Высокопроизводительное секвенирование в генетике и селекции льна

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Лен (Linum usitatissimum L.) — ценная прядильная и масличная культура. В составе вида выделяют 4 разновидности: возделываемый как яровая прядильная и масличная культура лен-долгунец L. usitatissimum L. var. usitatissimum sensu Rechinger (1974), а также масличные культуры — лен-кудряш L. usitatissimum var. humile (Mill.) Pers., лен-межеумок L. usitatissimum L. var. intermedium (Czernom.) Kutuz. и лен карликовый кудряш L. usitatissimum var. nanum Kutuz. [1]. Лен возделывают на всех континентах, кроме Антарктиды. Лен-долгунец занимает четвертое место в мире по площади возделывания среди растений, выращиваемых на волокно, а типы льна кудряш и межеумок — десятое среди масличных культур [2].

Задачи льноводства в России соответствуют мировым тенденциям. Однако особое внимание уделяется созданию сортов с большей экологической пластичностью и адаптивностью к неблагоприятным условиям, а также морозоустойчивых форм культуры с пониженной фотопериодической чувствительностью [3, 4]. Для льна, высеваемого на севере России, актуальна селекция на устойчивость растений к токсичному действию ионов алюминия [5, 6].

По сравнению с другими культурами, в селекции льна использование современных методов (например, отбор при помощи ДНК-маркеров) пока затруднено ввиду недостаточной изученности селекционно значимых генов. Но поиск эффективных генетических маркеров для селекции ведется — по числу публикаций в этом направлении Россия входит в пятерку мировых лидеров, наряду с Канадой, США, Индией и Китаем (приложение 1).

При этом на масличном льне проводится примерно втрое больше подобного рода исследований, чем на льне-долгунце. Наибольшее внимание уделяют маркированию локусов, связанных с жирнокислотным составом масла, в меньшей степени — с устойчивостью, семенной продуктивностью (рис. 1.).

 

Рис. 1. Основные направления исследований льна с использованием ДНК-маркеров. Число публикаций (цифры в скобках), связанных с применением ДНК-маркеров по основным направлениям селекции льна, на основе публикаций в базе данных Scopus (www.scopus.com, дата обращения 13.09.2019) по пересечению ключевого слова «Marker» с «Fiber Flax» (лен, используемый для производства волокна) / «Linseed» (лен масличный) и с «Resistance» (устойчивость к биотическому стрессу) / «Tolerance» (устойчивость к абиотическому стрессу) / «Fiber content» (содержание волокна) / «Seed yield» (семенная продуктивность) / «Fatty acid» (жирные кислоты). * Не во всех статьях возможно определить о каком именно типе льна идет речь

 

Идентификация маркеров для диагностики аллельных вариантов генов является основой дальнейшей маркер-ориентированной селекции (marker-assisted selection, MAS), которую используют для отбора по признакам с моно- и олигогенным контролем, и способна дополнять традиционные подходы селекции, ускоряя отбор по некоторым признакам. Однако наиболее прогрессивным методом улучшения растения по таким признакам является геномное редактирование. Так, Sauer et al. (2016) использовали систему CRISPR/Cas для создания генотипа, устойчивого к гербициду глифосату [7].

Для отбора по признакам с полигенным контролем перспективным методом является геномная селекция. Это альтернативная стратегия, использующая статистические модели для предсказания, какие растения будут иметь оптимальные фенотипы на основе большого количества маркеров для индивидуального отбора [8]. У льна такой подход использован для геномной селекции на устойчивость к пасмо (Septoria linicola (Speg.) Gar.) [9].

Для выявления новых генетических маркеров для MAS или генов-мишеней для геномного редактирования, а также для геномной селекции все чаще привлекают методы, основанные на секвенировании нового поколении (next generation sequencing, NGS).

Целью настоящего обзора является анализ и систематизация данных, описывающих применение подходов, основанных на NGS, в селекционно-генетических исследованиях льна, а также оценка перспективы их дальнейшего использования в льноводстве.

СЕКВЕНИРОВАНИЕ ГЕНОМА LINUM USITATISSIMUM

Число хромосом у представителей рода Linum L. варьирует в широком диапазоне: от 2n = 16 до 2n = 72 [10]. Возделываемый вид L. usitatissimum имеет диплоидный геном 2n = 30, который, по результатам сравнительного анализа геномов различных представителей рода Linum, проходил в ходе эволюции через аллотетраплоидизацию за счет гибридизации двух предковых диплоидных видов [11–13].

Первая полногеномная физическая карта льна была представлена в 2011 г. международным коллективом под руководством канадских ученых по программе Total Utilization Flax GENomics. Для сорта CDC Bethune создали библиотеку, состоящую из 43776 BAC (Bacterial artificial chromosome) клонов, и на их основе получили 87552 BES (BAC-end sequence) последовательностей [14]. Полученная карта состояла из 416 контигов, охватывающих ~368 млн п. н., один контиг представлял хлоропластный геном [14]. Среди известных повторяющихся фракций, гены, кодирующие рибосомальную РНК, составляли ~13,8 %, а мобильные генетические элементы — 6,1 %. Функции 45,1 % последовательностей остались неизвестными [14].

Последовательность генома льна у сорта CDC Bethune была секвенирована de novo в 2012 г. методом дробовика (whole-genome shotgun, WGS) [15]. Полученные прочтения были собраны в 116 602 контига (302 млн п. н.), из которых были выделены 88 384 скаффолда общим размером 318 млн п. н., что соответствует ~81 % генома льна. На полученную последовательность генома картировали более 96 % EST (Expressed Sequence Tags) льна, полученных из базы данных Национального центра биотехнологической информации США (National Center for Biotechnology Information, NCBI). Было показано, что пятая часть генома представлена транспозонами, а доля генов микроРНК составляет менее 1 %. В основной фракции авторами было выявлено 43 484 кодирующих гена [15]. В процессе сборки выявлен 31 скаффолд, содержащий хлоропластную ДНК, однако соединить их в единую молекулу хлоропластного генома не удалось [15].

