Зачем растениям агробактериальные гены?

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Агробактерии — это сборная группа почвенных бактерий, состоящая из представителей нескольких родов [1], способных переносить и интегрировать в геном растения фрагмент собственной ДНК, получившей название Т-ДНК (transferred DNA) [2]. В большинстве случаев при такой трансформации трансгенной оказывается только часть тканей растения, как правило, в области корневой шейки. Остальные ткани, включая ткани генеративных органов, остаются нетрансгенными [3].

В то же время, известны примеры, когда Т-ДНК присутствует в геноме целого растения и передается из поколения в поколение. Такая Т-ДНК получила название клеточной (клТ-ДНК), а растения, ее содержащие, называются природно-трансгенными, или природными генетически модифицированными организмами (ГМО, пГМО) [4]. В этом случае мы имеем дело с горизонтальным переносом генов от агробактерий к растениям, роль которого в эволюции растений исследована далеко не в полной мере [5].

Отталкиваясь от наших знаний о роли горизонтального переноса генов в эволюции прокариот, можно предполагать сходные эффекты и в случае эукариот, а именно приобретение и наследование новых признаков, дающих селективные преимущества, которые можно условно подразделить на две группы:

1. улучшение существующих функций;
2. появление у реципиента новых функций (например, изменения в питании, новые защитные функции и т. д.) [6–8].

Первые пГМО, ставшие результатом древней агробактериальной трансформации, были описаны в пределах рода Nicotiana L. [9], далее они были найдены молекулярно-генетическими методами в пределах еще двух родов — Linaria Mill. и Ipomoea L. [10–12]. В 2017 г. мы опубликовали обзор, посвященный биологическим особенностям известных на тот момент природно-трансгенных растений, а также возможным функциям генов, полученных растениями от агробактерий [13]. На тот момент обсуждались такие функции клТ-ДНК, как:

• увеличение корневой массы для адаптации к произрастанию растений в засушливых условиях;
• невосприимчивость к повторной агробактериальной инфекции;
• усиление регенерационной способности;
• переход к более раннему зацветанию и, как следствие, переход к однолетнему жизненному циклу;
• влияние на сообщества микроорганизмов ризосферы и филлосферы растения [13].

За последние годы с использованием биоинформатических методов список природных ГМО увеличился на порядок [14, 15]. Таким образом, настало время для новых обобщений относительно функций клТ-ДНК и эволюционной роли горизонтального переноса агробактериальных генов в растения. Этой теме и посвящен представленный обзор.

Новые таксоны природных ГМО

Развитие методов секвенирования нового поколения открывает новые возможности для исследования геномов растений, количество данных о структуре которых растет лавинообразно. Постоянно пополняемые базы данных являются ценным источником для поиска новых пГМО, проводимых нашей группой [14].

Анализ секвенированных геномов наземных растений позволил нам найти гомологи агробактериальных генов только в пределах отдела покрытосеменных. В настоящее время общепринятым считается представление о том, что агробактерии гораздо эффективнее трансформируют двудольные растения, чем однодольные [16]. Эта идея подтверждается данными о распространении природных ГМО. Среди нескольких десятков видов новых природных ГМО только два относятся к однодольным. При этом систематическое положение одного из них (Dioscorea alata L.) является дискуссионным, а второй вид (Musa acuminata Colla) отнесен к природным ГМО только на основе данных, полученных при анализе транскриптома корней [14]. Таким образом, эти данные требуют дополнительных исследований и осторожной интерпретации.

Среди двудольных растений приуроченности природно-трансгенных видов к конкретной таксономической группе не отмечено. Природные ГМО описаны в пределах порядков Malpighiales, Fabales Rosales, Cucurbitales, Fagales, Brassicales, Myrtales, Sapindales, Caryophyllales, Cornales, Ericales, Lamiales, Solanales [14, 15]. География распространения природных трансформантов широка: от тропиков и субтропиков (ним, представители рода Camellia L.) до лесотундры и тундры (представители рода Vaccinium L.), и затрагивает все континенты, за исключением Антарктиды [14, 17–20]. В список природных ГМО попали многие культурные растения, используемые людьми разных стран и народов в пищу, а также лекарственные растения. К таким растениям относятся чай, гуава, арахис, хмель, батат, клюква и др. По предварительным оценкам около 7 % двудольных растений могут содержать в геномах следы агробактериальной трансформации. Эта оценка основана на на данных о доле природных ГМО среди видов двудольных с отсеквенированными геномами [14].

