта с позициями генов [7]. Расположение генов устойчивости было установлено путем выявления BAC- или PAС-клонов, содержащих последовательности клонированного гена или фланкирующих маркеров [8].

Во многих источниках отмечается, что гены, влияющие на устойчивость к пирикуляриозу, расположены совместно близко друг к другу на хромосомах 6, 11 и 12 [9, 10]. На 6-й хромосоме не менее 14 генов были выявлены в районе центромеры [7]. Среди них Pi-2, Pi-z-t и Pi-9клонированы и обнаружены в одной и той же части хромосомы. Они встроены в генный кластер, содержащий тандемно повторяющиеся гены NBS-LRR [11, 12].

На длинном плече хромосомы 11 картированы по крайней мере девять генов (Pi-1, Pi-7, Pi-18, Pi-f, Pi-34, Pi-38, Pi-44(t), PBR, Pi-lm2) и шесть аллелей локуса Pi-k. На хромосоме 12 вблизи центромеры были картированы не менее 17 генов устойчивости (Pi-ta, Pi-ta-2, Pi-tq6, Pi-6(t), Pi-12, Pi-12(t), Pi-19(t), Pi-20(t), Pi-21(t), Pi-24(t), Pi-31(t), Pi-32(t), Pi-39(t), Pi-62(t), Pi-157(t), IPi и IPi3) [7]. Анализ протеома линий с разными аллелями Pi-ta показал, что белки восприимчивых и устойчивых сортов различаются по одной аминокислоте [9].

Применение ДНК-маркеров, тесно сцепленных с генами резистентности растений риса к P. oryzae Cav., значительно облегчает селекционную работу в этом направлении. Способы молекулярного маркирования дают возможность существенно ускорить введение целевых генов в ходе селекции и обеспечить создание современных сортов, интегрирующих комплект нужных признаков [13].

Стратегии улучшения должны рассчитывать не на один ген, а на несколько объединенных генов для долговременной устойчивости, так как гриб имеет сложный набор рас и олигогенная устойчивость зачастую преодолевается возбудителем за очень короткий промежуток времени. Поэтому нужно выращивать устойчивые к пирикуляриозу сорта риса, которые имеют в своем геноме группу генов, вносящих свой вклад в резистентность. Сорта, обладающие комбинацией из 3–5 генов устойчивости, показывают более значительное увеличение и расширение диапазона резистентности к пирикуляриозу, чем единичные гены.

В некоторых странах реализованы успешные селекционные программы по созданию устойчивых к пирикуляриозу сортов риса методом пирамидирования генов с применением маркерной селекции. Например, в Колумбии пирамидирование генов Pi-1, Pi-2 и Pi-33 в геноме использовали в качестве стратегии селекции, эффективной для создания сортов риса с длительной устойчивостью к пирикуляриозу [14].

В Китае перспективная линия G46B, используемая для получения гибридного риса, но поражаемая пирикуляриозом, была скрещена с тремя сортами риса — Digu, BL-1 и Pi-4, обладающими генами Pi-d(t), Pi-b и Pi-ta2 соответственно [15]. В процессе пирамидирования выделено 15 растений с этими тремя генами резистентности. Эти результаты показывают возможности маркерной селекции в работах по повышению устойчивости риса к болезням [15].

Селекция высокоурожайных сорта риса с надежной устойчивостью к пирикуляриозу является одним из приоритетов в Китае и в странах, где возделывание риса — главное направление в сельском хозяйстве. Эффективность и точность селекции резистентных сортов во многом зависят от создания маркеров, специфичных для целевого гена. Для гена Pi-39 был разработан специфический маркер (InDel), основанный на вставке-делеции [16]. Этот ген был успешно введен в два лучших сорта с использованием генотипического и фенотипического отбора. Пять выделенных линий BC3F3 показали высокий уровень устойчивости к пирикуляриозу. По крайней мере 97,5 % их генома было унаследовано от их рекуррентных сортов. Агрономические признаки четырех линий (D94, D98, D112 и D113) были так же хороши, как и у рекуррентного родителя [16].