С помощью комплекса методов прямой и обратной генетики можно выявлять индивидуальную изменчивость организма и связывать ее с отличиями в проявлении хозяйственно ценных признаков. Одним из таких методов является оптическое картирование, основанное на непосредственной идентификации сайтов рестрикции в молекулах ДНК при помощи лазерной конфокальной микроскопии. Совокупный спектр полученных фрагментов ДНК служит уникальным «штрихкодом» для исходной последовательности [16]. Оптическая карта генома (BioNano genome (BNG) optical map) льна с использованием BioNano IRIS platform позволила улучшить качество сборки и пополнить последовательность генома сорта CDC Bethune, созданную на основе физической и генетической карты [13, 14, 15]. Было проведено выравнивание 211 контигов BNG (298,6 млн п. н., 94,2 %) и 622 скаффолдов (286,6 млн п. н., 94,9 %), полученных Z. Wang et al. [15]. На основе уточненных скаффолдов, полученных F.M. You et al. [13], и подтвержденной физической карты “CDC Bethune”, 211 BNG контигов были объединены в 94 суперконтига, которые затем были соотнесены с картами сцепления пятнадцати хромосом L. usitatissimum. Размер псевдомолекул составил суммарно 316 млн п. н., что позволило охватить 97 % аннотированных генов льна [13].

Секвенирование, сборку и детальный анализ пластидного генома L. usitatissimum произвела группа А. de Santana Lopes et al. [17]. Пластидный геном представил собой кольцевую молекулу ДНК размером 156 721 п. н. с типичной структурой, состоящей из четырех частей: два инвертированных повтора по 31 990 п. н., между которыми располагаются большая (large single copy, LSC) и малая (small single copy, SSC) уникальные области, включающие 81 767 п. н. и 10 974 п. н. соответственно. В геноме идентифицировано 109 уникальных генов и 2 псевдогена, и показана утрата консервативных интронов гена clpP и полной последовательности гена rps16 [17].

Таким образом, в результате проведенных многочисленными авторами исследований, полученный геном L. usitatissimum может быть использован как основа для быстрой и эффективной сборки геномов других представителей данного вида, а также близкородственных видов.

Сведения о сборке генома льна и сопутствующие данные представлены в приложении 2 .

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ NGS-СЕКВЕНИРОВАНИЯ ДЛЯ АНАЛИЗА ПОЛИМОРФИЗМА ДНК

До использования методов NGS-секвенирования для генотипирования существовало около двух десятков различных способов анализа однонуклеотидного полиморфизма (single nucleotide polymorphism, SNP), но c развитием технологий NGS у исследователей появилась возможность идентифицировать тысячи маркеров одновременно [21]. Выявленные SNP используют для оценки генетического разнообразия, картирования генов и локусов количественных признаков (quantitative trait loci, QTL) для маркер-ориентированной селекции [22–31].

Пиросеквенирование — это один из методов NGS-секвенирования, основанный на детекции освобождающихся пирофосфатов, используемый для выявления SNP [32–35]. В одной из первых таких работ изучали виды L. usitatissimum и L. bienne. С применением вычислительного программного конвейера для идентификации de novo аллельных вариантов в геноме льна было выявлено 1067 SNP на 713 контигах. Секвенирование по Сэнгеру подтвердило большинство установленных и определило дополнительные SNP, а также однонуклеотидные инсерции и делеции [36].

В 2015 г. L. Galindo-González et al. [24] показали эффективность ионного полупроводникового секвенирования (Ion Torrent sequencing) для выявления мутаций в определенных областях генома для больших популяций льна. Авторы провели скрининг 768 мутантов, полученных обработкой этилметансульфонатом, с использованием чипов. Из 29 потенциальных мутаций, выявленных после NGS-анализа, 16 были подтверждены с помощью секвенирования по Сэнгеру [24].

Развитие технологий NGS с использованием таких методов уменьшения сложности геномов, как секвенирование, связанное с рестрикционными сайтами (restriction site associated DNA sequencing, RAD-seq) [37, 38], секвенирование с уменьшенной репрезентативной библиотекой, основанное на применении эндонуклеаз рестрикции (restriction enzyme-based reduced representation library sequencing, RRL-seq) [23, 39], генотипирование путем секвенирования (Genotyping-By-Sequencing, GBS) [40] и секвенирование локус-специфичных амплифицированных фрагментов (specific locus amplified fragment sequencing, SLAF-seq) [29] позволяет обнаружить множество SNP за короткое время при низких затратах.

S. Kumar et al. [23] провели RRL-seq геномов восьми сортов льна на платформе Illumina (секвенирование синтезом за счет встраивания 3’-модифицированных нуклеотидов с присоединенными флуоресцентными метками) [23]. Было обнаружено 55 465 SNP, почти четверть из которых расположена в генах. 4863 SNP, выявленные у сортов CDC Bethune и Macbeth, были подтверждены при GBS растений из популяции рекомбинантных инбредных линий, полученных от их скрещивания. Средняя частота встречаемости полиморфных локусов составила 0,17 на 1000 п. н. [23].

Для поиска новых SNP используют также метод SLAF-seq, который позволяет снизить затраты на проведение анализа и сохранить возможность эффективного секвенирования с глубоким покрытием [27, 41–46]. SLAF-seq — это оптимизированная версия RAD-seq, специально предназначенная для крупномасштабных экспериментов по генотипированию на основе серии предварительных экспериментов [47]. Этим методом в 2017 г. L. Yi et al. [27] обнаружили 4145 SNP со средним расстоянием между ними 0,64 сМ, которые использовали для построения высоко насыщенной маркерами генетической карты [27].

Важно, что через SLAF-маркеры удается привязать QTL к конкретным скаффолдам, что служит основой для предварительных выводов о близлежащих генах или генах с плейотропным эффектом, которые влияют на хозяйственно ценные признаки льна. Так J. Wu et al. [31] построили высоконасыщенную маркерами карту в сочетании с QTL селекционно значимых признаков. По результатам исследования F2 Dianе х NY1 с использованием 2339 маркеров построена генетическая карта (1483,25 сМ), охватившая 15 групп сцепления со средним расстоянием между маркерами 0,63 сМ. Описаны 12 локусов, ассоциированных с хозяйственно ценными признаками льна (общая и техническая высота, семенная продуктивность, содержание волокна в стеблях и продуктивность по волокну) [31].

Быстрое внедрение методов высокопроизводительного генотипирования позволяет создавать несколько генетических карт для одного вида, которые объединяются в единую консенсусную карту, интегрирующую дополнительные маркеры в районы, где находится QTL [49]. Так, в 2013 г. P. Asgarinia et al. [49] при использовании 143 полиморфных маркеров SSR (simple sequence repeat) на основе анализа картирующей популяции NorMan/Linda составили карты всех 15 групп сцепления общей длиной 1241 сМ, провели QTL-анализ устойчивости к мучнистой росе и выявили локусы в группах сцепления 1, 7 и 9, ассоциированные с этими SSR-маркерами. Физическое месторасположение этих локусов в геноме было определено поиском по гомологии в базе данных полногеномного секвенирования, для чего использовали информацию о нуклеотидных последовательностях исходных для их идентификации EST- и ВАС-клонов [48, 54].

