Transgenesis in microalga Chlamydomonas reinhardtii: current approaches

Full Text

Введение

Эукариотические микроводоросли – чрезвычайно разнообразная сборная группа фотосинтезирующих одноклеточных организмов, приспособленных к широкому спектру экологических ниш [1]. Они являются первичными продуцентами, на которых приходится около 50% общего объема фиксации углерода во всем мире [2]. Благодаря высокой метаболической пластичности, микроводоросли содержат широкий спектр полезных веществ, таких как природные антиоксиданты, витамины, липиды, белки, пигменты, углеводы и вторичные метаболиты фармацевтического, сельскохозяйственного, пищевого и промышленного применения. Микроводоросли являются богатым источником фармакологически активных метаболитов, обладающих противоопухолевыми, антибактериальными, противогрибковыми и противовирусными свойствами. Помимо наработки эндогенных соединений, при применении методов биоинженерии микроводоросли потенциально могут быть использованы в качестве недорогой платформы для биосинтеза различных промышленных ферментов и терапевтических белков – антител, гормонов и вакцин [3]. Генетическая инженерия открывает большие перспективы для создания высокопродуктивных штаммов микроводорослей; будучи одноклеточными организмами, многие виды микроводорослей большую часть своего вегетативного цикла остаются гаплоидными, что сокращает время получения и селекции трансформантов. Использование микроводорослей в качестве «клеточных фабрик» – многообещающий подход к производству коммерчески ценных соединений [4]. Некоторым видам микроводорослей (например, Chlorella vulgaris Beijerinck и Chlamydomonas reinhardtii P.A.Dang.), присвоен статус GRAS (англ. Generally Recognized as Safe – В целом признано безопасным) – они безопасны при употреблении в пищу [5].

Тем не менее, микроводоросли до сих пор остаются относительно сложными объектами для генетических манипуляций [6]. Основные проблемы связаны с необходимостью видоспецифичного подхода: трансформация клеток может быть осложнена особенностями строения мембран и клеточной стенки у представителей конкретного таксона, а разработанная трансгенная конструкция может не экспрессироваться из-за мощной системы сайленсинга генов. Эти трудности объясняют низкую эффективность трансформации микроводорослей и скудный список успешно редактируемых видов [6, 7].

C. reinhardtii (хламидомонада) – одна из наиболее изученных эукариотических зеленых водорослей, популярный модельный объект для изучения генетики фотосинтеза, биологии хлоропласта, структуры и функций сенсорных фоторецепторов и фотоповедения. Также хламидомонада является модельным организмом для разработки новых подходов генетической инженерии ДНК микроводорослей. Сочетание быстрого роста и простоты культивирования со способностью к фотосинтезу, хорошо изученный жизненный цикл, полностью секвенированные три генома (ядерный, хлоропластный и митохондриальный) [8, 9], возможность трансформации каждого из них [10], а также безопасность для человека делают хламидомонаду ценным объектом и для биотехнологии. Большое разнообразие штаммов reinhardtii поддерживается в различных биоресурсных коллекциях по всему миру. Единственная в России генетическая коллекция сохраняется на кафедре генетики и биотехнологии Санкт-Петербургского государственного университета, в Петергофе.

В качестве платформы для биосинтеза рекомбинантных белков с терапевтическими свойствами в настоящее время успешно используют хлоропласт хламидомонады (таблица 1), – например, в нем возможен синтез аллергена пыльцы березы Bet v 1 для терапии аллергии и спайкового белка SARS-CoV-2 для создания вакцины. Методики трансформации пластома C. reinhardtii достаточно хорошо разработаны и позволяют получать стабильно высокую экспрессию трансгена [11].

 

Таблица 1. Белки терапевтического назначения, синтезированные в хлоропласте C. reinhardtii

Назначение	Белок	Ссылка
Разработка вакцин	Белок VP1 вируса ящура (FMD)	[12]
	Белок Е2 вируса классической чумы свиней (CSFV)	[13]
	Белок p57 патогена рыб Renibacterium salmoninarum	[14]
	Белок VP28 вируса синдрома белых пятен (WSD) креветок	[15]
	Фибронектин-связывающий домен D2 Staphylococcus aureus	[16]
	Антигены acrV и vapA патогена рыб Aeromonas salmonicida	[17]
	Антигены Pfs25, Pfs28, Pfs48/45, CelTOS Plasmodium falciparum	[18–21]
	Белок Е7 вируса папилломы человека 16 (HPV 16)	[22, 23]
	Антиген MPT64 Mycobacterium tuberculosis	[24]
	Гемагглютинин вируса птичьего гриппа (AIV) H5	[25]
	Белок p201 ApoB100	[26]
	Спайковый белок SARS-CoV-2	[27]
Терапия заболеваний	Фактор роста эндотелия сосудов	[28]
	Интерлейкин 4	[29]
	TRAIL (TNFSF10)	[30]
	Моноклональные антитела человека	[28, 31–33]
	Глутаматдекарбоксилаза человека (hGAD65)	[34]
	Амфотерин (HMGB1)	[28]
	Иммунотоксины	[35]
	Соматотропин человека	[36]
	Эндолизины Cpl-1 и Pal бактериофага Streptococcus pneumoniae	[37]
	Интерлейкин 29	[38]
Терапия аллергий	Аллерген арахиса Ara h 1	[39]
	Аллерген пыльцы березы Bet v 1	[40]