В работе других китайских селекционеров три гена резистентности (Pi-1, Pi-2, Pi-33) из донорных образцов риса C101-Lac и C101-A-51 были перенесены в элитный сорт Jin 23В путем гибридизации и беккроссов. Шесть почти изогенных линий Jin 23В с тремя генами резистентности были созданы с помощью сочетания традиционной и маркерной селекции. Резистентность трехгенных линий была выше, чем моногенных. Следовательно, пирамидирование генов устойчивости к пирикуляриозу представляет собой результативный подход для улучшения сортов риса по устойчивости к этой болезни [17].

В Индии гибриды F1, F2 от скрещивания между восприимчивым к пирикуляриозу высокоурожайным сортом риса ADT 43 и резистентной почти изогенной линией (NIL) CT13432–3R, несущей четыре гена устойчивости к пирикуляриозу — Pi-1, Pi-2, Pi-33 и Pi-54, были использованы для изучения взаимодействия генов, контролирующих признаки устойчивости к болезням и урожайности [18]. Взаимодействие генов было комплементарным по числу продуктивных побегов, урожайности, количеству поражений, инфицированной площади листьев, однако для остальных признаков наблюдали эпистаз. Среди генотипов, испытанных в условиях эпифитотий, линии с несколькими генами имели более высокую устойчивость к пирикуляриозу по сравнению с образцами, несущими единичные гены. Это указывает на то, что неаллельные гены имеют комплементарный эффект, когда присутствуют вместе. Информация о генетике различных признаков, способствующих повышению устойчивости, будет в дальнейшем помогать селекционерам растений в выборе подходящей стратегии селекции на устойчивость к пирикуляриозу и повышение урожайности риса [18].

У некоторых сортов подвида indica были обнаружены два гена устойчивости, Pi-b и Pi-ta, которые были изучены на молекулярном уровне и перенесены в сорта подвида japonica [5, 9, 19]. Они контролируют синтез протеинов, обеспечивающих резистентность к пирикуляриозу [19].

Оба гена Pi-b и Pi-ta относятся к наиболее распространенному типу генов резистентности NBS-LRR, которые кодируют белки, содержащие нуклеотид-связывающий домен (NBS), а также рецепторный район с более высоким содержанием лейцина (LRR) [19].

Ген резистентности к пирикуляриозу Pi-b открыл японский ученый Shinoda (1971) у сортов риса indica. В 1978 г. были получены изогенные линии ВL-1–BL-7 на сортах japonica, получивших от устойчивых образцов фрагмент хромосомы 2 с геном Pi-b [20]. В дальнейшем этот ген был клонирован и секвенирован [21]. Ген Pi-b эффективно защищает рис от пирикуляриоза в районах производства риса на юге России [22].

Во Всероссийском НИИ риса (лаборатория биотехнологии) ранее была создана система внутригенных маркеров гена Pi-b [23]. С применением маркеров на основе ПЦР-анализа выведены хорошие селекционные образцы с этим геном на базе генотипов сортов Янтарь и Хазар [24].

Другой доминантный секвенированный ген устойчивости к пирикуляриозу — Pi-ta вносит свой вклад в формирование иммунитета риса [9]. Он тоже относится к типу генов устойчивости растений — NBS-LRR [25].

Присутствие в коллекции образцов, имеющих гены Pi-b и Pi-ta, дало нам возможность провести работу по выведению на их базе сортов риса с пирамидированными генами устойчивости.

Ген Pi-40, по данным литературных источников, обладает высокой степенью устойчивости к различным патогенным расам возбудителя пирикуляриоза [26]. Этот ген был перенесен в геном культурного риса Oryza sativa L. в результате гибридизации с дикорастущим австралийским видом O. australiensis Domin. и последующих беккроссов. Реципиентом послужил сорт подвида japonica из Кореи. Сначала была выведена линия IR65482-4-136-2-2, на основе которой был создан ряд селекционных линий, несущих ген Pi-40 [27].