Таким образом, высокопроизводительное секвенирование может быть эффективно использовано для обнаружения большого количества маркеров, а также картирования локусов селекционно-значимых признаков льна с одновременной идентификацией не только их расположения на генетической карте, но и выявлением физического местоположения в геноме.

ПОЛНОГЕНОМНЫЙ АНАЛИЗ АССОЦИАЦИЙ (GWAS)

Традиционно картирование QTL у растений выполняют с использованием картирующих популяций [50], что имеет ряд ограничений. Наиболее критическое из них — отсутствие аллельного разнообразия, так как популяция происходит от двух родителей, и генетическая изменчивость ограничена родительскими линиями. В последние годы для выявления генов-кандидатов, связанных с селекционно значимыми признаками растений, активно используют полногеномный анализ ассоциаций (genome-wide association studies, GWAS) [51–53]. Данный метод, требующий использования заведомо большого количества маркеров и применяемый для анализа широкого спектра генотипов, открывает новые возможности для расшифровки молекулярно-генетических механизмов, контролирующих сложные полигенные признаки. Успех метода сильно зависит от генетической структуры анализируемой выборки, от количества и распределения молекулярных маркеров [54]. GWAS стал более доступным благодаря данным полногеномного секвенирования и создания на его основе подходов к высопроизводительному генотипированию.

В последние несколько лет GWAS стал неотъемлемым методом и для выявления новых хозяйственно ценных генов льна [55–58]. Эта работа начата сравнительно недавно, и большинство исследований были в первую очередь направлены на идентификацию локусов, определяющих качество получаемого растительного сырья.

GWAS на основе SLAF-seq является хорошо разработанной технологией для идентификации аллелей, что доказали D. Xie et al. [56, 57], воспользовавшись сочетанием этих методов при генотипировании 224 сортов льна. Секвенирование позволило идентифицировать 584 987 SNP, со средней частотой встречаемости 1 на 1,2 тыс. п. н.

С использованием статистических моделей EMMAX (efficient mixed-model association eXpedited), GLM (generalized linear model) и MLM (multilevel modeling) получены данные и исследованы районы локализации значимых маркеров и SNP-локусов, ассоциированных с масличностью, высотой растения, числом ветвей и коробочек, массой 1000 семян, что позволило выявить гены-кандидаты, контролирующие эти признаки [56, 57] (приложение 3).

Важно, что GWAS может быть дополнен поиском в геноме следов положительного отбора (например, GW3S (genome-wide selective sweep scan)), что выражается в снижении частоты нуклеотидных вариаций в участках, граничащих с новой полезной мутацией [60].

F. You et al. [59] описали выявленные с помощью GWAS, дополненного GW3S, участки генов, связанные с продуктивностью и качественным составом масла льна. В работе были изучены и проанализированы с использованием GBS 260 линий, принадлежавших к трем разным двуродительским картирующим популяциям. Было идентифицировано более 500 тыс. SNP. Основываясь на результатах проведенного анализа, авторы выявили 33 QTL для важных хозяйственно ценных признаков льна. Из них 7 связали со сроками созревания, 5 — с высотой растения, а остальные — с жирнокислотным составом масла [59].

В 2018 г. B. Soto-Cerda et al. [55] выявили локусы, влияющие на количество слизи и семенной кожуры семян льна сортов канадской коллекции. Уменьшение этих показателей является желательным для повышения кормовой ценности семян для животноводства. Были идентифицированы 7 локусов, ассоциированных с содержанием слизи в семенах. Определены четыре локуса, связанных с низкой долей фракции семенных оболочек [55] (приложение 3).

GWAS также актуален для анализа устойчивости льна к патогенам и факторам абиотического стресса, имеющим сложный полигенный контроль. Так, L. He et al. [58] провели GWAS для 370 образцов льна канадской коллекции по результатам пятилетних полевых исследований устойчивости к пасмо. В результате GBS было выявлено 258 873 SNP, распределенных по всем 15 хромосомам льна. На основании ортологии с генами A. thaliana выявлено два гена-кандидата устойчивости льна к этому патогену [58].

Используя GWAS и данные пятилетних полевых наблюдений, L. He et al. [9] провели поиск локусов, ассоциированных с устойчивостью льна к S. linicola. На коллекции 370 образцов в качестве обучающей и тестовой популяции ими была создана высокоэффективная модель предсказания генетической устойчивости льна к данному патогену с точностью прогнозирования 0,92, что является наиболее точным среди всех моделей геномных предсказаний для устойчивости к болезням растений [9].

Таким образом, работы по GWAS на льне указывают на необходимость использования нескольких статистических моделей при идентификации локусов, что способствует поиску генетических маркеров, для дальнейшего использования в селекционных программах.

ПУТИ К ГЕНОМНОЙ СЕЛЕКЦИИ

Геномная селекция — это метод, позволяющий преодолеть ограничения MAS для количественных признаков. Цель GS состоит в определении генетического потенциал изучаемого объекта вместо определения конкретного QTL [61].

У льна было предпринято несколько попыток использования геномной селекции. Так, в 2016 г. F.M. You et al. [62] с использованием GS провели отбор образцов исходя из их селекционной значимости, предсказанной статистической моделью, основанной на взаимосвязи между фенотипами и генетическими маркерами. Для семенной продуктивности, содержания масла в семенах, иодного числа и содержания линолевой и линоленовой кислот в каждой из трех изученных родительских популяций была проведена оценка точности прогноза и эффективности геномной селекции относительно фенотипического отбора на основе трех прогностических моделей: RR-BLUP (random regression best linear unbiased prediction), BL (Bayesian LASSO) и BRR (Bayesian ridge regression) [62]. Несмотря на то что эмпирические результаты показали, что геномная селекция может повысить урожайность льна в процессе селекции, необходимы дальнейшие исследования для создания оптимальных обучающих популяций и наборов маркеров для применения GS в льноводстве [62].

Таким образом, массовое использование GS еще затруднено, поскольку суммарные затраты на анализ на порядок выше, чем на MAS. Однако с развитием технологий и расширением геномных ресурсов ожидается более широкое применение геномной селекции.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ВЫСОКОПРОИЗВОДИТЕЛЬНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ ДЛЯ РЕШЕНИЯ ВОПРОСОВ ФИЛОГЕНИИ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА LINUM

Технологии высокопроизводительного секвенирования стали перспективным подходом для анализа немодельных объектов с обнаружением филогенетических взаимосвязей [63]. Среди основных методов выделяют RAD-seq, GBS, реже применяют полногеномное секвенирование [40, 64–66]. Иными словами, филогенетическая реконструкция оперирует данными о SNP, которые теперь технически возможно получить из любых геномов любых видов за короткое время при низких затратах [67, 68].