 

До недавнего времени введение трансгенов в ядерный геном хламидомонады и их экспрессия были сопряжены с определенными трудностями из-за эффективной системы сайленсинга. За последние несколько лет были достигнуты значительные успехи в этой области, в том числе с применением новых методик на основе CRISPR/Cas9 [41, 42].

В этой статье представлен обзор актуальных методик трансгенеза у одноклеточной зеленой водоросли C. reinhardtii. Рассмотрены общие принципы дизайна трансгенных конструкций для трансформации ядерного и хлоропластного геномов, используемые селективные маркеры для отбора трансформантов, методики введения трансгена (трансформации) и редактирования генома с помощью системы CRISPR/Cas9.

 

Принципы дизайна трансгенных конструкций

Трансгенная конструкция представляет собой кассету ДНК, содержащую все необходимые регуляторные элементы для правильной экспрессии в организме-мишени. Все конструкции обычно содержат промоторную последовательность, ген интереса (трансген), селективный маркер и терминаторную последовательность. В зависимости от необходимости, трансгенная конструкция может нести дополнительные элементы, позволяющие обеспечить направленную вставку в геном или ее контролируемое удаление из генома.

Интеграция чужеродного гена возможна как в ядерный, так и в хлоропластный геном C. reinhardti, – основные характеристики каждого из них представлены в таблице 2. В обоих случаях для эффективного получения трансформантов требуются адекватный дизайн трансгенной конструкции, в том числе оптимизация нуклеотидных последовательностей по кодонному составу; подбор методик введения трансгена и селекции трансформантов, методы удаления маркерных последовательностей.

 

Таблица 2. Основные характеристики ядерного и хлоропластного геномов C. reinhardtii

Характеристика	Геном
	Ядерный	Хлоропластный
Размер, пар оснований (п.о.)	~110х106	~205х103
GC-состав, %	~64	~36
Количество генов	~17585	99
Количество хромосом	17	1
Количество копий в одной клетке	1	Один хлоропласт на клетку, ~80 копий генома на хлоропласт
Способ интеграции трансгена	Случайная инсерция, гомологичная рекомбинация (при генетическом редактировании)	Гомологичная рекомбинация

 

Трансгенные конструкции для трансформации ядерного и хлоропластного геномов C. reinhardtii значительно различаются между собой (рис. 1).

 

Рисунок 1. Общий план строения трансгенных конструкций для трансформации ядерного и хлоропластного генома C. reinhardtii: А. Конструкция для трансформации ядерного генома; Б. Конструкция для трансформации хлоропластного генома. Обозначения: ПГ – плечи гомологии, П – промотор/5'-нетранслируемая область, И – интрон, Т – терминатор/3'-нетранслируемая область, ПП – прямые повторы. Дополнительные пояснения к рисунку приведены в основном тексте

 

Трансформация ядерного генома C. reinhardtii до недавнего времени была сопряжена с определенными трудностями, связанными с эффективной системой сайленсинга вводимых экзогенов [41]. Кроме того, до появления методики CRISPR/Cas трансгенная конструкция могла быть интегрирована в ядерный геном только путем случайной инсерции, что делало хлоропласт хламидомонады, где встраивание происходит только по гомологии, более привлекательной платформой. Тем не менее, было разработано несколько правил дизайна трансгенов для их успешной экспрессии в ядерной ДНК C. reinhardtii. Во-первых, необходимо использование эндогенных промотора (нативного или химерного), терминатора, 5'- и 3'-нетранслируемых областей – наиболее часто используют таковые от генов, кодирующих: малую субъединицу рибулозобисфосфаткарбоксилазы (rbcS2), белок теплового шока hsp70A и субъединицу II реакционного центра фотосистемы I (psaD) [43]. Во-вторых, следует учитывать кодонный состав трансгена и трансформируемого генома [44]. В-третьих, регулярное прерывание трансгена интронами (троекратное повторение интрона 1 rbcS2 (145 п.о.) в последовательности трансгена и однократное использование интрона 2 rbcS2 (329 п.о.) в последовательности маркера) способствует высокому уровню экспрессии [45, 46]. Этот эффект достигается за счет процесса, получившего название интрон-опосредованное усиление (англ. IME – Intron-Mediated Enhancement). Предполагаемый механизм заключается во взаимодействии РНК-полимеразы II со сплайсосомой: в случае, если это взаимодействие не происходит, то РНК-полимераза прерывает транскрипцию, а незрелый транскрипт деградирует. Это явление может лежать в основе способности отличать транскрипты по принципу свой–чужой. Гены C. reinhardtii чрезвычайно богаты интронами в сравнении с другими организмами: 92% генов содержат интроны со средним размером 373 п.о., средний размер экзонов при этом составляет 190 п.о. [41].