Этот ген расположен на коротком плече в шестой хромосоме. Выявлено два микросателлитных локуса (RM527 и RM3330), находящихся с двух сторон от гена Pi-40 на расстоянии 1,1 и 2,4 сМ [27]. Они являются кодоминантными, что позволяет различить аллельное состояние этого гена, и используются при анализе расщепления в потомстве для определения гибридных растений, несущих доминантный аллель Pi-40 в гомозиготном состоянии [27].

Для выведения новых сортов риса может быть использован генетический полиморфизм. Достижения в молекулярной генетике риса позволяют применять технологии ДНК-маркирования. Расшифровка генома риса и клонирование генов обеспечивают возможность получения внутригенных маркеров, ценных для использования в селекции. Данный подход существенно расширяет границы возможностей обычной селекции. При помощи надежных маркеров к генам, контролирующим устойчивость риса к пирикуляриозу или другие хозяйственно значимые признаки, можно существенно уменьшить период создания новых форм растений, ускорить перемещение ценных аллелей в генотипы реципиентов и вывести новые сорта с комплексом ценных признаков [13, 28]. Положительный момент заключается в том, что на молекулярные маркеры не оказывают влияния условия выращивания и их можно определять на любой фазе онтогенеза растений. Таким образом, выведение резистентных высокоурожайных сортообразцов риса с группой генов Pi с использованием ДНК-маркеров, сцепленных с локусами устойчивости, является актуальным.

Цель наших исследований — получение линий риса с 2–6 генами резистентности к пирикуляриозу: Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-ta, Pi-b, Pi-40 методом молекулярного маркирования.

Практическая значимость состоит в том, что с применением эффективной стратегии маркерной селекции удалось объединить несколько различных генов Pi на генетической базе российских сортов и создать устойчивые к изменчивым расам возбудителя пирикуляриоза образцы риса, которые можно выращивать без использования фунгицидов. Впервые в Ростовской области при помощи маркерной селекции были созданы комплексно устойчивые к пирикуляриозу сорта риса Магнат, Пентаген и другие.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Продуктивные скороспелые отечественные сорта подвида japonica Вираж и Боярин были взяты в качестве отцовских сортов-реципиентов. Линии подвида indica С101-А-51 (Pi-2), С101-Lас (Pi-1 и Pi-33) (CIRAD, Франция), Мороберекан (Pi-b), IR-58 (Pi-ta), IR-83243-2-1-24-4-B (Pi-40) (IRRI, Филиппины), взятые в качестве материнских форм, выступали в качестве доноров. В данной работе использовали не оригинальные сорта Мороберекан и IR-58, а полученные ранее скороспелые чистые линии из гибридов Аметист × Мороберекан (Л-10189, ВНИИ риса) и IR-58 × Кубань 3 (Л-10136, ВНИИЗК).

Пирамидирование генов осуществляли с помощью ступенчатой гибридизации. На первом этапе исследований в результате гибридизации получены линии с генами Pi-1, Pi-2, Pi-33. На втором этапе созданы гибриды, обладающие всеми тремя генами. На третьем этапе перенесены гены Pi-b и Pi-ta, на четвертом — Pi-40. При скрещивании растений удаление пыльников с цветков материнских растений проводили вакуумным способом, а опыление — твел-методом, путем стряхивания пыльцы с отцовских метелок. Гибридные растения выращивали на чеках ФГУП «Пролетарское» Ростовской области. Геномную ДНК выделяли из листьев растений, семена которых были  убраны.

Экстракцию ДНК осуществляли методом СТАВ, который заключается в использовании цетилтриметиламмоний бромида (СТАВ) в качестве основного компонента буфера экстракции и преципитации [29].