Стоит ли искать единую функцию клТ-ДНК для всех природных ГМО?

Для ответа на этот вопрос необходимо оценить структуры клТ-ДНК природных ГМО и разнообразие интактных генов в них.

Прежде чем рассматривать разнообразие клТ-ДНК, кратко обозначим основные группы генов в их составе. Итак, в составе Т-ДНК обычно присутствуют гены синтеза опинов, продукты которых нужны для питания бактерий [21]. Помимо опин-синтаз, в клТ-ДНК закодированы онкогены, вызывающие неопластический рост тканей и представленные генами синтеза фитогормонов и plast-генами. Механизм влияния на морфогенез растений гормональных генов известен давно, в то же время plast-гены и механизмы их действия изучены гораздо слабее [22, 23].

Функции клТ-ДНК в природных ГМО начали обсуждать с момента их описания, дискутируя, какие из генов (онкогены или опин-синтазы) являются наиболее важными, подхваченными эволюцией приобретениями растений [4], однако до последнего момента не хватало фактического материала для исследований и обобщений. Сейчас ситуация изменилась. К началу 2021 г. уже было известно 36 родов покрытосеменных растений, в пределах которых описаны природно-трансгенные виды [14, 15]. Среди них доминирующее положение занимают те, в составе клТ-ДНК которых содержатся только гены синтеза опинов (см. рисунок, a). Этот феномен можно объяснить, как минимум, тремя способами. Во-первых, в известных на данный момент Т-ДНК гены синтеза опинов находятся ближе к правой границе, следовательно, они попадают в растительную клетку первыми в ходе трансформации. В случае обрыва Т-ДНК в процессе ее переноса именно опин-синтазы гарантированно попадают в клетку-реципиент [21]. Во-вторых, можно ожидать наличие штаммов агробактерий, в Т-ДНК которых присутствуют только гены опин-синтаз. В-третьих, нельзя исключать возможность трансформации растений протяженной Т-ДНК и потерю большей ее части в ходе эволюции потомков природного трансформанта с сохранением только генов синтеза опинов [24].

Рис. 1. Количество родов природных ГМО с различными по структуре клТ-ДНК (а) и типы структур протяженных клТ-ДНК (b)

На втором месте по численности расположились виды, содержащие протяженные фрагменты Т-ДНК с онкогенами и генами синтеза опинов. Протяженные клТ-ДНК в большинстве своем представлены инвертированными несовершенными повторами (см. рисунок, b) и часто содержат наряду с хорошо известными генами Т-ДНК новые малоизученные последовательности, как правило, относимые к plast-генам [14, 15, 25, 26], что свидетельствует о более широком разнообразии агробактериальных штаммов, трансформирующих растения, чем мы представляли ранее.

На последнем месте находятся клТ-ДНК, содержащие только онкогены [14, 15, 24]. Среди них особого внимания заслуживают plast-гены, найденные у представителей родов Vaccinium L. и Nyssa Gronov. ex L. Они интересны тем, что являются более филогенетически близкими к последовательностям plast-генов, обнаруженных в некоторых грибах базидиомицетах [14, 15].

Анализ ORF в составе клТ-ДНК всех трех типов на присутствие преждевременных стоп-кодонов или мутаций, являющихся причиной сдвига рамки считывания, показывает, что часть генов там остается интактной, в то время как другие мутируют [14–16]. Больше интактных последовательностей сохранилось среди опин-синтаз [15], тем не менее и среди plast-генов достаточно много интактных.

