Gut microbiota of healthy and saprolegniosis-affected whitefish (Coregonus nasus) producers in aquaculture

Full Text

Введение

 

Рыба является богатейшим источником белка и эссенциальных жирных кислот омега-3 для человека. Постоянно возрастающая потребность в пищевых ресурсах формирует спрос на увеличение производства пищи, в первую очередь, богатой животным белком. Современные объемы лова рыбы и других гидробионтов в некоторых странах не сопоставимы с фактическими потребностями населения в рыбной продукции, что компенсируется деятельностью аква- и марикультуры. Интенсивное развитие аквакультуры сопряжено с проблемами, связанными с инфекциями рыб, которые наносят существенный вред рыбным хозяйствам и аквакультурному сектору мировой экономики в целом [1]. Традиционными объектами аквакультуры северных приарктических регионов являются холодолюбивые виды рыб, наиболее ценными из которых являются сиговые виды, к которым относится чир (Coregonus nasus, Pallas, 1776). Чир – быстрорастущий вид сиговых рыб, который встречается во всех реках бассейна Северного Ледовитого океана от р. Волонги (Чёшская губа) до Чукотки и Аляски.

Нерест чира проходит при понижении температуры воды до 0°С, что в индустриальных условиях усложняет рыбоводные процессы в виду формирования ледяного покрова. Ледяной покров может травмировать кожу нерестящегося чира с последующим развитием на ней патогенных микроорганизмов. Усугубляют положение физиологические изменения в организме рыб, связанные в первую очередь с истощением эндогенных запасов, снижением физиологического статуса и общего иммунитета [2]. Травматизация кожных покровов чира в аквакультуре может быть вызвана классическими рыбоводными манипуляциями: отловом рыб, их бонитировкой перед нерестовой кампанией, получением половых продуктов и др. В условиях аквакультуры травмированные участки кожи чира поражаются сапролегниозом, являющимся одним из наиболее опасных оомицетных заболеваний пресноводных рыб, вызываемых представителями порядка Saprolegniales. Это заболевание является причиной экономических потерь в отрасли аквакультуры во всем мире [3].

На сиговых рыбоводных хозяйствах доля пораженных особей чира не превышает 5%. Однако это количество может быть существенным, учитывая ежегодную гибель производителей и потерю икры, которая могла быть задействована в получении личинок для товарной аквакультуры или воспроизводства. Сапролегниоз как инфекционное заболевание отражается на физиологических показателях рыб, в том числе на параметрах крови.

Важной составлящей, определяющей качественное состояние иммунного статуса рыб, является кишечная микробиота. Бактериальное население кишечника рыб проявляет антагонистическую активность по отношению к патогенным объектам, а также синтезирует ряд ферментов, повышая биодоступность кормовых объектов, в том числе вовлекая в метаболизм такие сложные полимеры, как целлюлоза, хитин, коллаген [4]. Любое инфекционное заболевание, в том числе и сапролегниоз, оказывает влияние на микробиом кишечника рыб [5]. В настоящее время набирает популярность изучение кишечной микробиоты рыб методом NGS-секвенирования, который позволяет оценить различия в таксономическом составе микробиома и количественное соотношение различных видов [5]. Этот метод может лечь в основу решения актуальной для рыбоводной отрасти проблемы сапролегниоза. В частности, оценка различий в кишечных микробиомах здоровых рыб и рыб, пораженных сапролегнией, поможет подобрать терапию заболевания, включающую редактирование микробиоты путем внесения пробиотических и пребиотических препаратов, что позволит снизить интенсивность инфекционного процесса и минимизировать финансовые потери рыбоводных хозяйств. Данное исследование посвящено установлению различий в микробиоте кишечника здоровых рыб и рыб, пораженных сапролегниозом с помощью метода высокопроизводительного секвенирования.

 

 

Материалы и методы

 

Материалы

Исследования проводили на рыбоводном хозяйстве ООО «Форват. Сиговый питомник», расположенного на оз. Суходольское (Приозерский р-н, Ленинградская обл.), на котором в индустриальных условиях выращиваются различные виды сиговых рыб [6].

Производителей чира содержали в делевых рыбоводных садках площадью 100 м² с естественным водообменном и температурным режимом, что способствует достижению половозрелости рыб естественным путем.