Для идентификации генов применяли микросателлитные SSR-маркеры. Нуклеотидные последовательности праймеров представлены на сайте www.gramene.org. В течение всех циклов возвратных скрещиваний перенос доминантных аллелей каждого такого гена в потомстве контролировался тесно сцепленными или внутригенными молекулярными маркерами. Для определения гена Pi-1 использовали маркеры RM224, гена Pi-2 — RM527, гена Pi-33 — RM310, Pi-40 — RM527. Они локализованы в хромосомах: 11, 6, 8, 6 соответственно. Внутригенные маркеры, созданные в лаборатории биотехнологии Всероссийского НИИ риса, применялись для идентификации генов Pi-b (IGM Pi-b, хромосома 2) и Pi-ta (IGM Pi-ta, хромосома 12) [28, 29].

ПЦР проводили с 40–50 нг ДНК в конечном объеме 25 мкл. Состав реакционной смеси: 0,05 мМ dNTPs, 0,3 мМ каждого праймера, 25 мM KCL, 60 мM Tris-HCL (pH 8,5), 0,1 % Тритон Х-100, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 1,5 мM MgCL2, 1 единица Taq-полимеразы. Амплификацию осуществляли в ДНК-амплификаторе «Терцик» при следующих условиях: начальная денатурация ДНК при 94 °C 5 минут; следующие 35 циклов: денатурация при 94 °C 30 с; отжиг праймеров при 56 °C 35 с; элонгация при 72 °C; последний цикл синтеза длится 3 минуты при температуре 72 °C.

Продукты ПЦР разделяли с помощью электрофореза в 8 % полиакриламидном геле (напряжение 250 вольт в течение 3 часов). Для визуализации результатов гелевые пластины помещали на 20–30 минут в раствор бромистого этидия (5 мкг/мл) и фотографировали при ультрафиолетовом свете в гель-документирующей системе (Gel Doc 2000, BioRad, США).

Инокуляцию растений проводили культурой гриба, отобранного на чеках Краснодарского края. Оценку устойчивости риса к пирикуляриозу осуществляли по 9-балльной шкале Международного института риса: устойчивые (1 балл) — отсутствие поражения, мелкие коричневые пятнышки в виде точек; среднеустойчивые (2–5 баллов) — типичные пирикуляриозные пятна эллиптической формы, 1–2 мм длиной, покрывающие до 10 % общей поверхности листьев; слабо устойчивые (6–7 баллов) — типичные пятна длиной 3 мм и более, инфицирующие от 11 до 50 % поверхности листьев; неустойчивые (8–9 баллов) — типичные пирикуляриозные пятна 3 мм длиной или более, покрывающие более 75 % площади листьев, многие листья мертвы [30].

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью программ Excel и Statistica 6.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

С помощью ДНК-маркеров было проведено объединение нескольких генов устойчивости к пирикуляриозу на основе генотипов риса, приспособленных к климату юга России.

На первом этапе работы в 2005 г. была проведена гибридизация сортов Боярин и Вираж с тремя донорами генов Pi-1, Pi-2, Pi-33. После анализа ДНК у растений были отобраны гомозиготные образцы, несущие доминантные аллели устойчивости.

Продолжительность вегетационного периода донорных образцов была на 30–35 дней больше, чем у сорта Боярин, поэтому межподвидовые гибриды F1 характеризовались продолжительным вегетационным периодом и значительной стерильностью колосков (91–95 %) (рис. 1).

 

Рис. 1. Метелка гибрида F1 C101-Lас (Pi-1+33) × Боярин

 

В каждой расщепляющейся широко варьирующей по многим признакам популяции F2, состоящей из 310–720 индивидуумов, было отобрано по 20–30 растений, которые характеризовались скороспелостью, низкорослостью, неосыпаемостью и фертильностью колосков. С помощью ПЦР-анализа из них были выделены растения, гомозиготные по доминантным аллелям генов устойчивости.

ПЦР-анализ образцов риса с использованием микросателлитного маркера RM224 к локусу Pi-1 показал, что он обеспечивает надежный хорошо воспроизводимый результат для идентификации этого гена. Результаты ДНК-маркирования гена Pi-1 в растениях F2, полученных при гибридизации C101-Lac × Боярин, показаны на рисунке 2.