В исследовании Y.-B. Fu et al. [26] геномная ДНК из 18 образцов льна, принадлежащих к 16 видам четырех секций, была секвенирована с использованием платформы Illumina. В исследовании были выявлены 6143 SNP в хлоропластной, 2673 в митохондриальной и 19 562 в ядерной ДНК. Филогенетические деревья, построенные на основании анализа ядерных, пластидных и митохондриальных маркеров, отражающие дивергенцию четырех секций рода Linum, совпадают по топологии. Это демонстрирует наличие конгруэнтных филогенетических связей четырех секций внутри рода Linum. Также были представлены три главные ветви, выявляющие две основные эволюционные стадии, приведшие в итоге к появлению возделываемого льна (L. usitatissimum). Этот вид и его предок (L. angustifolium) сформировались как обособленная ветвь, генетически более тесно связанная с L. decumbens и L. grandiflorum [26].

Высокопроизводительное секвенирование семейств генов мультикопийной рРНК позволило внести дополнения в филогению голубоцветкового льна, а также выявить внутри- и межвидовую дивергенцию последовательностей генов рРНК. На основе данных секвенирования N.L. Bolsheva et al. [12] разделили представителей секции Linum на 4 ветви: первая — диплоиды L. decumbens и L. grandiflorum; вторая — тетраплоиды L. narbonense; третья — тетраплоид L. usitatissimum и его дикорастущий предок L. angustifolium; четвертая — полиплоидный вид L. marginale. Предполагают, что L. usitatissimum и L. angustifolium могли возникнуть в результате гибридизации двух диплоидных видов (2n = 16), возможных прародителей современных видов L. gandiflorum и L. decumbens, или гибридизации предков L. narbonense с 2n = 14 и диплоидного вида с 2n = 16 [12].

Изменчивость по морфологии, размеру и количеству хромосом в кариотипах определяется набором повторяющихся последовательностей, сравнительное исследование которых в геноме льна провели N.L. Bolsheva et al. [69]. На основе результатов полногеномного секвенирования с низким покрытием для 12 видов льна, принадлежащих к шести секциям, был проведен биоинформатический анализ, который установил, что геномы отличались количеством повторяющихся фракций, однако их наборы были схожи у всех видов [69]. Ретротранспозоны семейства Ty3/Gypsy представляли собой бо́льшую часть повторяющихся последовательностей у всех проанализированных видов. Образование форм голубоцветкового льна в эволюции сопровождалось волнами увеличения количества тандемных повторов (сателлитной ДНК) и ретротранспозонов с длинными концевыми повторами (long terminal repeats, LTR). Наименьшее число диспергированных повторов и наибольшее содержание сателлитных ДНК в геномах льна из секции Linum, вероятно, являются результатом аллотетраплоидного происхождения растений из этой группы [69].

Таким образом, методами высокопроизводительного секвенирования выявлены новые детали эволюции представителей рода Linum, которые можно использовать в исследовании геномов и филогенетических взаимоотношений внутри этой группы растений.

ТРАНСКРИПТОМНЫЙ АНАЛИЗ

Доступ к обновленной и дополненной последовательности генома льна [13] позволит сделать селекцию более эффективной. Но одного лишь изучения генома льна недостаточно. Требуются обширные данные транскриптомики, протеомики и метаболомики, поскольку только комбинация всех омиксных данных позволит понять важные физиологические и молекулярные механизмы, уникальные для данного растения. Метод высокопроизводительного секвенирования РНК (RNA-seq) эффективно используют для анализа транскриптомов и обнаружения генов, участвующих в формировании селекционно-значимых признаков, особое внимание уделяют устойчивости к факторам биотического и абиотического стресса [70–72]. Идентификация дифференциально экспрессирующихся генов (ДЭГ) в настоящее время позволяет лучше понять механизмы, лежащие в основе формирования изучаемых признаков, однако технологии секвенирования транскриптома еще не в полной мере используют для изучения льна [73].

Основной идеей транскриптомного эксперимента на растениях является сравнение экспрессии генов в двух контрастных условиях, например в оптимальных и при неблагоприятном воздействии среды. Особо эффективно сравнение в разных условиях набора генотипов — устойчивых и неустойчивых к изучаемому виду стресса. Идентификация среди ДЭГ новых генов устойчивости позволит разработать новые диагностические маркеры для ускорения отбора в процессе селекции.

Среди абиотических стрессов неблагоприятный состав почвы является одним из основных факторов, ограничивающих площади возделывания льна. Неудивительно, что одним из первых исследований, проведенных в этом направлении на льне, считается изучение транскриптома растения в условиях защелачивания и засоления почвы методом RNA-seq, где были проанализированы паттерны экспрессии пяти категорий генов, включая транскрипционные факторы, сигнальные белки трансдукции, фитогормоны, ферменты антиоксидантной защиты и молекулярные транспортеры. Среди ДЭГ были выявлены гены, относящиеся к ключевым регуляторным семействам, вовлеченным в ответ на абиотический стресс, таким как WRKY, MAPKKK (mitogen-activated protein kinase kinase), ABA (abscisic acid), PrxR (NADH-peroxiredoxin reductase) и гены, кодирующие белки, входящие в состав ионных каналов [74].

В поисках генов, связанных с осмотическим стрессом у льна, J. Wu et al. [73] провели секвенирование транскриптома проростков, выращенных при нормальных условиях и при стрессовом воздействии, вызванном полиэтиленгликолем 6000. Авторами были аннотированы 2533 гена, из которых 239 определены как ДЭГ. Значительное число генов было отнесено к семействам, кодирующим транскрипционные факторы, такие как NAC (nascent polypeptide-associated complex), LEA (late embryogenesis–abundant), WRKY, ERF (ethylene responsive factors) и bZIP (basic-leucine zipper) [73].

В 2019 г. J. Wu et al. [75] применили высокопроизводительное секвенирование РНК для изучения транскриптома и обнаружения генов солеустойчивости льна. Из 2582 коэкспрессирующихся генов 2482 были аннотированы. Показано, что основные механизмы солеустойчивости льна ассоциированы с гормональной системой, белками светособирающих комплексов и биосинтезом аминокислот [75].