Подводя итог вышесказанному, можно заключить, что разные природные ГМО имеют разные наборы интактных генов в составе своих клеточных Т-ДНК. Значит, у клТ-ДНК нет универсальной функции. В разных группах растений эволюцией были подхвачены формы с различными сочетаниями трансгенов, а далее были сохранены интактными далеко не все из них.

Возможные функции plast-генов клТ-ДНК

Перед тем как обсуждать plast-гены клТ-ДНК, давайте очень кратко остановимся на том, что известно вообще об этом семействе генов. Название «plast-гены» происходит от слов «пластичность развития», оно было придумано, чтобы подчеркнуть способность этих генов при трансформации растений дикого типа изменять их морфогенез различным образом [26]. H. Levesque и соавт. [27] предположили, что plast-гены могут иметь сходные функции, связанные с их общим происхождением, и что их дивергенция может быть адаптацией к разным видам растений. Наиболее известные представители этого семейства — гены rolA, rolB, rolC, ORF13, ORF14 из Rhizobium rhizogenes (Riker et al. 1930) Young et al. (2001), ген 6b из Agrobacterium tumefaciens (Smith and Townsend 1907) Conn 1942 (Approved Lists 1980) emend. Hördt et al. 2020 [26]. Сложность анализа их функций заключается в том, что некоторые морфогенетические эффекты могут совпадать у разных генов, а другие — отличаться. Например, продукт гена rolB достаточен для индукции корнеобразования. RolC не способен самостоятельно индуцировать образование корней, но усиливает этот эффект, то есть проявляет синергическое действие с RolB [26]. При этом трансгенные растения, содержащие только rolB или только rolC отличаются окраской листьев (первые — темно-зеленые, вторые — светло-зеленые), что говорит об антагонизме действия генов [26]. Считается, что rolB обладает меристем-индуцирующей активностью [28, 29], но в то же время, вызывает некроз листьев табака [30], а rolC подавляет некротические эффекты, индуцированные rolB. Известно, что введение rolC в геном культурного табака и гвоздики (Dianthus caryophyllus L.) приводит к стимуляции побегообразования [26, 31], а в культуре клеток женьшеня (Panax ginseng C.A. Mey.) стимулирует соматический эмбриогенез [32]. Продукт гена ORF13 усиливает эффект rolB при индукции корнеобразования. Однако экспрессия orf13 в табаке [33, 34], томате [35] и арабидопсисе [36] приводила к различным изменениям роста трансгенных растений вплоть до карликовости. ORF14 не имеет четкого фенотипического проявления. Однако, тот факт, что гены rolA, rolB, rolC, ORF13, ORF14 всегда располагаются рядом в Т-ДНК, наводит на мысль об их возможной вовлеченности в контроль общего процесса [26]. А возможно, в разных растениях преимущественно функционируют разные комбинации генов из этого набора. То есть «включение» конкретных генов зависит от молекулярно-генетических особенностей реципиента. При этом молекулярные механизмы действия генов остаются до конца непонятными. Тот факт, что plast-гены описаны не только у природно-трансгенных растений, но и у некоторых грибов [22], наводит на мысль, что в случае существования некой общей функции всех plast-генов она должна затрагивать какие-то базовые биохимические процессы, характерные не только для растений [26].

До настоящего момента не было прямых доказательств функционирования plast-генов клT-ДНК в природных ГМО. Однако некоторые косвенные аргументы ясно указывают на то, что они могут влиять на рост естественных трансформантов. Гены rolC, orf13, orf14 часто остаются интактными у природно-трансгенных растений и экспрессируются [12, 22, 37], полный список экспрессирующихся генов можно воссоздать из обзора [4] и статьи [14], опубликованных нами ранее.