Производителией чира в возрасте 5+ в период нерестовой кампании сразу после отбора половых продуктов (11.12.24 г., температура воды 1,8°С) помещали в бассейны с проточной водой. Общее количество отобранных рыб составляло 10 экз., в том числе 5 особей (2 самки и 3 самца) с выраженными клиническими признаками сапролегниоза и 5 особей (2 самки и 3 самца) визуально здоровых рыб (рис. 1).

Рис. 1. Типичный внешний вид объектов исследования. А – здоровый чир; B – чир с незначительным поражением спинного плавника и участков спины. Рыба имеет нормальный экстерьер и пигментацию покровов; C – чир с обширным поражением сапролегнией. Рыба по внешнему виду истощена, имеет более светлые покровы тела.

 

Масса рыб, пораженных сапролегниозом варьировала от 1110 г до 1436 г, без признаков заболевания - от 988 до 1522 г.

У рыб брали образцы крови, асептически извлекали кишечники, печень. Материалы транспортировали короткое время на льду. Кишечники и сыворотку крови до момента анализа хранили при температуре -80°С.

 

NGS секвенирование

Результаты получены с использованием оборудования ЦКП «Геномные технологии, протеомика и клеточная биология» ФГБНУ ВНИИСХМ (Санкт-Петербург, Россия).

Для выделения ДНК из образцов, соответствующих количеству рыб (n=10), был использован набор реактивов (MACHEREY-NAGEL NucleoSpin Soil) компании MACHEREY-NAGEL (Германия) согласно инструкции производителя. Из каждого образца была выделена ДНК в трехкратной повторности для получения независимых библиотек.

Таксономический анализ прокариотического сообщества проводили с универсальными праймерами F515/R806 на вариабельный участок гена 16S рибосомной РНК (рРНК)-v4 (GTGCCAGCMGCCGCGGTAA /GGACTACVSGGGTATCTAAT), специфичными для широкого круга микроорганизмов, включая бактерии и археи [7]. Все праймеры имели служебные последовательности, содержащие линкеры и баркоды (необходимые для секвенирования по технологии Illumina).

ПЦР была проведена в 15 мкл реакционной смеси, содержащей 0,5 – 1 единицу активности полимеразы Q5^® High-Fidelity DNA Polymerase (NEB, США), по 5 пкМ прямого и обратного праймеров, 10 нг ДНК-матрицы и 2нМ каждого dNTP (LifeTechnologies, США). Смесь денатурировали при 94⁰С 1 мин., после чего следовало 35 циклов: 94⁰С – 30 с, 50⁰С – 30 с, 72⁰С – 30 с. Финальную элонгацию проводили при 72⁰С 3 мин. ПЦР продукты очищали по рекомендованной Illumina методике с использованием AMPureXP (Beckman Coulter, США).

Электрофоретическое разделение ПЦР-продуктов и оценку качества ампликонных библиотек проводили в 1% агарозном геле (Агароза марки Biotechnology Grade, VWR International LLC, США). После электрофореза гели окрашивали бромистым этидием и фотографировали с помощью системы визуализации Gel-Doc (Bio-Rad, США). В качестве маркера молекулярного веса продуктов гидролиза использовали маркер производства СибЭнзим (100 bp+1,5Kb+3Kb).

Дальнейшую подготовку библиотек проводили в соответствии с инструкцией производителя MiSeq Reagent Kit Preparation Guide (Illumina) (https://support.illumina.com/documents/documentation/chemistry documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf). Библиотеки секвенировали в соответствии с инструкцией изготовителя на приборе Illumina MiSeq (Illumina, США) c использованием набора реактивов MiSeq® ReagentKit v3 (600 cycle) с двусторонним чтением (2*300 нуклеотидов). Количество прочтений варьировалось от 16 до 100 тыс в зависимости от повторности.

Первичная обработка полученных данных, а именно, демультиплексирование образцов и удаление адаптеров, проводили с помощью программного обеспечения компании Illumina (Illumina, США). Для последующего «деноизинга», объединения последовательностей, удаления химерных прочтений, оценки качества сиквенсов, восстановления исходных филотипов (ASV, Amplicon sequence variant) и дальнейшей таксономической классификации полученных ASV, использовали программные пакеты dada2 [8], phyloseq [9] и DECIPHER [10] и базу данных рРНК SILVA релиз 138 [11]. Работу осуществляли в программной среде R [9]. Для представления данных таксономического анализа использовали средства программного пакета QIIME [12].