Направленная вставка трансгена в ядерный геном хламидомонады возможна только путем гомологичной рекомбинации по плечам гомологии (50 п.о.) через репарацию двуцепочечного разрыва, индуцируемого системой CRISPR/Cas [47]. Редактирование генома C. reinhardtii методом CRISPR/Cas9 подробно рассмотрено ниже.

Трансформация пластома C. reinhardtii до сих пор остается более удобной и выгодной по следующим причинам: 1) сводится к минимуму потенциальная токсичность продукта для клетки; 2) возможна целевая интеграция трансгена путем гомологичной рекомбинации без использования системы CRISPR/Cas; 3) высокая плоидность пластома и высокий уровень экспрессии генов хлоропластов; 4) отсутствие системы сайленсинга генов. Одним из недостатков этого подхода является отсутствие возможности гликозилирования синтезированных в хлоропласте белков [11].

Трансгенная конструкция для пластидной трансформации состоит из трансгена и селективного маркера, фланкированных двумя плечами гомологии размером 100-200 п.о., гомологичными выбранному сайту встраивания в хлоропластную ДНК хозяина. Для экспрессии трансгена и маркера в хлоропласте C. reinhardtii чаще всего используют регуляторные последовательности ядерного гена rbcS2, хлоропластных генов: psaD, psaA и psaB (апопротеины фотосистемы I), rbcL (большая субъединица рибулозобисфосфаткарбоксилазы), psbA (коровый белок D1 фотосистемы II) [11]. При дизайне трансгенной конструкции для трансформации хлоропласта хламидомонады также необходимо учитывать GC-состав трансгена и хлоропластной ДНК.

Маркерный ген может быть удален из трансформированного генома с помощью Cre/loxP рекомбиназной системы [48]. Для пластома доступен вариант с определенным дизайном трансгенной конструкции: маркерный ген должен быть фланкирован с обеих сторон прямыми повторами, что при условии удаления фактора отбора при дальнейшем размножении трансформанта может привести к внутренней гомологичной рекомбинации по повторам с удалением селективного маркера из генома хлоропласта [49].

 

Селективные маркеры

Селекционные маркеры применяются при трансгенезе для создания условий отбора трансформированных клеток. Наиболее широко используемые при трансформации C. reinhardtii маркерные последовательности представлены в таблице 3.

 

Таблица 3. Наиболее широко используемые при трансформации ядерной и хлоропластной ДНК C. reinhardtii селекционные маркеры

Мишень	Ген	Продукт	Селекция	Ссылка
Ядерная ДНК	ARG7	Аргинино-сукцинатлиаза	Среда без аргинина	[50]
	NIT1	Нитратредуктаза	Среда без нитрата	[51]
	CRY1-1	Мутантный рибосомный белок S14/rp59	Среда с эметином, криптоплеврином	[52]
	aph7″	Аминогликозид-фосфотрансфераза	Среда с гигромицином B	[43]
	aphVIII	Аминогликозид-фосфотрансфераза	Среда с паромомицином, неомицином, канамицином	[53]
	ble	Блеомицин-связывающий белок	Среда с флеомицином	[44, 54]
Ядерная и хлоропластная ДНК	aadA	Аминогликозид- аденилилтрансфераза	Среда со спектиномицином, стрептомицином	[55, 56]
Хлоропластная ДНК	aphA6	Аминогликозид-фосфотрансфераза	Среда с канамицином, амикацином	[57]

 

Первыми маркерами селекции у C. reinhardtii служили ее собственные гены, восстанавливающие метаболические пути у штаммов, мутантных по генам ARG7 и NIT1. Трансформированные нормальными копиями этих генов ауксотрофные мутанты отбирают как прототрофы. Такой «безмаркерный» (англ. “marker-free”) подход, основанный на компенсации мутации копией гена дикого типа, остается популярным и достаточно широко используется при трансформации ядерной ДНК и пластома у соответствующих мутантов [58, 59].

Ген ARG7 кодирует фермент аргининосукцинатлиазу и восстанавливает метаболический путь биосинтеза аргинина при успешной трансформации аргининзависимого мутантного штамма C. reinhardtii, что позволяет трансформантам расти на минимальной среде без добавления аргинина.