 

Рис. 2. Результаты разделения методом электрофореза продуктов амплификации ДНК растений F2 (C101-Lac × Боярин) с маркером RM224 к гену устойчивости риса к пирикуля-риозу Pi-1. Примечание: 56–39 – анализируемые растения; B — сорт-реципиент Боярин; линия C101-Lac — донор гена Pi-1. При наличии доминантного аллеля гена Pi-1 амплифицируется фрагмент размером 158 п. н.

 

Анализ показал, что только растения с номерами 41, 45, 47, 54 несут доминантный аллель Pi-1, унаследованный от материнской линии-донора C101-Lac, у остальных он отсутствует, как и у Боярина (B).

Наиболее информативными для анализа аллельных состояний локусов Pi-2 и Pi-33 являются SSR-маркеры RM527 и RM310 соответственно. Результаты электрофоретического разделения продуктов амплификации ДНК растений F2 с маркером RМ527, который сцеплен с геном Pi-2, показаны на рисунке 3. Доминантный аллель устойчивости Pi-2 донорной родительской линии C101-A-51 был обнаружен в гомозиготном состоянии у генотипов 108, 105, 104. У других растений выявлен только рецессивный аллель от сорта Боярин, и они были выбракованы в ходе селекции.

 

Рис. 3. Результаты разделения методом электрофореза продуктов амплификации ДНК растений F2 (C101-A-51 × Боярин) с маркером RM527 к гену Pi-2 устойчивости риса к пирикуляриозу. Примечание: 110–65 — анализируемые растения; B — сорт-реципиент Боярин; линия C101-A-51 — донор гена Pi-2. При наличии гена Pi-2 амплифицируется фрагмент размером 233 п. н.

 

На рисунке 4 видно, что гибридные растения 70–73, 56, 57 имеют доминантный аллель Pi-33 от C101-Lac — линии-донора (в том числе у растений 71 и 72 в гетерозиготном состоянии), у остальных он отсутствует, как и у сорта Боярин (B).

 

Рис. 4. Результаты разделения методом электрофореза продуктов амплификации ДНК-растений F2 (C101-Lac × Боярин) с маркером RM310 к гену устойчивости риса к пирикуляриозу Pi-33. Примечание: 73–56 — анализируемые растения; B — сорт-реципиент Боярин; линия C101-Lac — донор гена Pi-33. При наличии доминантного аллеля Pi-33 амплифицируется фрагмент размером 85 п. н.

 

У гибридов F3 от скрещиваний С101-Lас (Pi-1 + 33) × Боярин и С101-Lас (Pi-1+33) × Вираж было выделено большое число среднеспелых гомозиготных линий с двумя доминантными аллелями генов резистентности: Pi-1 и Pi-33.

На следующем, втором этапе (2008) от ступенчатой гибридизации гомозиготных по доминантным аллелям растений [С101-А-51 (Pi-2) × Боярин] и [С101-Lас (Pi-1 + 33) × Боярин] были получены гомозиготные образцы, несущие все три пирамидированных гена: Pi-1, Pi-2, Pi-33. Аналогичная работа по объединению генов устойчивости проведена с гибридами на основе сорта Вираж.

В настоящее время модельный сорт риса должен состоять из низкорослых растений, устойчивых к полеганию. Метелка должна быть плотной, продуктивной с большим числом фертильных, не осыпающихся при созревании колосков. Из гибридных растений, обладающих по данным ДНК-анализа тремя пирамидированными генами, контролирующими устойчивость, удалось отобрать три линии (Ил. 13, Ил. 14 и Ил. 28), совмещающие в себе среднеспелость, низкорослость, хорошую озерненность метелки, выполненное зерно.

В таблице 1 представлены сортообразцы с пирамидированными генами широкого спектра устойчивости к пирикуляриозу: Рi-1, Pi-2, Pi-33, на генетической основе сорта Боярин, находящиеся в родительском питомнике лаборатории риса. Для сравнения приводятся также характеристики реципиентной родительской формы — сорта Боярин.

