SEARCHING FOR NEW FACTORS WHICH INFLUENCE TRANSLATION TERMINATION IN YEASTSACCHAROMYCES CEREVISIAE

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Изучение путей регуляции различных клеточных процессов является ключевым направлением современной молекулярной биологии. Для поиска белковых факторов-регуляторов, оказывающих прямое или опосредованное влияние на работу других белков, в настоящее время используются различные подходы. Терминация трансляции является заключительным этапом биосинтеза белка. Ключевым моментом при терминации трансляции является попадание стоп-кодона мРНК в А-участок рибосомы, в результате чего происходит гидролиз связи между тРНК и полипептидом и освобождение белка. Белковыми компонентами данного процесса являются факторы терминации I и II класса. Факторы терминации трансляции I класса узнают стоп-кодон в А-участке рибосомы. К ним относятся RF1 и RF2 у прокариот, а также eRF1 у эукариот. Факторы терминации II класса, к которым относятся RF3 у прокариот и eRF3 у эукариот, при участии ГТФ активизируют процесс терминации трансляции (см. обзоры: Inge-Vechtomov et al., 2003; Kisselev et al., 2003). Фактор eRF1 распознает любой из трех стоп-кодонов (UAA, UAG или UGA) при его попадании в А-сайт рибосомы, что приводит к гидролизу связи пептидил-тРНК (Frolova et al., 1994). Фактор eRF3 является ГТФазой и стимулирует активность фактора eRF1, таким образом обеспечивая высвобождение новосинтезированной полипептидной цепи с рибосомы (Zhouravleva et al., 1995; Frolova et al., 1996). Для осуществления процесса терминации трансляции необходимо взаимодействие белков eRF1 и eRF3 (Stansfield et al., 1995; Zhouravleva et al., 1995). У дрожжей Saccharomyces сerevisiae фактор терминации трансляции eRF1 кодируется геном SUP45 (Himmelfarb et al., 1985; Breining et al., 1986), а фактор eRF3 — геном SUP35 (Kushnirov et al., 1988). Несмотря на то, что SUP35 и SUP45 являются жизненно важными для клетки, была показана возможность возникновения нонсенс-мутаций в этих генах (Stansfield et al., 1996; Moskalenko et al., 2003; Chabelskaya et al., 2004). Такие мутации, не являясь летальными, приводят к нарушению терминации трансляции. За последние несколько лет значительный прогресс произошел в области изучения неканонических функций белков eRF1 и eRF3. Использование биохимических, генетических и молекулярно-биологических методов позволило идентифицировать ряд белков, взаимодействующих с факторами терминации трансляции. Посредством таких взаимодействий возможна координация терминации трансляции с другими клеточными процессами. Высокий уровень сходства аминокислотных последовательностей как eRF1, так и eRF3, в различных систематических группах эукариот предполагает сходство механизмов терминации трансляции. Целью данной работы является поиск новых факторов, влияющих на процесс терминации трансляции у дрожжей S. cerevisiae. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Штаммы. В работе использовали штамм дрожжей S. сerevisiae 31B-D1656 (МАTα ade1–14 trp1–289 ura3–52 leu2–3,112 sup45–105 [pRS316/SUP45]), штамм 1B-D1606 (МАТα ade1–14 his7–1 lys9-A21 А trp1–289 ura3–52 leu2–3,112) и его производные, содержащие нонсенс-мутантные аллели sup45–104, sup45–105 и sup45–107, а также штамм 1A-D1628 (MATa ade1–14 his3 lys2 trp1–289 ura3–52 leu2–3, 112 SUP45:: HIS3 [pRS315/SUP45]) (Moskalenko et al., 2003). Аллели ade1–14, his7–1, lys9-A21 и trp1–289 несут нонсенс-мутации UGA, UAA, UAA и UAG соответственно. В работе использовали штаммы Escherichia сoli DH5α и С600 (Sambrook et al., 1989). Плазмиды. Использовали центромерную плазмиду pRS316/SUP45, содержащую фрагмент дрожжевой ДНК с полноразмерным аллелем гена SUP45 под контролем собственного промотора (Moskalenko et al., 2003), и мультикопийный вектор рRS425 (Sikorski et al., 1989). В работе был использован коммерческий банк генов дрожжей S. сerevisiae в