 

Гематологический анализ

Перед отбором крови рыб помещали в ванну с анестетиком (гвоздичное масло) [13]. Кровь отбирали из хвостовой вены медицинскими шприцами 2 мл с иглами 23G в гематологические пробирки, предварительно просушив место прокола бумажной салфеткой.

В данной работе использовали классические методы гематологического обследования рыб [14]. Гемоглобин определяли колориметрическим методом на спетрофотометре СФ-2000 (Россия) при длине волны 540 нм с использованием раствора Драбкина в разведении 1:250 [14]. Эритроциты подсчитывали в камере Горяева с применением раствора Хендрикса в разведении 1:200 [14]. Содержание гемоглобина в эритроците (СГЭ) определяли как отношение общего гемоглобина к общему числу эритроцитов, результат выражали в пикограмах (пг). Скорость оседания эритроцитов измеряли в аппарате Панченкова, для этого кровь разводили 5% раствором цитрата натрия в соотношении 1:4 на часовом стекле. Общий белок сыворотки определяли методом биуретовой реакции (реактив Общий белок-Ольвекс, Россия), оптическую плотность полученных растворов определяли при длине волны 540 нм на СФ-2000.

Мазки крови окрашивали комбинированным способом по Паппенгейму [14]. Клетки крови анализировали на микроскопе МикМед-2 (увеличение 1000 крат.) и фотографировали с использованием цифровой камеры Levenhuk1400MPlus (Россия).

 

Морфофизиологические параметры

У рыб измеряли длину, массу тела и массу печени. На основе измерений вычисляли морфофизиологические индексы: индекс печени и коэффициент упитанности по Фультону [15].

 

Статистика

Статистический анализ выполняли в программе Statistica. Достоверность отличий между выборками данных определяли с помощью U-критерия Манна-Уитни, который используется для сравнения двух независимых выборок. Отличия считались достоверными при p<0,05

 

Результаты и обсуждение

Сапролегниоз – распространенное инфекционное заболевание, вызываемое грибоподобными организмами порядка Saprolegniales, которому подвержены рыбы разного вида и возраста. Одним из факторов развития сапролегниоза является понижение температуры воды до 2-3 °С, что определяет зону риска для сиговых рыб, в том числе чира, нерест которого в аквакультуре начинается при данных температурах. К клиническим признакам заболевания относятся ватообразное, как правило, белого цвета, разрастание патогена на различных участках поверхности тела, плавниках, жабрах, реже на внутренних органах [16]. В отличие от бактериальных и вирусных инфекционных заболеваний, сапролегниоз не протекает в острой и молниеносной формах, что обуславливает достаточно длительное накопление патогена в организме рыбы и определяет наличие бессимптомного носительства у визуально здоровых особей. Отсутствие клинических проявлений сапролегниоза у рыб не может быть гарантией здоровья, в связи с чем желательно дополнительное подтверждение их состояния по гематологическим и морфофизиологическим параметрам. У исследованных производителей чиров определяли массу, индекс печени, коэфффициент упитанности по Фультону, концентрацию гемоглобина, содержание гемоглобина в эритроците (СГЭ), скорость оседания эритроцитов (СОЭ), общий белок сыворотки (ОБС) (таблица 1).

Таблица 1. Морфофизиологические и гематологические параметры чира, результаты представлены в виде среднего значения M ± стандартная ошибка m (первая строчка каждого параметра), и минимального и максимального значений lim (вторая строчка каждого параметра)

	Здоровые	C признаками сапролегниоза
Масса, г	1181±103,4 966-1522	1293±58,4 1110-1436
Индекс печени	1,36±0,1 1,04-1,82	1,67±0,1 1,4-2,0
Коэффициент упитанности по Фультону	1,41±0,2 0,86-1,82	1,39±0,1 1,07-1,70
Гемоглобин, г\л	70±4,6 60-86	52±14,7 3-84
Эритроциты, млн\мкл	0,98±0,1 0,76-1,21	0,70±0,2 0,06-1,37
Содержание гемоглобина в эритроците (СГЭ), пг	73±6,2 50-85	73±9,1 46-98
Скорость оседания эритроцитов (СОЭ), мм\ч	2,7±0,3 2,0-4,0	3,6±1,0 2,0-7,0
Общий белок сыворотки (ОБС), г\л	52±4,9* 41-65	34±8,8* 6-61

* - различия достоверны при p˂0,05

 

Достоверные отличия установлены только в содержании общего белка в сыворотке крови, которое значительно меньше у чиров с признаками сапролегниоза, что указывало на нарушение обменных процессов у таких рыб. Также наблюдалась тенденция к повышению гепатосоматического индекса у рыб, пораженных сапролегнией (табл. 1).