В лаборатории защиты риса Всероссийского НИИ риса в инфекционном питомнике рисовой оросительной системы была проведена фитопатологическая оценка полученных таким образом линий с пирамидированными генами устойчивости к пирикуляриозу Pi-1 + Pi-2 + Pi-33 и сорта-реципиента Боярин. Тестирование показало их устойчивость (табл. 1).

 

Таблица 1. Некоторые характеристики сортообразцов риса Ил. 13, Ил. 14 и Ил. 28 с пирамидированными генами устойчивости к пирикуляриозу Рi-1, Pi-2, Pi-33, созданные на генетической основе сорта Боярин с применением методов маркерной селекции Some characteristics of the accessions with pyramiding blast resistance genes Рi-1, Pi-2, Pi-33,  created on the genetic basis of variety Boyarin with MAS

Признак	Сорт, образец				Ошибка средней
	Боярин	Ил. 13	Ил. 14	Ил. 28
Вегетационный период, дни	116	122	120	128	2,9
Высота растений, см	86	106	78	122	11,5
Длина метелки, см	13,9	17,8	14,6	21,2	1,9
Число колосков в метелке, шт.	114,5	134,7	129,1	153,8	9,4
Масса 1000 зерен, г	29,9	23,1	23,2	28,9	2,1
Масса зерна с метелки, г	3,42	3,11	3,00	4,44	0,4
Устойчивость к пирикуляриозу, балл	8	2	1	2	1,8

 

Из селекционного материала гибридной комбинации (С101-А-51 × Боярин) × (С101-Lас × Боярин) с генами Pi-1 и Pi-2 в 2011 г. был выделен по урожайности образец Дон 1664, который в пересчете на 1 га сформировал более 10 т зерна. Он был изучен в контрольном питомнике 2012 г. и размножен. В 2013 г. он прошел конкурсное сортоиспытание, в котором превысил стандарт Боярин на 1,1 т/га и был передан под названием Магнат на ГСИ с 2014 г. Растения этого сорта высотой 100–110 см. Соломина толстая, прочная, придающая устойчивость к полеганию. Метелка прямостоячая, рыхлая, длиной 14–15 см. Зерно мелкое, масса 1000 семян — 24 г. В контрольном питомнике 2015 г. Магнат сформировал урожайность 8,65 т/га, а в 2016 г. — 10,8 т/га, превысив стандарт Южанин на 0,79 и 1,62 т/га соответственно. В конкурсном сортоиспытании 2016 г. в ФГУП «Пролетарское» сорт риса Магнат дал урожайность 8,81 т/га, что на 0,34 т/га выше стандарта Южанин.

В этом питомнике хорошую урожайность показали образцы из гибридной комбинации (С101-А-51 × Боярин) × (С101-Lас × Боярин), несущие три гена устойчивости к пирикуляриозу: Pi-1, Pi-2, Pi-33 (табл. 2).

 

Таблица 2. Сортообразцы риса с генами устойчивости к пирикуляриозу Pi-1 + 2 + 33 в конкурсном сортоиспытании, 2016 г. Rice accessions with blast resistance genes Pi-1 + 2 + 33 in competitive varieties testing, 2016

Номер делянки 2016 г.	Наименование образца	Период «всходы – созревание», дни	Урожайность, т/га	Устойчивость к пирикуляриозу, балл
Стандарт	Южанин	127	8,48	8
Дон 1664	Магнат	127	8,81	3
Дон 5896	Ил. 13 (Pi-1 + 2 + 33)	122	8,43	2
Дон 5841	Ил. 14 (Pi-1 + 2 + 33)	120	8,75	1
Дон 5759	Ил. 28 (Pi-1 + 2 + 33)	128	8,19	2
	НСР05	2,2	0,69

 

Полученные гомозиготные образцы по трем генам устойчивости к пирикуляриозу (Pi-1, Pi-2, Pi-33) по урожайности были на уровне стандарта. В дальнейшем их использовали в гибридизации с донорами других генов устойчивости — Pi-b и Pi-ta.