мультикопийном векторе YEp13 (American Type Culture Collection, ATCC № 37323; http://www.lgcstandards-atcc.org). Банк состоял из набора плазмид, несущих фрагменты геномной ДНК дрожжей (5–20 т. п. н.), полученные при обработке генома рестриктазой Sau3AI и клонированные в вектор YEp13 по сайту рестрикции BamHI. Также была использованы плазмида YGPM15l11 из коммерческого банка дрожжевых генов Yeast Genomic Tiling Collection YSC № 4613, созданного на основе мультикопийного вектора pGP564. Среды и условия культивирования. В работе использовали стандартные культуральные среды, применяемые при работе с дрожжами: полную среду (YAPD), минимальную среду (MD), синтетическую среду (SC) и селективные среды, не содержащие отдельных компонентов среды (Guthrie and Fink, 1991). Для отбора трансформантов, потерявших плазмиду pRS316 c маркером URA3 использовали среду с 5-фтороротовой кислотой («Sigma», 5-FOA) в концентрации 1 г/л. Бактерии растили на полной среде (LB). Бактериальные трансформанты, содержащие плазмиду YEp13, несущую участок геномной ДНК, выявляли с использованием минимальной среды (М9) (Maniatis et al., 1982). Устойчивые к ампициллину трансформанты отбирали на средах LB и М9, содержащих ампициллин в концентрации 100 мкг/мл. Штаммы дрожжей выращивали при температуре 26 °С, штаммы бактерий — при 37 °С. Использованы стандартные генетические и молекулярные методы работы с дрожжами-сахаромицетами (Sherman et al., 1986; Rose et al., 1990). Высокоэффективную трансформацию дрожжей и выделение плазмидной ДНК из дрожжей проводили согласно ранее описанным методикам (Kaiser et al., 1994; Gietz et al., 1995). Секвенирование концевых областей вставок в векторе YEp13 проводили в Центре методов молекулярной систематики животных ЗИН РАН «Таксон» на секвенаторе ABI PRISM с применением набора ABI PRISM BigDye Terminator v3.1 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit. Cодержание белка. Получение клеточных лизатов, электорофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия и вестерн-гибридизацию с поликлональными антителами к eRF1 и моноклональными антителами T6074 к тубулину («Sigma») проводили согласно методике Moskalenko et al. (2003). Фотопленку сканировали и количественно оценивали интенсивность сигнала в программном пакете TotalLab. РЕЗУЛЬТАТЫ Идентификация гена ECM23, как влияющего на жизнеспособность мутаций sup45 Для поиска факторов, изменяющих жизнеспособность нонсенс-мутантов по гену SUP45, штамм 31B-D1656, несущий нонсенс-мутацию sup45–105 в хромосоме и центромерную плазмиду pRS316/SUP45, трансформировали банком генов дрожжей в мультикопийном векторе YEp13. В ходе скрининга банка, детально описанного ранее (Murina et al., 2010), было идентифицировано шесть трансформантов, у которых наблюдалось уменьшение частоты потери плазмиды pRS316/SUP45 по сравнению с контролем. У части проанализированных трансформантов наблюдался нестабильный характер роста на среде с 5-FOA даже после нескольких проверок и повторной трансформации штамма 31В-D1656 [pRS316/SUP45] плазмидами, изолированными из дрожжевого банка генов. В связи с этим для дальнейшей работы были выбраны обладающие стабильным фенотипом трансформанты, содержащие плазмиду 14-Yep13. В плазмиде 14-Yep13 идентифицирован ген EСM23 и ген RAD1, у которого отсутствует 5’-концевая часть открытой рамки считывания. Продуктом гена RAD1 является эндонуклеаза, специфичная к одноцепочечной ДНК, и участвующая в процессах репарации и рекомбинации в клетке (Schiestl et al., 1988). Точная функция продукта гена EСM23 неизвестна. Предполагают, что белок Ecm23p является негативным регулятором псевдогифального роста дрожжей (Canizarez et al., 2002). Также сообщается, что он может быть вовлечен в процесс биосинтеза клеточной стенки (Lussier et al., 1997). Данные о связи гена EСM23 с процессом терминации трансляции отсутствуют. Поэтому было решено изучить влияние