Ген NIT1 кодирует нитратредуктазу – фермент, позволяющий при успешной трансформации мутантного штамма C. reinhardtii использовать нитрат как единственный источник азота в среде.

В 1994 году [52] был выделен и изучен мутантный штамм C. reinhardtii, устойчивый к ингибиторам трансляции эметину и криптоплеврину. Было установлено, что эта устойчивость обусловлена миссенс-мутацией (CRY1-1) в гене CRY1. Последовательность мутантного гена CRY1-1 под управлением эндогенного промотора rbcS2 может быть использована для трансформации штаммов дикого типа C. reinhardtii.

Применение экзогенных генов в качестве маркеров устойчивости для селекции позволило упростить отбор трансформантов и снять ограничение на необходимость использования мутантов C. reinhardtii как акцепторов трансгенов. В настоящее время наиболее эффективными и широко применяемыми экзогенными маркерами являются различные гены резистентности к антибиотикам.

Ген aph7″ Streptomyces hygroscopicus кодирует фосфотрансферазу, которая деактивирует антибиотик гигромицин В. Для трансформации хламидомонады используется химерная конструкция, включающая помимо последовательности гена aph7″ S. hygroscopicus промотор гена β2-тубулина и первый интрон с 3'-нетранслируемой областью rbcS2 C. reinhardtii [43].

Ген aphVIII Streptomyces rimosus кодирует фосфотрансферазу, которая деактивирует антибиотики паромомицин, неомицин и канамицин. Наиболее высокая эффективность трансформации была продемонстрирована при использовании химерной конструкции следующего состава: последовательности 5'-нетранслируемой области гена белка теплового шока hsp70A C. reinhardtii, первого интрона гена rbcS2 C. reinhardtii, гена aphVIII S. rimosus, 3'-нетранслируемой области гена rbcS2 C. reinhardtii [53].

Ген ble Streptoalloteichus hindustanus кодирует фермент, связывающий антибиотик флеомицин. Химерная конструкция с этим геном, включающая последовательности первого интрона, и 5'- и 3'-нетранслируемых областей гена rbcS2 C. reinhardtii показала стабильно высокую эффективность трансформации и экспрессии [44, 54].

Ген aadA Escherichia coli кодирует фермент, придающий устойчивость к антибиотикам спектиномицину и стрептомицину. Для трансформации пластома C. reinhardtii используют конструкцию с последовательностями промотора хлоропластного гена atpA и 3'-нетранслируемой области rbcL C. reinhardtii [55]. Для трансформации ядерной ДНК ген aadA E. coli объединяют с 5'- и 3'-нетранслируемыми областями гена rbcS2 C. reinhardtii [56].

Ген aphA6 Acinetobacter baumannii кодирует фосфотрансферазу, которая деактивирует антибиотики канамицин и амикацин. Наибольшая экспрессия в хлоропласте хламидомонады при сохранении компактности наблюдалась при использовании химерной конструкции с последовательностью 5'-нетранслируемой области гена psbA C. reinhardtii, гена aphA6 A. baumannii и 3'-нетранслируемой области rbcL C. reinhardtii [57].

Также в качестве маркерного гена могут быть использованы флуоресцентные белки, такие как: mCherry [60], mVenus [45] и др. Скрининг таких трансформантов проводят с помощью конфокального микроскопа.

 

Модульная система клонирования Chlamydomonas

Быстрая и предсказуемая модификация генома C. reinhardtii может быть обеспечена использованием стандартизированных инструментов и методик. С этой целью был разработан набор инструментов для модульного клонирования на основе технологии Golden Gate – Chlamydomonas Modular Cloning kit [61]. Система использует рестриктазы BsaI и BpiI и состоит из трех наборов векторов для клонирования (уровни 0, 1 и 2). Векторы уровня 0 содержат отдельные элементы: промоторы, 5'- и 3'-нетранслируемые области, кодирующие последовательности, терминаторы, селекционные маркеры и интроны. Эти модули затем направленно собираются в одну полную транскрипционную единицу внутри вектора уровня 1 в ходе реакции рестрикции/лигирования. На втором этапе несколько транскрипционных единиц из векторов уровня 1 могут быть объединены в составе вектора уровня 2, что позволяет создавать мультигенные кластеры, кодирующие ферменты новых метаболических путей [42].

Готовый стандартизированный набор инструментов позволяет быстро (за 4-5 недель) создавать модифицированные клетки как для фундаментальных исследований, так и для биотехнологии.

 

Методы трансформации C. reinhardtii

Трансформация представляет собой процесс интеграции функционального фрагмента ДНК – трансгенной конструкции – в клетки-мишени. В настоящее время широко используются три метода доставки трансгенов в клетки хламидомонады: стеклянные шарики, электропорация и биобаллистика [10].