На третьем этапе исследований в 2010 г. созданные нами трехгенные линии риса (Pi-1+2+33) скрестили с донорами генов Pi-ta — Л-10136 и Pi-b: Л-10189 — для пирамидирования пяти генов. Гибридизацию проводили по схеме: Ил. 14 (Pi-1 + 2 + 33) × × F1 [Л-10189 (Pi-b) × Л-10136 (Pi-ta)]. Поскольку в качестве отцовской формы был взят гибрид F1, полученное потомство было разнородным и несло от 3 до 5 доминатных аллелей. Семена растений первого поколения, у которых на электрофореграммах было выявлено гетерозиготное состояние всех пяти аллелей, в 2012 г. были репродуцированы в поле, где выделили 93 лучших растения F2 по комплексу хозяйственно ценных признаков.

ПЦР-анализ всех пяти генов показал, что сегрегация по маркерам у изученных гибридов F2 отличалась от классического соотношения по Менделю 1 : 2 : 1. На эти результаты повлиял отбор, поскольку для ПЦР-анализа брали листья с пригодных для селекционной работы растений, имевших метелки с плодовитыми колосками и полностью созревшим зерном без остей [31].

В процессе анализа удалось выделить два образца риса (1225/13 и 1396/13), у которых все пять доминантных аллелей устойчивости (Pi-1 + 2 + 33 + ta + b) были в гомозиготном состоянии. Это значительно выше, чем теоретически ожидаемая частота 1 : 1024, и связано с отбором высокофертильных растений, которые с большей вероятностью являются гомозиготными, чем полустерильные.

Кроме того, обнаружены 4 растения, несущие 4 гена в гомозиготном, а 1 — в гетерозиготном состоянии. В последующие годы из их потомства выделены линии, гомозиготные по 5 генам с частотой 25 %. Данные линии изучены в селекционном питомнике по урожайности, устойчивости к пирикуляриозу и качеству крупы. Осуществлен следующий цикл отборов лучших растений и их ПЦР-анализ.

На рисунке 5 представлены электрофореграммы разделения продуктов амплификации ДНК растений двух линий 1225/13 и 1396/13 (номера проб 2 и 19) с маркерами к тестируемым генам устойчивости к пирикуляриозу.

 

Рис. 5. Электрофореграммы разделения продуктов амплификации ДНК растений риса с маркерами RM224, RM527, RM310, IGM Pi-b, IGM Pi-ta к пяти генам Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-b, Pi-ta соответственно. Линии 1225/13 и 1396/13 (номера проб 2 и 19) имеют доминантные аллели в гомозиготном состоянии в пяти локусах, сорт Боярин (B) — рецессивные. При наличии генов Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-b, Pi-ta амплифицируются фрагменты размером 158, 233, 85, 302, 132 п. н. соответственно

 

Линия 1225/13 скороспелая, ее период вегетации составляет в среднем 110 суток, полукарликовая (80 см), с метелкой средней длины (15 см). Вторая линия 1396/13 — среднеспелая, период вегетации до созревания 120 суток, растения более высокие (100 см), метелка длинная (22 см), с большим количеством зерен.

Эти линии испытаны в селекционных посевах по урожайности и устойчивости к пирикуляриозу. Наиболее урожайная линия 1396/13 размножена в 2015 г. и посеяна в 2016 г. в конкурсном испытании и в производственных условиях на площади 0,5 га для изучения продуктивности и качества. Поскольку этот образец обладает пятью генами резистентности к пирикуляриозу — Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-b, Pi-ta, он получил название Пентаген [32]. Его урожайность в КСИ 2016 г. составила 6 т/га.