К ранее обсуждаемым в литературе функциям клТ-ДНК, связанным с plast-генами, относили увеличение корневой массы, усиление регенерационной способности и переход к более раннему зацветанию и однолетним жизненным циклам [13]. Что касается последней функции, то уже в 2017 г. нами было отмечено отсутствие четких фактов в ее поддержку, напротив, было сделано наблюдение о преобладании многолетних форм среди пГМО на фоне однолетних нетрансгенных видов, по крайней мере, у льнянок [13]. Расширенный список пГМО 2021 г. интересен тем, что в нем среди обладателей plast-генов оказалось много древесных форм растений. Соответственно, это многолетние растения [14, 15]. Таким образом, новые данные подтверждают наши прежние наблюдения. Тем не менее нельзя исключать выявления новых пГМО, в которых именно эта функция Т-ДНК окажется ключевой.

Что касается повышения регенерационной способности и индукции корнеобразования, то роль plast-генов в реализации этих функций требуют отдельного обсуждения. На данный момент экспрессия plast-генов продемонстрирована молекулярными методами у представителей родов Nicotiana (NgrolC, trolC, Ngorf13 и torf13) [22, 25, 38], Linaria (rolC) [39], Ipomoea (rolB/C-like, orf13, gene c) [10, 40]. В случае сверхэкспрессии в табаке Ngorf13 вызывает образование темно-зеленых округлых листьев [41], сверхэкспрессия NgrolC [42] и trolC [43] приводит к карликовому фенотипу и формированию ланцетовидных, бледно-зеленых листьев, тогда как torf13 индуцирует зеленые каллусы на дисках моркови [44]. У природно-трансгенных льнянок продемонстрирована тканеспецифичная экспрессия трансгена LvrolC в ходе регенерации растений из корневых эксплантов на безгормональной среде, что может свидетельствовать о вовлеченности продукта гена в регуляцию данного процесса [39]. Влияние rol-генов на регенерационную способность видов Nicotiana обсуждалась нами в предыдущих публикациях [4, 13]. Тогда нами был сделан вывод, что особенности морфогенетических реакций растений могут быть обусловлены, в том числе, комбинацией интактных rol-генов и их уровнем экспрессии у конкретного генотипа.

Анализ транскриптомов, депонированных в NCBI, может быть использован для первичного поиска экспрессирующихся генов новых природных ГМО. Имеющиеся на сегодня данные могут быть интерпретированы в пользу экспрессии plast-генов у растений рода Vaccinium и Diospyros [14, 15].

Наряду с морфогенетическими эффектами plast-генов в литературе обсуждают их роль в регуляции вторичного метаболизма, а также углеводного обмена. К наиболее распространенным биологически активным вторичным метаболитам растений относят алкалоиды, полифенольные соединения (флавоноиды, терпеноиды, кумарины, сапонины) и эфирные масла. Все эти соединения эффективно синтезируются в культурах косматых корней [45, 46]. В природных условиях они участвуют в защите растений от неблагоприятных абиотических факторов, а также в регуляции взаимодействия растений с другими организмами.

Хотя прямых доказательств участия генов клТ-ДНК в контроле содержания вторичных метаболитов пока нет, эту их роль пока исключать нельзя. J. Palazon с соавторами показали, что ген rolC повышает синтез никотина у полученного в лабораторных условиях трансгенного табака, а введение в геном растения кассеты из rolA, rolB, rolC увеличивает содержание никотина сильнее, чем единичный ген rolC. Конкретных механизмов регуляции этого процесса выявить пока не удалось [47–49].

У табака, льнянок и модельных трансгенных растений арабидопсиса показано влияние rolC и гена 6b на метаболизм сахаров [43, 50]. Эта функция обсуждается как некое общее свойство различных plast-генов, сохраненное ими от общей предковой последовательности. Эту гипотезу подтверждают наши предварительные данные анализа образцов клюквы Vaccinium macrocarpon Ait. и V. oxycoccos L., контрастных по наличию полноразмерного plast-гена ранее не известного среди штаммов агробактерий. Содержание моносахаридов выше в побегах форм клюквы с полноразмерным plast-геном по сравнению с образцами, содержащими мутантные аллели гена с обширной делецией [51].