Стеклянные шарики являются наиболее доступным, простым и эффективным методом трансформации ядерного [62] и пластомного [63] генома. Трансген, клетки C. reinhardtii, лишенные клеточной стенки (с использованием автолизина или безоболочечный штамм) и стеклянные шарики перемешиваются на вортексе. Стеклянные шарики при встряхивании разрывают мембрану, позволяя осуществлять перенос экзогенной ДНК во внутреннюю среду клетки. С помощью стеклянных шариков также возможно доставлять в клетки рибонуклеопротеиновые (РНП) комплексы, формируемые нуклеазой Cas и гидовой РНК (gRNA).

Впервые продемонстрированный на хламидомонаде в 1991 году [64], метод электропорации заключается в обработке клеток импульсами высокого напряжения на электропораторе: в мембране формируются поры диаметром 20–40 нм, через которые чужеродная ДНК попадает в клетку. Метод позволяет добиться большого выхода трансформантов, но требует тонкой настройки и подбора условий, зависящих от используемого прибора и конкретного штамма C. reinhardtii [65]. Электропорацию осуществляют генерацией импульсов двух типов – экспоненциального и квадратного. Более контролируемым и приводящим к генерации большего числа трансформантов типом волн являются квадратные [66]. Кроме того, при генерации импульсов квадратного типа штаммы C. reinhardtii с клеточной стенкой (англ. cw – cell-walled) можно электропорировать без ее удаления автолизином [67], в то время как экспоненциальные импульсы пригодны только для трансформации клеток, лишенных клеточной стенки [65]. Проведенные эксперименты по электропорации cw-клеток C. reinhardtii экспоненциальными волнами на электропораторе «BTX ECM 600» без обработки автолизином привели к получению 3% частоты трансформации, а с обработкой автолизином – к 87%, подтвердив и дополнив ранее полученные данные [47]. При оптимизации таких параметров, как концентрация трансгена, тип волн и напряжение, частота трансформации методом электропорации может быть выше, чем при использовании метода стеклянных шариков [68]. Общую эффективность трансформации значительно увеличивает использование новейших моделей электропораторов, например, «NEPA21» – этот прибор последовательно генерирует три типа квадратных импульсов: «poring pulse» с высоким напряжением и короткой длиной импульса, создающий поры в мембране клетки, серия «transfer pulse» с низким напряжением и продолжительной длиной импульса, и «transfer pulse» с измененной полярностью для эффективной доставки молекул ДНК в клетки [67]. Электропорация является стандартным методом трансформации C. reinhardtii, особенно при доставке в клетки РНП комплексов Cas/gRNA.

Метод биобаллистики заключается в бомбардировке клеток-реципиентов частицами тяжелых металлов (главным образом золота или серебра), покрытыми трансгенной ДНК, в вакуумной камере. Этим методом возможна трансформация ДНК как клеточного ядра, так и органоидов: митохондрий и пластид. В настоящее время эта методика используется главным образом для трансформации хлоропластов хламидомонады.

Были разработаны и протестированы и другие методы трансформации хламидомонады, но они не получили широкого распространения – к таковым относится агробактериальная трансформация [10]. Этот подход гораздо более сложен и при этом не имеет существенных преимуществ перед электропорацией [69].

Недавно была разработана новая система доставки в клетки C. reinhardtii РНП комплексов Cas9/gRNA с помощью проникающего в клетку пептида (англ. cell-penetrating peptide – CPP) pVEC (аминокислотная последовательность: LLIILRRRIRKQAHAHSK) – она может использоваться в качестве альтернативного электропорации метода трансформации по параметрам доступности и эффективности [70].

 

Редактирование генома C. reinhardtii методом CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 – система из белка Cas9, обладающего нуклеазной активностью, и некодирующей гидовой РНК, комплементарно взаимодействующей с ДНК в целевом сайте. Общая схема функционирования системы редактирования генома CRISPR/Cas9 следующая: собранный комплекс Cas9/gRNA при обнаружении в молекуле ДНК комплементарной спейсеру gRNA последовательности (протоспейсера) и прилегающего к нему специфического мотива (PAM) связывается с ней по принципу комплементарного взаимодействия gRNA-ДНК, а эндонуклеаза Cas9 вносит двуцепочечный разрыв на 3–4 нуклеотида выше по течению от PAM. В образовавшийся in vivo разрыв может быть направленно встроена трансгенная конструкция, несущая плечи гомологии к сайту рестрикции (гомологичная рекомбинация) [71].