сверхэкспрессии этого гена на частоту потери плазмиды pRS316/SUP45 у штамма 31В-D1656 и жизнеспособность нонсенс-мутантов по гену SUP45. Оценка влияния сверхэкспрессии гена ECM23 на частоту потери потери плазмиды pRS316/SUP45 у штамма 31В-D1656 Для анализа влияния сверхэкспрессии гена EСM23 на частоту потери плазмиды pRS316/SUP45 у штамма 31В-D1656 была использована мультикопийная плазмида pRS425/ECM23. Для оценки влияния данного гена на характер роста трансформантов на среде с 5-FOA также была использована центромерная плазмида pRS315/ECM23. Штамм 31В-D1656 [pRS316/SUP45] трансформировали плазмидами pRS315/ECM23 или pRS425/ECM23. Затем у трансформантов оценивали частоту потери плазмиды pRS316/SUP45 по характеру роста на среде с 5-FOA без лейцина (рис. 1). Контролем являлся штамм 31В-D1656 [pRS316/SUP45], трансформированный вектором pRS315 или pRS425. У трансформантов штамма 31В-D1656, содержащих плазмиду pRS425/ECM23, наблюдалось снижение частоты потери плазмиды pRS316/SUP45 по сравнению с контролем. Таким образом, сверхэкспрессия гена ECM23 снижает частоту потери плазмиды pRS316/SUP45, также как и в случае мультикопийной плазмиды 14-Yep13, несущей данный ген. Можно предполагать, что влияние плазмиды 14-Yep13 на характер роста трансформантов на среде с 5-FOA обусловлено присутствием в ней именно гена ECM23. Также была проведена дополнительная проверка влияния участков геномной дрожжевой ДНК, содержащих исследуемые гены, на частоту потери плазмиды с геном SUP45 дикого типа. Для этого было использован коммерческий банк дрожжевых генов Yeast Genomic Tiling Collection, созданный на основе мультикопийного вектора pGP564 (см. Материалы и методы). Бактериальные трансформанты, содержащие плазмиды из коммерческого банка дрожжевых генов, были отсеяны из –70 °C на среду LB с добавлением канамицина, а затем из них была выделена плазмидная ДНК, по два трансформанта для каждой из анализируемых плазмид. Далее штамм 31B-D1656 трансформировали выделенными плазмидами. Трансформантов отбирали на среде SC-Ura-Leu. Затем трансформантов перепечатывали на среду с 5-FOA и оценивали влияние плазмид, изолированных из банка, на частоту потери плазмиды pRS316/SUP45. В качестве контроля были использованы трансформанты, несущие вектор pGP564. Были подтверждены данные о том, что сверхэкспрессия гена ECM23 снижает частоту потери плазмиды pRS316/SUP45 (рис. 2) Анализ влияния дизрупции гена ECM23 на частоту потери плазмиды pRS316/SUP45 на фоне мутантной аллели sup45–105 Согласно нашему предположению, у трансформантов штамма 31B-D1656, содержащих плазмиду pRS425/ECM23, для которых наблюдается уменьшение частоты потери плазмиды pRS316/SUP45, происходит снижение жизнеспособности. В связи с этим, вероятно, что дизрупция генов ECM23 будет приводить к повышению частоты потери плазмиды pRS316/SUP45 на фоне мутантной аллели sup45–105 и увеличению жизнеспособности штаммов. Для проверки данного предположения были использованы штаммы 21А-D1670, содержащий дизрупцию генов SUP45 и ECM23, и 17С-D1670, несущий дизрупцию гена SUP45. Все штаммы содержали плазмиду pRS316/SUP45 для поддержания жизнеспособности. Эти штаммы трансформировали центромерной плазмидой pRS315/sup45–105. Затем у трансформантов оценивали частоту потери плазмиды pRS316/SUP45 по характеру роста на среде с 5-FOA без лейцина (рис. 3). Отличий в характере роста трансформантов выявлено не было. Таким образом, частота потери плазмиды pRS316/SUP45 на фоне дизрупции гена ECM23 не изменяется по сравнению с контролем. Влияние гена ECM23 на фенотипическое проявление мутаций sup45-n Для анализа влияния гена ECM23, находящегося на плазмиде pRS425/ECM23, на уровень нонсенс-супрессии использовали штаммы 102–1B-D1606; 104–1B-D1606; 105–1B-D1606; 107–1B-D1606, несущие нонсенс мутации sup45. Также фенотипический анализ был проведен у штамма 1B-D1606, несущего ген SUP45 дикого типа. Штаммы