Таким образом, сегодня нельзя исключать участия plast-генов в контроле морфогенеза растений. Но как это происходит пока не известно. Возможно, регуляция осуществляется через контроль углеводного обмена, а возможно, тут задействованы и другие механизмы. Контроль вторичного метаболизма растений — это важная составляющая регуляции растительно-микробных взаимодействий, поскольку вторичные метаболиты могут как привлекать, так и отпугивать микробов и насекомых [45, 46], демонстрируя важную экологическую роль. Но есть и другой класс соединений, способный привлекать конкретных микробов. Это опины.

Опин-синтазы

Опин-синтазы — это самые распространенные трансгены у природных трансформантов. Функции опин-синтаз вполне понятны и подробно изучены применительно к агробактериальным штаммам разного происхождения.

В случае природных ГМО наибольшего успеха достигли также при исследовании опин-синтаз, для которых продемонстрирована не только экспрессия на уровне РНК у десятков видов [24], но и способность растений накапливать соответствующие опины. Так, в природно-трансгенных растениях культурного табака был обнаружен дезоксифруктозил-глутамин, а в тканях другого пГМО — повилики — найден микимопин [52, 53]. Известно, что опины могут быть использованы как источники углерода и азота не только бактериями, но и грибами, имеющими ферменты их катаболизма [54]. Таким образом, можно предполагать роль опин-синтаз в регуляции состава микробных сообществ ризосферы растений. Этот факт подкрепляется также и тем, что гены опин-синтаз описаны помимо природных ГМО у многих бактерий за пределами группы агробактерий и широко распространены и в геномах грибов-аскомицетов [55]. У грибов отмечена определенная мозаичность в плане расположения на филогенетическом древе видов и изолятов, содержащих конкретные опин-синтазы, по отношению к обладателям других опин-синтаз в пределах одного более крупного таксона. Это наблюдение может быть интерпретировано в пользу роли горизонтального переноса генов в ходе распространения опин-синтаз среди грибов [55]. Следует отметить, что бóльшая часть обсуждаемых сейчас опин-синтаз аннотирована в отсеквенированных геномах, а их реальные функции только предстоит изучить с применением молекулярных и биохимических методов. Результатом этих исследований могут оказаться уже известные опины у организмов, где они раньше не исследовались, или новые варианты опинов, имеющие определенное структурное сходство с известными ранее. Кроме того, в ближайшие годы можно ожидать появление новых данных о роли опин-синтаз в регуляции формирования сообществ растений с бактериями и грибами. Для подтверждения этой мысли можно указать на возрастающий интерес к использованию ризопинов для привлечения полезных бактерий в ризосферу. Ризопины, хотя и отличаются от опинов агробактерий, выполняют сходную с ними функцию, привлекая ризобий, способных их метаболизировать, в ризосферу растения. С целью управления структурой микробного сообщества в лабораторных условиях были предприняты вполне успешные попытки метаболической инженерии растений. Результатом исследования стали трансгенные растения, синтезирующие ризопины, которые в свою очередь привлекали ризобий [56]. В случае природных ГМО всю работу за нас проделала природа.

Если оценивать разнообразие опин-синтаз в природных ГМО, то наибольшее количество интактных последовательностей описано для гомологов микимопин-синтаз и кукумопин-синтаз. Хотя это разные гены, их продукты — микимопин и кукумопин — являются изомерами [24]. Кукумопин- и микимопин-синтазы — наиболее привлекательные кандидаты для дальнейших исследований и разработки подходов к модификации сообществ микроорганизмов ризосферы растений.

Становятся ли пГМО невосприимчивыми к повторной трансформации?