Новейшие методы трансформации хламидомонады основаны на использовании технологии CRISPR/Cas9. Компоненты системы могут быть доставлены следующими способами: 1) введение в клетку плазмидных векторов, несущих последовательности, кодирующие белок Cas9 и gRNA; 2) введение в клетку собранного in vitro РНП комплекса Cas9/gRNA (рис. 2). Использование РНП комплекса имеет существенные преимущества, так как позволяет избежать случайного инсерционного мутагенеза при использовании плазмидного вектора, уменьшает вероятность нецелевого редактирования и, как следствие, демонстрирует более высокую эффективность.

 

Рисунок 2. Стратегии доставки компонентов системы CRISPR/Cas9 в клетки C. reinhardtii: А. Интегративная система, Б. Эписомная система, В. Рибонуклеопротеиновая система. Дополнительные пояснения к рисунку приведены в основном тексте

 

В интегративной стратегии используется одна или две плазмиды, кодирующая/ие гены Cas9 и gRNA. После внедрения в клетку плазмида линеаризуется клеточными рестриктазами и интегрируется в случайное место в геноме C. reinhardtii. При экспрессии внесенных в геном трансгенов собирается комплекс Cas9/gRNA, который производит двуцепочечный разрыв в целевом сайте [72]. Первая попытка продуцировать эндонуклеазу Cas9 и gRNA с одной и той же плазмиды в клетках C. reinhardtii привела к получению единственной колонии трансформанта по гену FKB12 из взятых >10⁹ клеток [73]. При совместной трансформации клеток двумя независимыми плазмидами удалось получить нокаутные линии по гену APT с эффективностью 3-30% [74].

Также был разработан метод, позволяющий избежать интеграции последовательностей генов Cas9 и gRNA в геном. Показано, что плазмиды, содержащие дрожжевую центромерную последовательность, участок инициации репликации и дрожжевой селективный маркер (CEN6-ARSH4-HIS3) автономно реплицируются в клетках и не встраиваются в геном диатомей Thalassiosira pseudonana Cleve и Phaeodactylum tricornutum Bohlin [75, 76]. В 2019 г. эксперименты с этой методикой были продолжены и получены стабильные трансформанты зеленых микроводорослей Acutodesmus obliquus (Turpin) Hegewald & Hanagata и Neochloris oleoabundans S. Chantanachat & H. C. Bold, однако со временем эписомная плазмида все же встроилась в ядерный геном [77]. В другом исследовании [78] с использованием эписомного вектора был успешно нокаутирован ген нитратредуктазы у микроводоросли Nannochloropsis oceanica Suda & Miyashita. Эписомная плазмида элиминировалась из клеток трансформантов примерно через 30 циклов клеточных делений, что позволило получить нетрансгенную линию. Использование эписомного кольцевого вектора еще не апробировалось для трансформации C. reinhardtii. Тем не менее, разработка такой плазмиды проста, а возможность конструирования нетрансгенных линий без маркеров делает этот метод сопоставимым по своей применимости с РНП-системой [72].

Поскольку у C. reinhardtii экспрессия чужеродных генов часто неэффективна, особенно если они кодируют крупные белки, такие как Cas9 [60, 73], чаще всего применяется метод предварительной сборки in vitro РНП комплекса Cas9/gRNA, который непосредственно используют для трансформации. РНП комплекс быстро разрушается в клетке, что ограничивает активность эндонуклеазы, сводя к минимуму риски нецелевых эффектов по сравнению с конститутивной экспрессией Cas9 [79].

Методика CRISPR/Cas9 может быть использована для целевого выключения (нокаута) и вставки (нокина) генов у хламидомонады. Компоненты системы доставляются в клетку совместно с донорной ДНК – чаще всего одним из селекционных маркеров, который может встроиться в место двуцепочечного разрыва. Для повышения степени контролируемости производимой манипуляции с геномом и предопределенности результата требуется задействование механизмов гомологичной рекомбинации – добавление в последовательность донорной ДНК плеч гомологии, фланкирующих сайт рестрикции нуклеазы Cas9. Это позволило повысить выход трансформантов до 85% [47, 60].

В 2017 году был существенно доработан общий протокол трансформации C. reinhardtii. Согласно наблюдениям, тепловая обработка клеток перед трансформацией является критически важным параметром для получения наибольшего числа трансформантов. Предполагается, что в клетках происходят некие физиологические изменения, благоприятные для активности комплекса Cas9/gRNA и/или для процессов, связанных с репарацией ДНК. Также были определены оптимальные параметры для посттрансформационного восстановления клеток [60].

В 2020 году был разработан высокоэффективный метод целевого инсерционного мутагенеза, названный TIM (англ. Targeted Insertional Mutagenesis). Авторы провели серию парных экспериментов и выявили параметры, имеющие решающее значение для высокой эффективности трансгенеза хламидомонады на основе РНП стратегии CRISPR/Cas. Оптимизация протокола трансформации ядерного генома позволила в отдельных экспериментах достичь эффективности мутагенеза от 40 до 95%, даже при мультиплексном редактировании [47].