Геном льна высокопластичен, поэтому у некоторых образцов при дисбалансе питательных веществ в почве происходят наследуемые в нескольких поколениях генетические изменения. Такие генотипы называют генотрофами [76]. A.A. Dmitriev et al. [6] при помощи транскриптомного анализа выявили ДЭГ льна при выращивании в условиях несбалансированности элементов питания по сравнению с оптимальными условиями. На основе данных высокопроизводительного секвенирования авторы выбрали 17 генов для дальнейшего анализа методом количественной ПЦР на расширенной выборке образцов. В условиях избыточного питания выявлено изменение экспрессии генов, кодирующих белки семейства WRKY. В условиях недостатка фосфатов изменялась экспрессия генов, кодирующих белки семейства JAZ (jasmonate ZIM-domain), HARBI1 (harbinger transposase-derived nuclease) и ING1 (inhibitor of growth 1) [6].

В 2016 г. A.A. Dmitriev et al. [77] для изучения устойчивости льна к токсичным свойствам алюминия секвенировали 16 транскриптомов четырех образцов льна (двух устойчивых и двух чувствительных к действию алюминия). На основании полученных данных высокопроизводительного секвенирования обнаружены гены с дифференциальной экспрессией, большинство продуктов которых имели транспортную функцию. Значительное повышение экспрессии генов глутатион-S-трансферазы и UDP-гликозилтрансферазы позволило авторам выдвинуть предположение, что именно эти гены участвуют в защитных механизмах у растений, связанных с устойчивостью к токсичному действию алюминия посредством утилизации активных форм кислорода и модификации клеточной стенки [77] (приложение 3). Позже, A.V. Zyablitsin et al. [78] установили, что в корнях проростков льна экспрессируются три транскрипт-варианта гена САХ3. Данные количественной ПЦР хорошо согласуются с данными, полученными в результате высокопроизводительного секвенирования тех же образцов растений. Таким образом CAX3-Ca²⁺/H⁺-антипортер может участвовать в реакции льна на высокую кислотность почвы и высокую концентрацию алюминия в почве посредством Ca²⁺-опосредованной внутриклеточной регуляции [78] (приложение 3).

Также A.A. Dmitriev et al. [79] с помощью транскриптомного анализа изучили реакцию сортов льна на пониженную кислотность и недостаток цинка. У изучаемых сортов льна, выращенных при рН 5,5, выявлены более значительное ингибирование роста и изменения экспрессии генов по сравнению с контрольной группой и группой, выращенной в условиях дефицита цинка. Выявленные авторами ДЭГ участвуют в различных процессах, включая ионный транспорт, биогенез клеточной стенки, активность оксидоредуктаз и фотосинтез, и могут играть важную роль в реакции льна на изученные стрессы [79].

Немаловажным является изучение устойчивости растений льна к биотическим стрессам. В 2016 г. L. Galindo-González et al. [80] одними из первых применили транскриптомный анализ для изучения механизмов устойчивости к Fusarium oxysporum. Умеренно устойчивый к фузариозному увяданию сорт CDC Bethune использовали для полного исследования транскриптома методом RNA-seq. Результаты во многом подтвердили известные механизмы реакции льна на патоген и дополнили существующие данные, что позволило авторам построить обновленную и наиболее полную модель устойчивости льна к F. oxysporum [80] (приложение 3).

Реакцию на заражение устойчивых к фузариозному увяданию гибридов льна изучали A.A. Dmitriev et al. [81]. Для идентификации генов-кандидатов устойчивости к фузариозу у культуры поиск вели по генам с повышенной или пониженной экспрессией в устойчивых (по сравнению с восприимчивыми) сортах и популяциях при инфицировании. Среди ДЭГ особое внимание было уделено генам, кодирующим белки SRG (salt response protein), UDP-гликозилтрансферазу, АТФазы, связанные с разнообразными клеточными активностями (AAA-ATPase), глюкан-эндо-1,3-бета-глюкозидазу, факторы транскрипции MYB, дегидрины и ауксин-чувствительный белок SAUR. Авторы предположили, что идентифицированные гены со специфически индуцированной экспрессией в ответ на заражение F. oxysporum у устойчивых сортов и популяций являются наиболее перспективными генами-кандидатами устойчивости [81].

Еще одно направление в области транскриптомики растений связано с изучением молекулярно-генетических механизмов онтогенеза, для чего проводят сравнение транскрипции генов в разных частях растений и на разных стадиях дифференцировки. Такие исследования помогают понять известные и выявлять новые молекулярно-генетические механизмы эволюционных и онтогенетических изменений, а также идентифицировать потенциальные гены-мишени для направленного мутагенеза с целью изменения типа роста и развития, ускорения цветения, созревания и т. д.

RNA-seq использовали для сравнения транскриптов в двух сегментах вегетативного побега 14-дневного растения льна, у которого были удалены все листья [82]. Выявленные различия в экспрессии между апикальной областью побега и большей частью стебля будут дополнять другие подходы (например, скрининг мутантов), направленные на изучение первичной дифференцировки волокон флоэмы [82].

В 2017 г. N. Mokshina et al. [83] исследовали экспрессию генов комплекса целлюлозосинтазы у льна (LusCESA) на разных стадиях развития и в процессе гравитропической реакции растения с помощью RNA-seq и количественной ПЦР. Гравистимуляция растений временно увеличивала количество транскриптов целлюлозосинтазного комплекса. Таким образом, волокна внутренней (третичной) клеточной стенки имеют специфический механизм биосинтеза целлюлозы и особенности его регуляции [83].

Используя данные транскриптомного анализа, S.M. Shivaraj et al. [84] изучили гены интегральных мембранных белков, в большинстве представленных аквапоринами. Анализ данных RNA-seq и микрочипов льна показал высокую экспрессию белков плазматической мембраны во множественных тканях, низкую экспрессию интегральных нодулин-26-подобных белков и специфическую для семян экспрессию 17 интегральных белков тонопласта. Столь масштабный анализ этих белков позволил лучше понять их физиологические функции и роль в развитии льна [84].

P.K. Dash et al. [85] осуществили сборку транскриптома умеренно устойчивого к засухе индийского сорта льна T-397. Полученные данные помогут идентифицировать локусы и создать маркеры SSR для селекции на засухоустойчивость [85].

Для интрузивно растущих волокон, полученных методом лазерной микродиссекции, T. Gorshkova et al. [86] провели RNA-seq первичной флоэмы льна. Так как изменения в уровнях мРНК отдельных генов напрямую не связаны с синтезом белка и, особенно, с активностью фермента, использовано профилирование транскриптома в качестве высокоинформативного подхода для выявления метаболических путей и белков, играющих ключевую роль при интрузивном росте клеток. Выявлено, что удлинение клеток сопряжено с активацией фотосинтеза и интенсивной экспрессией локализованных в хлоропластах шаперонинов и тиоредоксинов. Также установлено, что высокая доля специфически активированных генов кодирует экспансины, ферменты для модификации пектинов и несколько белков, локализованных в клеточной стенке [86].