трансформировали плазмидой pRS425/ECM23. В качестве контроля использовались трансформанты, несущие вектор pRS425. Сегрегантов отбирали на селективной среде SC–Leu и далее перепечатывали на серию селективных сред для оценки уровня нонсенс-супрессии. Также проводили оценку характера роста трансформантов на средах YAPD, YAPD в 37 °C и СПГ. При анализе характера роста трансформантов выяснилось, что трансформанты штамма, несущего ген SUP45 дикого типа, и штаммов, несущих нонсенс-мутации sup45–104 и sup45–105 (штаммы 1B-D1606, 104–1B-D1606 и 105–1B-D1606 соответственно), демонстрируют сходный с контролем характер роста на всех средах независимо от присутствия плазмиды pRS425/ECM23 (данные не представлены). Трансформанты, несущие нонсенс-мутации sup45–102 и sup45–107 и плазмиду pRS425/ECM23 (штаммы 102–1B-D1606 и 107–1B-D1606 соответственно), характеризуются ослабленным по сравнению с контролем ростом на селективной среде SC-HisLeu (рис. 4). Также трансформанты демонстрируют термочувствительный фенотип и дыхательную некомпетентность, характерные для нонсенс-мутантов по гену SUP45 (данные не представлены). Было отмечено снижение уровня супрессии мутации his7–1 при сверхэкспрессии гена ECM23 у штаммов, несущих нонсенс-мутации sup45–102 и sup45–107. Ген ECM23 не влияет на содержание белка eRF1 у штаммов, несущих ген SUP45 дикого типа или нонсенс-мутантные аллели sup45–104 и sup45–105. Согласно нашему предположению штаммы, несущие плазмиду pRS425/ECM23, характеризуются сниженной жизнеспособностью. Одним из возможных объяснений может быть снижение количество полноразмерного белка eRF1 в клетке. Для анализа количества белка использовался штамм 1B-D1606, несущий ген SUP45 дикого типа и штаммы 104–1B-D1606 и 105–1B-D1606, несущие нонсенс-мутантные аллели sup45–104 и sup45–105. Штаммы трансформировали плазмидой pRS425/ECM23. В качестве контроля использовали трансформантов, несущих плазмиды pRS425 и pRS315. Сегрегантов отбирали на селективной среде SC–Leu. Для оценки количества белка eRF1 был применен стандартный метод иммуноблотинга с использованием поликлональных антител против белка eRF1 (рис. 5). В результате проведенного анализа было отмечено снижение количества полноразмерной формы белка eRF1 у нонсенс-мутантов по отношению к штамму с геном SUP45 дикого типа, что уже было показано ранее (Moskalenko et al., 2003) Различий в количестве белка между штаммами, трансформированными плазмидой pRS425/ECM23 и контролем, обнаружено не было. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ В данной работе мы выявили, что сверхэкспрессия гена ECM23 снижает частоту потери плазмиды с геном SUP45 на фоне аллели sup45–105. В настоящее время точная функция Ecm23p, также известного как Srd2p, не определена. Первоначально, ген ECM23 был идентифицирован при поиске генов, участвующих в процессе морфогенеза клеточной стенки дрожжей S. cerevisiae (Lussier et al., 1997). Также было обнаружено, что белок Ecm23p обладает достаточно высоким уровнем сходства с белком Srd1p в С-концевой области. Точная функция Srd1p не известна, однако показано, белок Srd1p S. cerevisiae участвует в процессинге пре-рРНК (Fabian et al., 1990). Мутации в гене SRD1 супрессируют мутацию rrp1–1, которая приводит к чувствительности к повышенной температуре и нарушению в процессе созревания 27S пре-рРНК до 25S и 5.8S рРНК. В то же время мутации в SRD1 не могут супрессировать делецию гена rrp1. Белок Srd1p содержит ДНК-связывающий мотив «цинковые пальцы», что позволяет отнести его к транскрипционным факторам. Однако было показано, что Srd1p не является транскрипционным регулятором гена RRP1 (Hess et al., 1994). Авторы предполагают, что Srd1p может регулировать экспрессию генов, участвующих в процессинге рРНК, например генов, кодирующих белки, которые взаимодействует с Rrp1p. Присутствие мотива «цинковые пальцы» характерно не только для