В 2023 году был разработан протокол для рутинного создания мутантных линий хламидомонады без остаточных маркеров селекции [80]. В этом же году с использованием РНП комплекса CRISPR/Cas впервые были получены стабильные в течение 100 дней культивирования трансформанты, экспрессирующие оптимизированный трансген бактериальной фитазы, встроенный во второй экзон ядерного гена NIT1. Примечательно, что клетки, трансформированные традиционными способами (без использования РНП комплекса или метода CRISPR/Cas), потеряли ген фитазы через два поколения (около 20 дней культивирования) [81].

За время активных исследований было предпринято множество попыток оптимизации условий трансформации хламидомонады и повышения эффективности редактирования генов. Оценивались условия выращивания и методы подготовки клеток, необходимая плотность отбираемой для трансформации культуры, концентрация РНП комплекса Cas9/gRNA, методика удаления клеточной стенки, подбор и оптимизация методов трансформации под разные штаммы хламидомонады и оборудование, а также методики восстановления и отбора трансформантов – общий используемый в настоящее время протокол представлен в таблице 4.

 

Таблица 4. Общий протокол трансформации ядерного генома микроводоросли C. reinhardtii РНП комплексом CRISPR/Cas

1. Выращивание и подготовка клеток
Клетки выращивают на твердой среде TAP (1,5% агар, аргинин, дрожжевой автолизат) при температуре +20-25°С в цикле свет (200–300 µE/м2 сек) – 14 ч, темнота – 10 ч с пересевом каждые три дня
Клетки собирают на третий день после пересева (в фазе экспоненциального роста) и ресуспендируют в стерильной воде, далее осаждают центрифугированием (5000 об/мин, 5 мин)
Клетки штаммов с клеточной стенкой ресуспендируют в автолизине до достижения плотности 1х108 кл/мл и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин	Клетки штаммов без клеточной стенки ресуспендируют в жидкой среде TAP+40 мМ сахароза до достижения плотности 1х108 кл/мл
2. Тепловая обработка
Клетки инкубируют при температуре +40°С с перемешиванием (150 об/мин) в течение 30 мин
Клетки осаждают центрифугированием (5000 об/мин, 5 мин), промывают в жидкой среде TAP+40мМ сахароза, осаждают центрифугированием (5000 об/мин, 5 мин) и затем ресуспендируют в жидкой среде TAP+40мМ сахароза до достижения плотности 1х108 кл/мл
3. Трансформация
Стеклянные шарики	Электропорация (электропоратор «BioRad GenePulser Xсell»)
В пробирку со стерильными стеклянными шариками диаметром 0,45 нм (500-600 мкг) добавляют 300 мкл ресуспендированных клеток (3х107 кл/мл), 5 мкл РНП комплекса Cas9/gRNA (3 мкМ Cas9:gRNA) и 1 мкг трансгенной конструкции	К 40 мкл ресуспендированных клеток (4х106 кл/мл) добавляют 4 мкл РНП комплекса Cas9/gRNA (3 мкМ Cas9:gRNA) и 1 мкг трансгенной конструкции
Условия встряхивания на вортексе: максимальная скорость, первый раунд 15 с, перерыв 10 с, второй раунд 10 с	Условия электропорации: кювета 2 мм, квадратные волны, 300V, 6 импульсов, длина импульса 4 мс, интервал между импульсами 100 мс. Кювету со смесью коротко охлаждают во льду до и после электропорации
Каждую реакционную смесь ресуспендируют в 600 мкл свежей жидкой среды TAP+аргинин в отдельной пробирке
4. Восстановление и отбор
Клетки восстанавливаются при температуре +20-25°С и тусклом свете в течение 24 ч
Культуральную смесь встряхивают на вортексе и переносят на чашки Петри с твердой селективной средой TAP (1,5% агар, 10 мкг/мл антибиотик)
Клетки выращивают при температуре +20-25°С в цикле свет (200–300 µE/м2 сек) – 14 ч, темнота – 10 ч до формирования колоний трансформантов (одна-две недели)

 

Разработка передовых методов редактирования генов сыграло важную роль в становлении C. reinhardtii как модельного организма для изучения микроводорослей.  Достижения последних лет, среди которых: установление правил дизайна трансгенов, создание модульной системы клонирования (Chlamydomonas Modular Cloning kit) и адаптация системы CRISPR/Cas9 для направленного редактирования генома, – существенно повысили эффективность экспрессии внедряемых в клетки хламидомонады трансгенов и общий потенциал генной инженерии микроводорослей. Это открывает перспективы создания новых штаммов-продуцентов биологически-активных веществ, ценных как для фундаментальных исследований, так и для практического использования, и позволит пополнить ресурсы единственной в России Петергофской генетической коллекции штаммов C. reinhardtii.