В группе особей с клиническими признаками сапролегниоза наблюдали значительную вариабельность гематологических показателей, в связи с чем рыб в данной группе следует рассматривать индивидуально, в зависимости от степени развития инфекции. Так, по мере повышения тяжести поражения кожных покровов сапролегнией у рыб снижались показатели красной крови, при этом не происходило нарушения морфологии эритроцитов, в отличии от особей с тяжелой формой заболевания, для которых характерна анемия (рис. 2).

Рис. 2. Клетки крови здоровых рыб, рыб с незначительным поражением и с высокой долей поражения сапролегией. А, B – типичная картина крови здоровых особей (гемоглобин 60-80 г\л); C, D – клетки крови особей с незначительным поражением сапролегнией, эритроциты нормальной формы (гемоглобин 60-80 г\л); E – типичный мазок крови особей с обширным поражение сапролегниозом, характерна анемия, вакуолизация цитоплазмы эритроцитов (гемоглобин 30-35 г\л); F – типичный мазок крови особй с тяжелой формой поражения инфекцией (гемоглобин ниже 20-30 г/л). Стрелками показаны нейтрофилы: у особей с сапролегнией наблюдается тенденция к увеличению размеров этих клеток.

 

У рыб с клиническими признаками сапролегниоза визуально увеличены нейтрофилы, тогда как у здоровых особей они не превышали размеры эритроцитов.

Гематологические параметры являются важными показателями состояния здоровья: рыбы с высоким гемопоэзом более эффективно справляются с бактериальными инфекциями, а также с сапролегниозом [17].

Пониженные индивидуальные характеристики крови рыб с сапролегниозом свидетельствовали о происходящих патологических изменениях в организме, в данном случае на фоне инфекции. Полученные гематологические данные здоровых особей чира укладывались в нормальный диапазон физиологических значений для сиговых рыб [14], которые также согласуются с собственными многолетними исследованиями [18].

Таксономический анализ бактериального сообщества, проведенный методом высокопроизводительного секвенирования, позволил идентифицировать представителей 18 фил (таблица 2).

Таблица 2. Представленность фил бактерий в кишечном микробиоме чиров.

Таксон	Усредненные доли в кишечном микробиоме чиров, %
	здоровые	с признаками сапролегниоза
Proteobacteria	29,75	45,37
Firmicutes	30,27	24,91
Actinobacteriota	26,67	19,45
Bacteroidota	1,66	0,99
Fusobacteriota	1,15	0,47
Deinococcota	0,41	0,43
Acidobacteriota	0,13	0,20
Planctomycetota	0,11	0,20
Verrucomicrobiota	0,49	0,15
Cyanobacteria	0,02	0,13
Synergistota	0,03	0,12
Patescibacteria	0,30	0,09
Campilobacterota	0,12	0,03
Desulfobacterota	0,00	0,03
Gemmatimonadota	0,01	0,03
Nitrospirota	0,00	0,01
Bdellovibrionota	0,03	0,00
Myxococcota	0,03	0,00
Неклассифицированные филотипы	8,84	7,37

 

К наиболее крупным филам, сожержащим суммарно 90 % всех обнаруженных операционных таксономических единиц (ОТЕ), относились Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteriota, Bacteroidota, Fusobacteriota. Филы Deinococcota, Acidobacteriota, Planctomycetota, Verrucomicrobiota, Cyanobacteria, Synergistota, Patescibacteria, Campilobacterota, Desulfobacterota, Gemmatimonadota, Nitrospirota, Bdellovibrionota, Myxococcota отличались низким обилием ОТЕ (менее 0,50 %) и в совокупности составляли 1,43 и 1,68 % всего кишечного микробиома поражённых сапролегнией и здоровых особей чира, соответственно. Доля неклассифицированных филотипов составила 7,37 и 8,84 % для рыб с признаками сапролегниоза и без таковых.