белков, связывающихся с ДНК. Известно, что фактор инициации трансляции eIF2-β тоже содержит данный мотив, с помощью которого он, по-видимому, взаимодействуют с мРНК (Donahue et al., 1988; Laurino et al., 1999). В связи с этим, существует гипотеза, что Srd1p регулирует экспрессию гена RRP1 на уровне трансляции (Hess et al., 1994). Также, вероятно, что Srd1p может связываться с пре-рРНК и стимулировать ее процессинг. Сходство Ecm23p с Srd1p и другими белками, содержащими мотив «цинковые пальцы», позволяет предположить регуляторную функцию белка Ecm23p в клетке. Показано, что Ecm23p является негативным регулятором псевдогифального роста дрожжей, однако неизвестно каким образом осуществляется данная регуляция (Canizarez et al., 2002). В нашей работе выявлено, что сверхэкспрессия гена ECM23 снижает частоту потери плазмиды pRS316/SUP45 на фоне аллели sup45–105, и, по-видимому, жизнеспособность мутантного штамма. Мы предполагаем, что снижение частоты потери плазмиды pRS316/SUP45 связано с увеличением эффективности терминации трансляции в клетке. В частности, наши данные об антисупрессорном эффекте сверхэкспрессии гена ECM23, по крайней мере в отношении стоп-кодона UGA, согласуются с этой гипотезой. Отсутствие антисупрессорного эффекта в случае стоп-кодонов UAG и UAA может быть связано с нуклеотидным окружением данных стоп-кодонов в аллелях trp 1–289, his7–1 и lys9-A21, которое, как известно, имеет большое значение в процессе узнавания терминирующего сигнала (см. обзор Bertram et al., 2001). Возможно, что Ecm23p участвует в регуляции генов, кодирующих компоненты аппарата трансляции, и таким образом влияет на эффективность данного процесса. Мы не обнаружили влияния дизрупции гена ECM23 на частоту потери плазмиды pRS316/SUP45 на фоне мутантной аллели sup45–105. Вероятно, что в клетке присутствуют белки со схожими функциями, которые компенсируют отсутствие продуктов данных генов. Дизрупция гена ECM23, возможно, компенсируется геном SRD1, который кодирует Srd1p, имеющий сходство с белком Ecm23p в С-концевой области (Lussier et al., 1997). Согласно нашему предположению, трансформанты, несущие плазмиду pRS425/ECM23, характеризуются сниженной жизнеспособностью. В связи с этим мы предполагали, что у таких трансформантов может быть снижено количество полноразмерного белка eRF1 в клетке. Однако нам не удалось обнаружить влияния дополнительной экспрессии гена ECM23 на количество белка eRF1. Известно, что мутации в генах SUP45 и SUP35 S. сerevisiae обладают рядом плейотропных эффектов, таких как нарушения сегрегации хромосом в митозе, нарушения клеточного цикла, изменения цитоскелета (см. обзор von der Haar et al., 2007). Показано, что, например, eRF1 может взаимодействовать с белком легкой цепи миозина Mlc1p и участвовать в процессе цитокенеза (Valouev et al., 2004). В связи с этим считают, что у факторов терминации могут быть дополнительные функции в клетке помимо терминации трансляции. В настоящее время связь Ecm23p с фактором терминации eRF1 не изучена. Возможно, что eRF1 способен к взаимодействию с Ecm23p напрямую или опосредованно через другие белки для выполнения дополнительных функций вне процесса терминации трансляции. Однако данный вопрос нуждается в дальнейшем исследовании.

About the authors

Svetlana Yevgenyevna Moskalenko

St. Petersburg Branch Vavilov Institute of General Genetics (RAS)

Email: smoskalenko@mail.ru
Ph. D., Senior Researcher, Assoc. Prof. Dept. of Genetics and Biotechnology

Olga Anatolyevna Murina

St.-Petersurg State University

Email: olga_murina@rambler.ru
student, Dept. of Genetics and Biotechnology

Olga Leonidovna Askinazi

St.-Petersurg State University

student, Dept. of Genetics and Biotechnology

Galina Anatolyevna Zhuravleva

St.-Petersurg State University

Email: zhouravleva@rambler.ru
Ph.D., Professor of the Dept. of Genetics and Biotechnology

References

Supplementary files