Имеющиеся данные об исследовании транскриптома льна представлены в базах данных NCBI Sequence Read Archive [88], NCBI Gene Expression Omnibus [73, 82, 85, 86, 88].

Следует отметить, что в области транскриптомики льна больше работ по изучению его устойчивости к абиотическим факторам, чем к биотическим. Вероятно, это связано с селекционными программами и целевыми характеристиками растений для конкретного региона. Но все это оставляет возможность для дальнейших перспективных исследований ДЭГ при разных видах стресса, а также в процессе онтогенеза. В конечном счете, совокупность данных транскриптомного анализа позволит предоставить справочную карту для обнаружения дополнительных генов устойчивости, полезных для использования в программах по MAS льна или для его улучшения при помощи генетического редактирования.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДОВ ВЫСОКОПРОИЗВОДИТЕЛЬНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ В ИССЛЕДОВАНИИ микроРНК

МикроРНК (miRNA) — это класс малых некодирующих РНК, обнаруженных у различных организмов, включая растения. Они состоят примерно из 20–24 нуклеотидов и могут контролировать многочисленные биологические процессы посредством негативной регуляции экспрессии генов путем специфического связывания и ингибирования мРНК-мишеней [89]. Уровень микроРНК изменяется в условиях стресса, вызванного такими факторами, как засуха, гипоксия, холод, засоленные почвы, наличие тяжелых металлов и высокий или низкий уровень питательных веществ [90–95].

Для изучения микроРНК в растениях часто используют высокопроизводительное секвенирование. N.V. Melnikova et al. [93] идентифицировали 96 консервативных гомологов микроРНК из 21 семейства, 12 из которых были впервые обнаружены. Самое распространенное семейство miR165/166 у льна, которое, по предположению авторов, активно участвует в регуляции экспрессии генов, играет роль в координации метаболизма растения во время стресса, а также в специализации растительных тканей. Экспрессия 7 микроРНК (miR168, miR169, miR395, miR398, miR399, miR408 и lus-miR-N1) в условиях дефицита питательных веществ на основании данных высокопроизводительного секвенирования была оценена на расширенном числе образцов с использованием ПЦР в реальном времени. В условиях дефицита фосфата отмечено изменение экспрессии lus-miR-N1 и miR399. Выявили отрицательную корреляцию экспрессии lus-miR-N1 и его прогнозируемой мишени, гена убиквитин-активирующего фермента E1, а также miR399 и его прогнозируемой мишени — гена убиквитин-конъюгирующего фермента E2 [93, 96].

В ответ на стресс, вызванный токсическим действием ионов алюминия у льна, A.A. Dmitriev et al. [95] отметили изменение экспрессии miR319, miR390 и miR393. Возможно, они играют важную роль в стрессовых реакциях растения посредством регуляции процессов их роста [95].

Y. Yu et al. в 2016 г. [94] исследовали профиль микроРНК льна в условиях повышенного содержания солей и щелочей в почве с использованием высокопроизводительного секвенирования. Были идентифицированы 124 известных микроРНК, принадлежащих к 23 консервативным семействам, и 394 новых микроРНК. После оценки профилей дифференциальной экспрессии были отобраны 17 известных lus-miRNA и 36 новых lus-miRNA, которые использовали для прогнозирования генов-мишеней. Параллельный анализ концевых прочтений РНК и профилирование транскриптома показали изменения в экспрессии 29 пар микроРНК при изучаемых стрессовых условиях. Выдвинуто предположение, что ген-мишень miR398, кодирующий супероксиддисмутазу, и miR530, мишенью которой являются транскрипционные факторы семейства WRK, могут играть значительную роль в стрессоустойчивости льнов [94].

Данные по микроРНК льна депонируются в базе данных miRBase. Ресурс содержит репозиторий, в котором представлены в том числе и последовательности 124 микроРНК L. usitatissimum [97]. Для них приведены первичная и вторичная структуры, локализация в геноме льна сборки v1.0.

Исходя из опубликованных данных, наибольший интерес представляет изучение устойчивости к абиотическим факторам. Очевидно, что исследование микроРНК и их функций у льна все еще находится на начальных этапах, и ряд ключевых вопросов остается без ответа. Накопление знаний о механизмах микроРНК-регуляции у растений позволит разработать искусственные микроРНК для использования в качестве эффективных инструментов для контроля экспрессии генов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Использование современных подходов, дополняющих методы традиционной селекции, способствует более эффективному созданию сортов льна с улучшенными свойствами (рис. 2.). Разработка новых генетических маркеров для селекции и выявления новых генов-мишеней для генетического редактирования, несомненно, будет содействовать расширению работ, основанных на применении методов высокопроизводительного секвенирования в количественной генетике, транскриптомике льна. Получаемые в этом направлении результаты также представляют фундаментальный интерес, ведущий к пониманию особенностей филогении рода Linum, эволюции геномов представителей этого рода, механизмов, лежащих в основе онтогенетического развития растения и фенотипической изменчивости, а также разнообразия реакций на различные стимулы окружающей среды.

 

Рис. 2. Схематическое представление современных селекционных подходов, основанных на использовании комбинирования подходов для маркер-ориентированной и геномной селекции. SNP — single nucleotide polymorphism (однонуклеотидный полиморфизм), DArT — diversity arrays technology (ДНК-чип технология для изучения разнообразия), GBS — Genotyping by Sequencing (генотипирование путем секвенирования), AFLP — аmplified fragment length polymorphism (полиморфизм длины амплифицированных фрагментов), SSR — simple sequence repeat (однонуклеотидный полиморфизм), RAPD — random amplification of polymorphic DNA (случайно амплифицированная полиморфная ДНК), RFLP — restriction fragment length polymorphism (полиморфизм длины рестрикционных фрагментов), QTL — quantitative trait loci (локус количественных признаков), GWAS — genome-wide association studies (полногеномный анализ ассоциаций)

 

Благодарности

Данный обзор был проведен в рамках государственного задания по теме № 0481-2019-0001.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Приложения:

Приложение 1

Использование ДНК-маркеров льна в исследованиях в разных странах. Составлено на основе поиска публикаций в базе данных Scopus (www.scopus.com, дата обращения 01.02.2019) по пересечению ключевых слов «Marker» и «Linum»

Приложение 2

Электронные ресурсы, содержащие данные полногеномного секвенирования льна

Результаты секвенирования и сборки генома, а также последние данные о сборке псевдомолекул L. usitatissimum, доступны в базе нуклеотидных последовательностей NCBI GenBank под идентификатором GenomeProject #68161 [18]. Номера доступа от CP027619 до CP027633 для каждой из 15 хромосом. Секвенированные последовательности, полученные на основе фосмидных и BAC-библиотек, были представлены в GenBank под номерами HQ902252, JN133299-JN133301 и JX174444-JX174449.