Поскольку целью настоящего исследования было изучение таксономического состава прокариотических организмов, населяющих кишечник рыб, в статье не приведены данные о контаминации желудочно-кишечного тракта представителями рода Saprolegnia. При этом отмечена разница в бактериальном населении кишечников рыб с клиническими признаками сапролегниоза и здоровых особей. Так, доля фил Proteobacteria, Firmicutes и Actinobacteriota составляла 89 и 86 % всех выделенных ОТЕ в кишечных микробиомах поражённых и здоровых чиров, соответственно, однако соотношение фил у рыб с патологиями и без разнилось (рис. 3).

Рис. 3. Соотношение фил в кишечном микробиоме здоровых чиров и чиров с клиническими признаками поражения сапролегнией. Чиры с признаками сапролегниоза 1, 2 и 3 были классифицированы как умеренно зараженные, 4 и 5 – с признаками сильного заражения (по данным гематологии, см. рис. 2)

 

Для рыб с клиническими признаками сапролегниоза определено доминирование бактерий, относящихся к филе Proteobacteria, составляюшей 28,50-78,60 % от суммы ОТЕ (в среднем 45,30 %). Филы Firmicutes и Actinobacteriota субдоминировали в их кишечном микробиоме (средние значения 24,91 и 19,45 %, соответственно). У здоровых рыб доли представителей филы Proteobacteria, Firmicutes и Actinobacteriota были близки и в среднем составляли 29,75, 30,27 и 26,67 %, соответственно. Следует отметить, что у здоровых рыб отмечен меньший размах вариации долей вышеуказанных фил по сравнению с особями с сапролегниозом, что может свидетельствовать о большей стабильности микробиома здоровых рыб.

Филы Bacteroidota и Fusobacteriota представлены значительно меньшим количеством ОТЕ, у поражённых сапролегнией чиров доли представителей данных фил в кишечном микробиоме (0,47 и 0,99 %) уступали показателям, выявленным у здоровых рыб (1,15 и 1,66 %).

Известно, что представители филы Bacteroidota способны вступать в мутуалистические взаимоотношения (облигатный симбиоз), оказывая положительное влияние на нормальное развитие и функционирование желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) организма-хозяина [19]. Также кишечные бактероиды обычно продуцируют бутират, конечный продукт ферментации толстой кишки, который, как считается, обладает полезными хозяину свойствами (например, противоопухолевыми) и, таким образом, играет роль в поддержании здоровья кишечника [20]. Они также участвуют в метаболизме желчных кислот и инактивации токсических и/или мутагенных соединений [21].

Исследования показали, что фузобактерии активируют воспалительные реакции организма-хозяина, в то же время снижение их количества в кишечнике ограничивает резистентность организма к различного рода патогенам [22]. Это характеризует Fusobacteriota как преимущественно полезную микрофлору.

Для поражённых сапролегниозом и здоровых рыб отмечены также различия в кишечном микробиоме на уровне классов (рис. 4).

Рис. 4. Соотношение разных классов бактерий в кишечном микробиоме здоровых чиров и чиров с клиническими признаками поражения сапролегнией. Чиры с признаками сапролегниоза 1, 2 и 3 были классифицированы как умеренно зараженные, 4 и 5 – с признаками сильного заражения (по данным гематологии, см. рис. 2)

 

В филе Actinobacteriota доминирующим классом являлся Actinobacteria, доля представителей которого составляла 19,31 и 26,50 % для рыб с сапролегниозом и здоровых рыб, соответственно. Фила Firmicutes преимущественно представлена классами Bacilli, Negativicutes и Clostridia, содержащих 16,24, 5,57 и 2,99 % всего выявленного бактериального разнообразия кишечной микробиоты поражённых сапролегнией рыб. В микробиоме здоровых рыб доля бактерий классов Bacilli, Negativicutes и Clostridia незначительно превышала аналогичные показатели противопоставляемой здоровым группе рыб и составляла 18,67, 8,49 и 3,05 %. Известно, что данные представители являются автохтонными для кишечника рыб и обеспечивают поддержание постоянства микробиоты за счет активного метаболического потенциала [23].