Поскольку растения сорта Пентаген имели поникающие метелки и были склонны к полеганию, его скрестили в 2013 г. с высокопродуктивным сортом Кубояр, имеющим оптимальный габитус растений и компактные прямостоячие метелки. Из 100 растений F2 комбинации Пентаген × Кубояр в 2015 г. выявлены 23 гомозиготных растения по гену Pi-1; 5 — по Pi-2; 5 — по Pi-33; 13 — по Pi-b; 52 — по Pi-ta. По результатам ПЦР-анализа были отобраны 7 идентичных сорту Кубояр растений, которые несли доминантные аллели в пяти локусах. При этом у одного из них была гомозиготность по трем локусам, у трех — по двум и у двух — по одному.

На четвертом этапе нашей работы получены образцы риса, несущие шесть доминантных аллелей генов резистентности к пирикуляриозу, у которых, кроме аллелей Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-b, Pi-ta, в генотип добавлен Pi-40. В качестве донора Pi-40 использовали образец IR-83243-2-1-24-4-B.

В 2013 г. нами была проведена гибридизация Пентаген × IR-83243-2-1-24-4-B. С лучших по комплексу хозяйственно ценных признаков гибридных растений F2 взяли отрезки листьев для анализа ДНК с использованием SSR-маркеров к каждому гену, провели ПЦР-анализ образцов и в 2015 г. выявили образцы, несущие в своем генотипе гены устойчивости к пирикуляриозу. При этом были обнаружены гибридные растения с четырьмя, пятью и шестью генами устойчивости: Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-b, Pi-ta и Pi-40. Они имели длинные поникающие метелки.

Таким образом, многолетние ступенчатые скрещивания на основе сортов Боярин и Вираж позволили создать линии риса с несколькими генами устойчивости к пирикуляриозу (Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-b, Pi-ta, Pi-40) в гомозиготном состоянии. С помощью современных методов молекулярного маркирования совместно с традиционной селекцией за короткий период времени созданы линии риса, в генотипе которых объединено до шести генов резистентности, обеспечивающих долговременную устойчивость к пирикуляриозу, что снизит риск эпифитотии болезни, сохранит биологическую урожайность риса и позволит получать экологически чистую продукцию.

ВЫВОДЫ

1. В процессе многолетней селекционной работы на генетической базе российских сортов созданы образцы риса, несущие в одном генотипе 2–6 генов устойчивости к пирикуляриозу.
2. С использованием маркер-опосредованной селекции созданы сорта риса Магнат с генами Pi-1 и Pi-2 и Пентаген, имеющий пять эффективных генов устойчивости к различным расам возбудителя пирикуляриоза — Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-b, Pi-ta.

About the authors

Pavel I. Kostylev

Agrarian Scientific Center “Donskoy”

Author for correspondence.
Email: p-kostylev@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4371-6848
SPIN-code: 7901-1531

doctor of agricultural sciences, head, laboratory of breeding and seed production of rice

Russian Federation, 3, Nauchny Gorodok, Zernograd, Rostov region, 347740

Elena V. Krasnova

Agrarian Scientific Center “Donskoy”

Email: krasnovaelena67@mail.ru

candidate of agricultural sciences, leading researcher, laboratory of breeding and seed production of rice

Russian Federation, 3, Nauchny Gorodok, Zernograd, Rostov region, 347740

Aleksandr A. Redkin

Agrarian Scientific Center “Donskoy”

Email: Rs.07.Pro@mail.ru

candidate of agricultural sciences, researcher, laboratory of breeding and seed production of rice

Russian Federation, 3, Nauchny Gorodok, Zernograd, Rostov region, 347740

Elena V. Dubina

All-Russian Research Institute of Rice

Email: lenakrug1@rambler.ru

cand. of Biol. Sci., head of the laboratory

Russian Federation, 3, Belozerny, Krasnodar, 35092

Zhanna M. Mukhina

All-Russian Research Institute of Rice

Email: agroplazma@gmail.com

doctor of biological sciences, Deputy Director on innovation

Russian Federation, 3, Belozerny, Krasnodar, 35092

References

Supplementary files