 

Заключение

Одноклеточная зеленая водоросль C. reinhardtii – популярный модельный организм в молекулярной биологии и генетике. Степень изученности генетических систем хламидомонады является стандартом для других микроводорослей. Доступность, простота культивирования и возможность манипулирования всеми тремя геномами (ядерным, хлоропластным и митохондриальным) позволили исследователям внести значительный вклад в изучение и разработку новых подходов генетической инженерии ДНК у микроводорослей.

Система редактирования генома CRISPR/Cas9 открыла новую страницу в генной инженерии C. reinhardtii – стала возможна направленная вставка трансгена в ядерный геном. За последние годы было накоплено достаточно сведений о параметрах, которые оказывают влияние на этот процесс, достигнуты значительные успехи в разработке высокоэффективных протоколов трансформации клеток и наработке ценных ферментов и белков. Представленный в 2018 году Chlamydomonas Modular Cloning kit призван унифицировать процесс дизайна трансгенных конструкций. Стандартизированные генетические элементы могут быть легко заменены и собраны в полноценные единицы экспрессии, которые далее позволяют создавать мультигенные конструкции более высокого порядка – это открывает возможность внедрения в клетки новых метаболических путей [42, 61].

Микроводоросли в целом, – интересный объект для внедрения и адаптации новых подходов к манипулированию геномами. Они содержат широкий спектр полезных веществ: антиоксиданты, липиды, белки, углеводы и вторичные метаболиты. Например, зеленая водоросль C. vulgaris (хлорелла) может быть использована как продуцент 18 аминокислот, 20 витаминов и множества минералов [82]. Микроводоросли являются исключительно богатым источником фармакологически активных метаболитов, обладающих противоопухолевыми, антибактериальными, противогрибковыми и противовирусными свойствами, а также пригодными организмами для очистки сточных вод и производства биотоплива.

В настоящее время для биосинтеза ценных соединений как правило, используют гетеротрофные платформы – бактерии, дрожжи, культуры клеток. Тем не менее, развитие биоэкономики и потребность в устойчивых альтернативах продуктам нефтехимии стимулируют интерес к поиску и использованию новых организмов-продуцентов, в том числе фотосинтезирующих микроводорослей. Достижения в области биосинтеза рекомбинантных белков в хлоропластах C. reinhardtii, а также постоянно совершенствующиеся техники трансформации подчеркнули потенциал этой водоросли как основы для коммерческого использования [36]. Существует ряд специфических свойств, которые делают микроводоросли идеальными кандидатами для производства различных пищевых добавок, коммерческих ферментов, а также белков терапевтического назначения: 1) культивирование микроводорослей доступно, наращивание биомассы занимает немного времени, легко контролируется и масштабируется, 2) трансгенные микроводоросли можно получить быстро, за 4-5 недель, 3) возможность трансформации пластома и ядерного генома позволяет производить несколько трансгенных белков (или целый белковый комплекс) в одном организме. Несмотря на то, что бактериальные и дрожжевые системы более экономичны, они имеют ряд недостатков. Их использование не всегда позволяет получать функциональные белки из-за возможных проблем в процессах посттрансляционных модификаций и фолдинга белков. Использование другой альтернативной платформы – наземных растений – позволяет обеспечить огромную экономию за счет потенциального масштаба культивирования, однако долгое получение трансгенных линий (4–6 лет), возможность потока генов через пыльцу в окружающую среду и запрет на открытое выращивание трансгенных растений делают эту платформу менее экономически выгодной [4, 31, 83].

Есть все основания полагать, что микроводоросли в перспективе могут стать альтернативной платформой для наработки хозяйственно ценных соединений в промышленной и медицинской биотехнологии. Как наиболее изученная в генетическом отношении одноклеточная водоросль, хламидомонада имеет потенциал стать главной платформой развития биотехнологии микроводорослей [84].

About the authors

Pavel A. Virolainen

St. Petersburg State University

Email: st085618@student.spbu.ru
ORCID iD: 0000-0001-5918-9395
SPIN-code: 6564-9350
Scopus Author ID: 57883811500

PhD student

Russian Federation, 7/9 Universitetskaya nab., St. Petersburg, 199034, Russia

Elena M. Chekunova

St. Petersburg State University

Author for correspondence.
Email: e.chekunova@spbu.ru
ORCID iD: 0000-0001-8942-4771
SPIN-code: 2788-6386
Scopus Author ID: 6701797455

Doctor of Science (Biology), Senior Teacher

Russian Federation, 7/9 Universitetskaya nab., St. Petersburg, 199034, Russia

References

Supplementary files