В филе Proteobacteria отмечены классы Gammaproteobacteria и Alphaproteobacteria. Доля представителей класса Gammaproteobacteria в кишечном микробиоме поражённых сапролегниозом особей варьировала в пределах 9,07-78,20 %, в среднем составляя 28,36 %, тогда как у здоровых рыб среднее число ОТЕ класса Gammaproteobacteria составляло 18,79 %, изменяясь в диапазоне от 8,53 до 29,60 %. Класс Alphaproteobacteria в микробиоме поражённых сапролегнией рыб был представлен 17,00 % ОТЕ (0,40 – 31,30 %), у здоровых рыб – 10,97 % (1,63 – 19,23 %). Следует отметить особь под номером 5, с признаками сильного заражения сапролегниозом, согласно клиническому анализу крови (Рис.2). Микробиом этой особи харатеризовался высокой долей (78,20 %) ОТЕ класса Gammaproteobacteria, низкой долей представителей класса Actinobacteria и отсутствием ОТЕ класса Alphaproteobacteria в сравнении с остальными особями, что могло быть обусловлено высокой степенью пораженности сапролегнией данной особи.

Анализ полученных данных показал значительно больший размах вариации долей представителей классов Gammaproteobacteria и Alphaproteobacteria в кишечных микробиомах чиров с сапролегниозом в сравнении со здоровыми особями. Поскольку размах вариации признака является одним из показателей стабильности системы, можно сделать вывод о большей устойчивости микробиома здоровых особей и дисбалансе кишечной микробиоты особей, пораженных сапролегнией.

 

Заключение

В целом, инфицирование сапролегниозом воздействовало на организм чиров и находило отражение в составе кишечной микробиоты и в гематологических показателях. Пониженные индивидуальные гематологические показатели у рыб с сапролегниозом свидетельствовали о происходящих патологических процессах в организме, в то время как гематологические данные здоровых особей укладывались в нормальный диапазон физиологических значений для сиговых рыб. Микробиом особей чира с клиническими признаками заболевания отличался от такового здоровых рыб на уровне фил и классов. Из результатов видно, что преобладающими филумами в обоих случаях были Proteobacteria, Firmicutes и Actinobacteriota, за исключением сильно пораженной особи №5, где доминировали представители Proteobacteria. Филы Bacteroidota и Fusobacteriota составляли минорную часть у поражённых сапролегнией и здоровых рыб. При этом был выявлен значительный размах вариации долей класса Actinobacteria (фила Actinobacteriota), Gammaproteobacteria и Alphaproteobacteria (фила Proteobacteria) у рыб с признаками сапролегниоза по сравнению со здоровыми особями. Высокий размах вариации численности ОТЕ мог указывать на нестабильность микробиома вследствие различных стадий воспалительного процесса у изучаемых особей на фоне развития инфекционного заболевания, что в совокупности с общим стрессом нерестового периода, обусловило перестройку бактериального сообщества кишечника рыб. Полученные различия в микробиоте кишечника здоровых чиров и особей, пораженных сапролегниозом, свидетельствуют о необходимости применения профилактической терапии в виде корректировки бактериального компонента кишечников рыб с целью повышения иммунной защиты чиров в условиях интенсивного рыбоводства.

About the authors

Maxim Vylka

St. Petersburg branch of "VNIRO" ("GosNIORH" named after L.S. Berg), St. Petersburg

Email: vylka.maxim@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-7583-864X
SPIN-code: 5468-2834
Russian Federation

Anatole Lyutikov

St. Petersburg branch of "VNIRO" ("GosNIORH" named after L.S. Berg), St. Petersburg

Email: tokmo@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0418-8218
SPIN-code: 9187-6075
Russian Federation

Svetlana Dyakova

St. Petersburg branch of "VNIRO" ("GosNIORH" named after L.S. Berg), St. Petersburg

Email: dyakova@niorh.vniro.ru
ORCID iD: 0000-0001-9970-403X
SPIN-code: 4202-4471
Russian Federation

Denis Karlov

All-Russian Research Institute of Agricultural Microbiology, St. Petersburg

Email: ds.karlov@arriam.ru
ORCID iD: 0000-0002-9030-8820
SPIN-code: 8355-8091
ResearcherId: E-2552-2014
Russian Federation

Alina A. Zhukova

Russian State Pedagogical University named after. A.I. Herzen, St. Petersburg

Email: gatteriyagreen@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-4416-1901
SPIN-code: 6849-0483

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, Saint Petersburg; Saint Petersburg

Vasily Golotin

St. Petersburg branch of "VNIRO" ("GosNIORH" named after L.S. Berg), St. Petersburg

Author for correspondence.
Email: golotin@bk.ru
ORCID iD: 0000-0003-0385-2463
SPIN-code: 7198-3170
Scopus Author ID: 56641547400
Russian Federation

References

Supplementary files