К настоящему моменту среди природных ГМО описаны виды, имеющие множественные вставки клТ-ДНК. Эти виды относятся к родам Nicotiana L., Ipomoea L., Diospyros L., Parasponia Miq., Trema Lour., Silene L. и др. [14, 15, 25]. Особого внимания среди них заслуживают виды родов Nicotiana, Diospyros, Parasponia. В их геномах описаны множественные клТ-ДНК, организованные в виде инвертированных повторов. У Nicotiana tomentosiformis L. в геноме все четыре клТ-ДНК организованы в виде инвертированных повторов [25], у Diospyros lotus L. повторами являются три из семи [15], а у Parasponia andersonii Planch. восемь из девяти [14]. Сравнивая последовательности правого и левого плеча Т-ДНК можно понять, какие из них дивергировали сильнее. Таким образом, можно провести относительную датировку трансформационных событий (понять, какое из них произошло раньше, а какое — позже). Этот несложный анализ позволяет сделать важный вывод о том, что трансформационные события в эволюции указанных родов происходили последовательно, а не одномоментно. В случае, когда филогения рода хорошо изучена традиционными методами, можно привязать относительную датировку к временной шкале. Таким образом, было выяснено, что у табака между трансформационными событиями прошли сотни тысяч лет [25]. Поскольку неоднократные последовательные акты трансформации имели место в эволюции представителей трех неродственных родов растений, можно говорить о несостоятельности идеи о защитной функции клТ-ДНК от повторных актов трансформации. Напротив, можно предполагать, что есть виды, склонные к трансформации. Выявляя их общие особенности и привнося выявленные признаки в геномы других растений, можно в дальнейшем оптимизировать протоколы трансформации растений в лабораторных условиях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Суммируя все вышесказанное, можно подвести некоторые итоги того, что мы знаем о природных ГМО, а также выдвинуть гипотезы об эволюционной роли описанных в обзоре явлений.

Итак, горизонтальный перенос генов от агробактерий к растениям происходил и происходит с более высокой частотой, чем полагали ранее [14].

Как результат такого переноса в природе сохраняются формы с различными комбинациями интактных генов Т-ДНК, при этом другая часть генов мутирует или теряется вовсе. Если в ходе горизонтального переноса генов в геном попадает протяженная Т-ДНК, то с более высокой вероятностью отбором подхватываются формы с клТ-ДНК, организованной в виде инвертированного повтора. Вероятно, такая структура подавляет экспрессию генов Т-ДНК, что смягчает воздействие агробактериальных онкогенов на морфогенез растения. Далее в условиях частичного подавления экспрессии генов начинается отбор в пользу конкретных генных комбинаций. В каждом конкретном случае комбинация может быть своя, что согласуется с идеей Levesque о дивергенции plast-генов к разным растениям-хозяевам. Отсюда вытекает большое разно­образие природных ГМО.

У некоторых растений процесс такой трансформации может повториться неоднократно. Его результатом может оказаться приобретение новых генов, например, дополнительных опин-синтаз. Далее клТ-ДНК в составе одного генома могут эволюционировать независимо друг от друга.

В последнее время появляются все новые факты в пользу функционирования генов Т-ДНК. В перспективе можно ожидать роста количества научных статей, описывающих новые опин-синтазы, их продукты и функциональную роль в экосистемах.

Кроме того, можно спрогнозировать описание новых представителей plast-генов. Это может стать ценным материалом для выяснения базовых функций генов этого семейства.

Накопленная информация о новых природных ГМО служит ценным материалом для будущих исследований роли генов, полученных растениями от агробактерий в ходе эволюции, для исследований разнообразия штаммов агробактерий, а также для исследований функции и эволюции генов клT-ДНК в природных трансформантах.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Автор подтверждает соответствие своего авторства международным критериям ICMJE.

Источник финансирования. Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (грант № 21-14-00050).

Об авторах

Татьяна Валерьевна Матвеева

Автор, ответственный за переписку.
Email: radishlet@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-8569-6665
SPIN-код: 3877-6598
Scopus Author ID: 7006494611
ResearcherId: J-6000-2013

д-р биол. наук, профессор

Список литературы

Дополнительные файлы

Доп. файлы

Действие

1. JATS XML

Скачать

2. Рис. 1. Количество родов природных ГМО с различными по структуре клТ-ДНК (а) и типы структур протяженных клТ-ДНК (b)

Скачать (102KB)

Метаданные

3. Рис. 1. Количество родов природных ГМО с различными по структуре клТ-ДНК (а) и типы структур протяженных клТ-ДНК (b)

Скачать (101KB)

Метаданные