Последовательность аннотированного генома и информация о кодирующих генах также доступны в базе данных Phytozome [13, 15, 19]. Характеристики сборки: общая длина собранных последовательностей ~318,3 млн п. н., количество скаффолдов — 88 420, количество контигов — 11 0390. Аннотированный геном содержит 43 471 гена и 43 484 транскрипта. Кроме того, в базе представлены EST из NCBI GenBank, картированные на геном при помощи PASA (the program to assembly spliced alignments) [15].

Некоторые данные о геномах видов льна можно найти в Европейском архиве нуклеотидных последовательностей (ENA) [20]. Например, здесь представлены необработанные парные прочтения, полученные в результате секвенирования методом shotgun таких диких видов льна, как L. leonii (SRR1592650), L. lewissii (SRR1592654), L. perenne (SRR1592548), L. narbonense (SRR1592545), L. grandiflorum (SRR1592647), L. decumbens (SRR1592610) и L. angustifolium (SRR1592607).

 

Приложение 3

Гены-кандидаты, ассоциированные с хозяйственно ценными признаками льна

Признак	Ген-кандидат, ассоциированный с признаком	Кодируемый продукт	Интерпретация ассоциации	Использованный метод	Литературная ссылка
Содержание пальмитиновой кислоты	PIP5K (Lus10022606) (PHOSPHATIDYLINOSITOL-4-PHOSPHATE 5-KINASE)	Фосфатидилинозитол-4-фосфат-5-киназа	PIP5K участвует в метаболизме инозитолфосфата, в результате гидролиза которого образуются предшественники пальмитиновой кислоты	GWAS	[56]
Высота растения	ABC (Lus10016125) (ATP-BINDING CASSETTE) UGT (UDP-GLYCOSYLTRANSFERASE) PL (PECTATE LYASE)	ATP-связывающие кассетные транспортеры UDP-гликозилтрансфераза Пектатлиаза	Обеспечивают транспорт липидов, сахаров, аминокислот и др., таким образом играют важную роль в развитии и росте растений. Избыточная экспрессия UGT84B1 и UGT74E2 у арабдопсиса приводит к образованию короткого стебля с большим количеством ветвей. Влияет на развитие растения, участвуя в метаболизме ауксина. У риса и арабидопсиса ген PL тесно связан с ростом и развитием растений за счет регуляции скорости деления клеток и участия модификации клеточной стенки	GWAS GWAS GWAS	[56] [57] [57]
Содержание волокна	Lus10016354	Ксантоксиндегидро-геназа	Участвует в синтезе абсцизовой кислоты (АБК). Ранее сообщалось о влиянии АБК на снижение синтеза гемицеллюлозы и целлюлозы.	GWAS	[56]
Содержание стеариновой кислоты	Lus10021171	Протеинфосфатаза	У льна с пониженной экспрессией гена наблюдается повышенное содержание стеариновой кислоты	GWAS, RNA-seq	[56]
Масса 1000 семян	PHO1 (PHOSPHATE PERMEASE)	Фосфатпермеаза	Участвует в передаче фосфора от корней к надземным частям растений. Увеличение потребляемого фосфора увеличивает размер семян	GWAS	[56]
Ветвистость стебля растения	GRAS (GIBBERELLIC ACID INSENSITIVE + REPRESSOR OF GA1-3 + SCAREСROW) XTH (XYLOGLUCAN ENDOTRANSGLUCOSYLASE / HYDROLASE)	Транскрипционные факторы семейства GRAS (GIBBERELLIC ACID INSENSITIVE + REPRESSOR OF GA1-3 + SCAREСROW) Ксилоглюкан эндотрансглюкозилаза/ гидролаза	Играют ключевую роль в развитии и передаче сигналов. LS и MOC1 — члены семейства белков GRAS. Отсутствие экспрессии гена LS ингибирует образование пазушной меристемы и уменьшает количество пазушных почек. Отсутствие экспрессии гена MOC1 приводит к почти полному отсутствию кущения у риса (O. sativa), так как продукт гена участвует регуляции клеточного цикла. У A. thaliana ген XTH9 экспрессируется в апикальной меристеме цветочных почек и цветоножек и связан с удлинением этих частей растения; уменьшение экспрессии приводит к короткой длине междоузлия	GWAS GWAS	[57] [57]
Содержание слизи в семени	GATL5 (Lus10009311) (GALACTUROSYL TRANSFERASE-LIKE 5) MUM4 (Lus10009288) (MUCILAGE-MODIFIED 4) PME36 (Lus10009287) (PECTIN METHYLESTERASE 36) SBT1.7 (Lus10009313, Lus10007083) (SUBTILISIN-LIKE SERINE PROTEASE) TT8 (Lus10007101) (TRANSPARENT TESTA 8)	Белок, подобный галактозилтрансферазе 5 UDP-L-рамнозсинтаза Метилэстераза пектина 36 Субтилизинподобная сериновая протеаза Семейство транскрипционных факторов TT	Участвует в синтезе остова рамногалактуронана I. Необходим для производства рамнозы — ключевого субстрата для биосинтеза слизи. Участвует в синтезе пектина и модификациях клеточной стенки. Запускает активацию ферментов, модифицирующих клеточную стенку для выделения слизи. Наряду с транскрипционным фактором GLABRA2 (GL2) регулирует экспрессию гена MUM4	GWAS GWAS GWAS GWAS GWAS	[55] [55] [55] [55] [55]
Содержание семенной кожуры	AGL62 (Lus10035456) (AGAMOUS-LIKE MADS-BOX PROTEIN) GH17 (Lus10018306) (GLYCOSYL HYDROLASE FAMILY 17) UGT79B1 (Lus10026926) (UDP-GLUCOSE FLAVONOL 3-O-GLU-COSYLTRANSFERASE)	Семейство транскрипционных факторов AGL Гликозилгидролаза 17 UDP-глюкоза: флавоноид 3-О-глюкозилтрансфераза	Мутанты по AGL62 могут инициировать образование зародыша и эндосперма, но не в состоянии сформировать семенную оболочку. Экспрессируется совместно с TT12, AHA10 и BAN, которые могут модифицировать гликозилированные флаван-3-ол мономеры, что приводит к накоплению проантоцианидинов в оболочке семян. Ключевой фермент, катализирует конечную стадию биосинтеза антоцианинов	GWAS GWAS GWAS	[55] [55] [55]
Устойчивость к высокой кислотности почвы	CAX3 (CA2+/H+-EXCHANGER)	Ca2+/H+-антипортер	Участвует в регуляции роста растений и усвоения питательных веществ, а также в регуляции транспорта фосфатов. CAX3 находится в тонопласте. CAX3 мутанты A. thaliana чувствительны к стрессу, вызванному повышенной соленостью и кислотностью. CAX1 и CAX3 участвуют в регуляции pH в апопласте	RNA-seq	[78]
Устойчивость к токсичному действию алюминия	GST (GLUTATHIONE S-TRANSFERASE) CAX3 (CA2+/H+-EXC) UGT (UDP-GLYCOSYLTRANSFERASE)	Глутатион-S-трансфераза Ca2+/H+-антипортер UDP-гликозилтрансфераза	Участвует в реакции на стресс, включая окислительный, и может действовать как глутатион-зависимая пероксидаза. Воздействие алюминия на растения в условиях пониженного pH приводит к образованию активных форм кислорода и перекисному окислению липидов. В ответ на повышенное содержание алюминия увеличивается экспрессия гена GST как у устойчивых, так и у чувствительных к токсичному действию этого вещества у кукурузы, арабидопсиса и др. Наблюдалось повышение экспрессии гена GST у льна при Al-стрессе, особенно у устойчивых сортов. Выявлена повышенная регуляция гена CAX3 у льна, толерантного к алюминию. Активация гена CAX3 способствует компартментализации Ca2 + в вакуоли. Это может быть механизмом, обеспечивающим устойчивость льна к стрессу, вызванному повышенными концентрациями алюминия. Участвуют в биосинтезе вторичных метаболитов, гормональном гомеостазе, детоксикации ксенобиотиков и в реакции растений на стресс. Изменения в экспрессии UGT при воздействии повышенных концентраций алюминия наблюдались на рисе, кукурузе, льне и других культурах. Участвуют в биосинтезе лигнанов и детоксикации клеток от вторичных метаболитов реактивных форм кислорода, что может быть механизмом устойчивости льна к Al-стрессу	RNA-seq RNA-seq RNA-seq	[77] [78] [77]
Устойчивость к Fusarium oxysporum	WRKY3, WRKY70, WRKY75 MYB113, MYB108	Транскрипционные факторы семейства WRKY Транскрипционные факторы семейства MYB	Сверхэкспрессия этих генов у A. thaliana наблюдается при биотическом стрессе. Транскрипция ортологов WRKY75, усиливается у Brassica napus после заражения Sclerotinia sclerotiorum и Alternaria brassicae. Ранее показано, что у A. thaliana MYB113 индуцируется при инокуляции F.oxysporum и имеет решающее значение для производства антоцианов, которые включают специфические стадии метаболизма фенилпропаноидов	RNA-seq RNA-seq	[80] [80]
Устойчивость к Fusarium oxysporum	ERF1, ERF14 (ETHYLENE RESPONSE FACTOR) CYP79B2, CYP79B3 (CYTOCHROME P450) PRX52 (PEROXIDASE 52) CHS (CHALCONE SYNTHASE) DFR (DIHYDROFLAVONOL REDUCTASE) RIPK (RPMI-INDUCED PROTEIN KINASE)	Семейство транскрипционных факторов, отвечающих на этилен Цитохром P450 Пероксидаза Халконсинтаза Дигидрофлаванол редуктаза Протеинкиназа ин-дуцируемая RPM-1	Наблюдается повышенная экспрессия генов из семейства ERF у зараженных растений. При инокуляции растений Fusarium наблюдалась активация генов ERF. Ген ERF1, вероятно, является одним из наиболее важных генов, участвующих в защите растений от грибковых патогенов, и связан с устойчивостью арабидопсиса к F. oxysporum sp. conglutinans и F. oxysporum sp. lycopersici. CYP450 способствует превращению триптофана в индол-3-ацетальдоксим (предшественник индол-3-уксусной кислоты — ауксина). Активация пула ауксина имеет решающее значение для прорастания и роста растений, что в свою очередь так же может сказать на защите от патогенов. Участвует в образовании лигнина. Наблюдали усиление экспрессии гена более чем в 40 раз при инфицировании арабидопсиса Verticillium longisporum. Ключевой фермент биосинтеза флавоноидов, которые обладают высокой антиоксидантной способностью. Это используется для создания форм с повышенной устойчивости к F. oxysporum и F. culmorum посредством конструирования трансгенного льна с мультиконструкцией, включающей халконсинтазу (CHS), халконизомеразу (CHI) и дигидрофлавонол редуктазу (DFR) петунии. Один из ключевых ферментов синтеза антоцианов. Используется, как и CHS. Ген является ортологом гена A. thaliana ATG05940, который кодирует протеинкиназу, активирующую эффекторный иммунитет	RNA-seq RNA-seq RNA-seq RNA-seq RNA-seq RNA-seq	[80] [80] [80] [80] [80] [80]

Об авторах

Алёна Олеговна Ахметшина

ФГБНУ «ФИЦ Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова»

Автор, ответственный за переписку.
Email: akhmetshinaalena@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-2346-7258
SPIN-код: 3947-2772

младший научный сотрудник, лаборатория постгеномных исследований

Россия, Санкт-Петербург

Ксения Владимировна Стрыгина

ФГБНУ «ФИЦ Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова»

Email: k.strygina@vir.nw.ru
ORCID iD: 0000-0001-6938-1348

канд. биол. наук, старший научный сотрудник, лаборатория постгеномных исследований

Россия, Санкт-Петербург

Елена Константиновна Хлесткина

ФГБНУ «ФИЦ Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова»

Email: director@vir.nw.ru
ORCID iD: 0000-0002-8470-8254
SPIN-код: 3061-1429
Scopus Author ID: 6603368411
ResearcherId: T-2734-2017

профессор, д-р биол. наук, врио директора ВИР, заведующая лабораторией постгеномных исследований

Россия, Санкт-Петербург

Елизавета Алекандровна Пороховинова

ФГБНУ «ФИЦ Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова»

Email: e.porohovinova@vir.nw.ru
ORCID iD: 0000-0002-8328-9684
SPIN-код: 5033-3263
Scopus Author ID: 22986519000
ResearcherId: S-6756-2016

канд. биол. наук, старший научный сотрудник, отдел ГР масличных и прядильных культур

Россия, Санкт-Петербург

Нина Борисовна Брач

ФГБНУ «ФИЦ Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова»

Email: n.brutch@vir.nw.ru
ORCID iD: 0000-0003-2253-6263
SPIN-код: 1753-4382
Scopus Author ID: 26665888600

д-р биол. наук, ведущий научный сотрудник, отдел ГР масличных и прядильных культур

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы