Molecular phylogenetic analysis of the tonoplast H+-ATPase subunits

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Вакуолярная H+-АТФаза (V-АТФаза) растительных клеток представляет собой основной потенциал-генерирующий фермент, локализованный на тонопласте и обеспечивающий движущую силу, заключающуюся в протонном градиенте, для транспорта различных ионов и метаболитов в вакуоль. Накоплен ряд данных, указывающих на универсальность организации и функционирования V-АТФаз у эукариотических клеток (Finbow, Harrison, 1997), а также их сходство с АТФ-синтазами (F-АТФазами) митохондрий и хлоропластов (Ratajczak, 2000). Эти ферментные комплексы используют способ ротационного взаимопревращения энергии макроэргической связи и энергии протонного градиента (Song et al., 2013). Нарушение работы этого фермента зачастую приводит к смерти организма или к появлению серьезных аномалий развития. Однако при всей функциональной значимости работы вакуолярной протонной помпы закономерности ее сборки (соподчинение субъединиц и изменение изоферментного состава), а также способы регуляции ее активности практически не изучены. Согласно современным представлениям, вакуолярная H+-АТФаза состоит из двух доменов: периферического (V1) и интегрального мембранного (V0). Домен V1 осуществляет гидролиз АТФ, а V0 выполняет функцию транспорта протонов (Beyenbach, Wieczorek, 2006; Martinoia et al., 2007). Субъединицы домена V1 Домен V1 представляет собой структуру «головки на стержне» и включает в себя восемь субъединиц: A, B, C, D, E, F, G и H. Молекулярная масса (ММ) субъединицы А составляет от 68,5 до 68,8 кДа у разных видов растений. Она содержит нуклеотид-связывающий сайт. При связывании аналогов аденина - 7-хлоро-4-нитробензо-2-оксо-1,3-диазола (Randall, Sze, 1987), флуоресцеин-5’-изотиоцианата (Tzeng et al., 1992) или N-этилмалеимида (Randall, Sze, 1987; Wang, Sze, 1985) с субъединицей А происходит ингибирование гидролиза АТФ, что доказывает ее каталитическую функцию. Молекулярная масса субъединицы В - от 53,7 до 54,7 кДа. Субъединица В также содержит нуклеотид-связывающий сайт. Однако связывание фотоактивированного АТФ-аналога 3-О-(4-бензоил)бензоиладенозин-5 Р-трифосфата не подавляет гидролиз АТФ (Manolson et al., 1985), что указывает на то, что субъединица В является субстрат-связывающей, но не каталитической. Предполагается, что она осуществляет регуляторную функцию. Остальные субъединицы V1-комплекса образуют два стержня разного типа - центральный (D- и F-субъединицы) и периферический (C-, E-, G- и H-субъединицы), которые соединяют домены V1 и V0 (Cipriano et al., 2008). Субъединица С, входящая в состав периферического стержня, имеет ММ 37-52 кДа (Ratajczak, 2000). Она играет ключевую роль в обратимой сборке V-АТФазы и в осуществлении сопряжения работы V1 и V0 (Hong-Hermesdorf et al., 2006). В структуре субъединицы С выделяют три домена - глобулярный «Head», удлиненную «шейку» и глобулярный «foot»-домен. «Head»-домен связывается с комплексом V1, а два других - с V0. Показано, что субъединица С вакуолярной Н+-АТФазы арабидопсиса имеет сайт связывания адениновых нуклеотидов, в результате чего происходят изменения в ее структуре (Armbrüster et al., 2005). Субъединица D с ММ 29,1 кДа входит в состав центрального стержня, соединяющего домен V0 с головкой домена V1, и принимает участие в сопряжении гидролиза АТФ и транспорта протонов (Ratajczak, 2000). Субъединица Е входит в состав периферического стержня фермента, который участвует в стабилизации связи V1-комплекса с заякоренным в мембране доменом V0 (Strompen et al., 2005, Dettmer et al., 2010). Субъединица F (ММ 13 кДа) является частью центрального стержня и играет важную роль в сопряжении гидролиза АТФ и транспорта протонов. Предположительно эта субъединица подвергается конформационным изменениям в ходе катализа (Basak et al., 2011). Субъединица G (ММ 12,2 кДа) является частью периферического стержня V1, отвечающего за сопряжение процессов гидролиза АТФ и транспорта протонов (Ratajczak, 2000). Полипептид, который представляет собой G-субъединицу вакуолярной Н+-АТФазы Avena sativa, остается при домене V0 после диссоциации V1 (Ward, Sze, 1992). Это указывает на тесный контакт субъединицы G с мембранным интегральным доменом фермента. В составе V-АТФазы субъединица G присутствует в форме гомодимера. Субъединица Н требуется для связывания домена V1 с V0 (периферический стержень), а также для активации V-АТФазы (Kluge et al., 2003). Субъединицы домена Vо Vо-домен V-АТФаз включает в себя до шести субъединиц: a, c, c′, c′′, d и e (Gaxiola et al., 2007). Однако у растений в геноме не были обнаружены гены, кодирующие субъединицу c′, а в тонопластном протеоме не обнаружены субъединицы c′′ и е, что указывает на отсутствие этих субъединиц в составе вакуолярной H+-АТФазы (Schumacher, Krebs, 2010). Предполагается, что субъединицы c′′ и е принимают участие в сборке и, возможно, в определении локализации фермента (эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи), а не в транспорте протонов (Seidel et al., 2008). Субъединица а трансмембранного домена (ММ 95 кДа) взаимодействует своим цитозольным участком с субъединицей А периферического домена и с периферическим стержнем фермента (Padmanaban et al., 2004). Это самая крупная субъединица ферментного комплекса, принимающая участие как в формировании периферического стержня, так и в транспорте протонов (Hanitzsch et al., 2007). Основным компонентом Vо-домена тонопластной протонной АТФазы, непосредственно вовлеченным в транспорт протонов, является субъединица с. Она представляет собой гидрофобный белок, содержащий четыре трансмембранных домена (Lai et al., 1991). В составе фермента шесть с-субъединиц, образующих кольцо, вращение которого ответственно за процесс перемещения протонов (Hirata et al., 2003). Субъединица d - единственная гидрофильная субъединица интегрального домена. Она является частью центрального стержня V-АТФазы и важна для ротационного механизма фермента. Для Vigna radiata было продемонстрировано, что комплекс Vо в отсутствие субъединицы d представляет собой пассивный протонный канал (Ouyang et al., 2008). Гены, кодирующие вакуолярную H+-АТФазу, идентифицированы во всех растительных геномах, которые были секвенированы к настоящему времени. Все субъединицы, идентифицированные в геноме дрожжей, кроме субъединицы c′ обнаружены у растений, причем многие из них кодируются небольшими семействами генов. Суммарное количество генов субъединиц протонной АТФазы тонопласта составляет от 14 у Chlamydomonas до 54 у сои. В геноме Arabidopsis thaliana обнаружено как минимум 26 генов, кодирующих субъединицы вакуолярной протонной АТФазы (Sze et al., 2002) (табл 1, 2). Кодирование небольшими семействами позволяет предположить родо- или даже видоспецифичную специализацию изоформ субъединиц V-АТФазы (Schumacher, Krebs, 2010). Активность вакуолярной Н+-АТФазы регулируется многими факторами окружающей среды, поэтому V-АТФазу высших растений называют «эко-ферментом» (Lüttge et al., 2001). Для фермента показана возможность модуляции активности посредством изменения количества ферментных комплексов в составе тонопласта, а также изменения его субъединичного состава. Имеется ряд данных об изменении экспрессии генов, кодирующих субъединицы фермента, и о посттрансляционных модификациях. Для Suaeda salsa, галофита из семейства Chenopodiaceae, было показано, что основной стратегией устойчивости к солевому стрессу у данного вида является увеличение количества ферментных комплексов, а не изменения их структуры (Wang et al., 2001). При повышении солености и индукции САМ-метаболизма у Mesembryanthemum crystallinum наблюдали ряд изменений V-АТФазы: 1) количество и активность фермента повышались (Bremberger, Lüttge, 1992; Ratajczak et al., 1994); 2) соотношение транспорта протонов и гидролиза АТФ уменьшалось (Ratajczak, 2000); 3) увеличивался диаметр V0-домена (Klink, Lüttge, 1992; Rockel et al., 1994), что сопровождалось возрастанием количества с-субъединиц и количества их мРНК (Rockel et al., 1998); 4) в стержне появлялись две новые субъединицы, которые являются продуктом модификации субъединицы В специфической протеазой или активными формами кислорода (Zhigang et al., 1996; Krisch et al., 2000); 5) V1-домен на электронных микрофотографиях представлял собой как гексамерную, так и пентамерную структуру (Kramer et al., 1995), т. е. не всегда число субъединиц А и В было кратным трем. Представляется интересным то, что при засолении у Citrus происходит протеолитическое разрушение субъединицы А, а у M. сrystallinum - субъединицы В. Приведенные выше данные могут служить доказательством многообразия регуляторных механизмов, имеющихся у растений, в том числе путем изменения субъединичного состава ферментного комплекса. Наряду с этим, посттрансляционная регуляция может осуществляться и рядом других способов. Так, для Н+-АТФаз V-типа дрожжей, насекомых и млекопитающих характерен еще один механизм регуляции активности - обратимая диссоциация доменов V1 и V0 (Toei et al., 2010). У дрожжей этот процесс происходит при истощении запасов глюкозы в среде, а у насекомых во время линьки для поддержания количества АТФ в клетке. У млекопитающих диссоциация доменов V-АТФазы происходит в клетках почечного эпителия в ответ на изменения уровня глюкозы, однако физиологическое значение этого явления представляется менее понятным. Диссоциация происходит быстро, обратимо и не требует синтеза белков. Активность разделенных периферического и интегрального доменов блокируется. Диссоциированный V1-домен не гидролизует АТФ, а свободный V0-домен не осуществляет пассивного переноса протонов через мембрану (Jefferies, Forgac, 2008). При добавлении в среду глюкозы происходит сборка фермента. Диссоциация и сборка комплекса V-АТФазы не являются прямым отражением друг друга. Так, для диссоциации требуется участие сети микротрубочек, а для сборки - гетеротримерный белковый комплекс RAVE, стабилизирующий свободный V1-комплекс в форме, пригодной для объединения с V0. Роль в модуляции стабильности V1V0-комплекса может играть субъединица С, выступающая в качестве сенсора глюкозы (Beyenbach, Wieczorek, 2006). В контроле диссоциации V-АТФазы при понижении количества глюкозы в среде принимает участие экстраклеточный уровень рН: при щелочных значениях рН диссоциации не происходит даже при низком уровне глюкозы, так как в этих условиях приоритетным процессом становится поддержание работы Н+-АТФазы для осуществления закисления вакуоли (Diakov, Kane, 2010). Сравнительно недавно такой способ регуляции, посредством обратимой диссоциации, был показан и для растений (Schnitzer et al., 2011). Тем самым данный процесс представляется универсальным и наиболее эволюционно древним. В связи с очень сложными способами организации комплекса и его регуляции, а также в связи с наличием различных изоформ субъединиц, которые могут обладать не только ткане-, но и видоспецифичностью, возникает вопрос: каким образом сформировалось многообразие изоформ и насколько они изменчивы? Существуют ли общие закономерности эволюционных преобразований субъединиц, характерные для V1- и Vo-комплексов? Для ответа на поставленные вопросы в данном исследовании впервые проведен молекулярно-филогенетический анализ аминокислотных последовательностей различных субъединиц вакуолярной Н+-АТФазы. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Поиск аминокислотных последовательностей cубъединиц H+-АТФазы тонопласта в базе данных GenBank (GenBank 13.07.2015) проводили с помощью алгоритма blastp (BLAST 10.12.2015; Madden, 2002). Преимущественно были использованы аннотированные последовательности из геномных проектов (известные и смоделированные последовательности белков), а также несколько последовательностей, полученных путем клонирования и секвенирования генов, кодирующих различные субъединицы H+-АТФазы тонопласта. Отбирались только полные белковые последовательности, содержащие в своем составе характерные для данного белка домены pfam и мотивы для связывания субстратов. В некоторых случаях последовательности белков проверялись с помощью ресурса по белкам UniProt (The UniProt Consortium, 2015) и ресурса по геномам растений Phytozome 10.3 (Goodstein et al., 2012). Виды выбирались из разных групп цветковых растений (злаков, астерид и розид), чтобы результаты отражали эволюцию субъединиц у цветковых растений. Зеленая водоросль Chlamydamonas reinhardtii была использована как внешняя группа при филогенетических построениях. Список проанализированных последовательностей представлен в таблице 3. Аминокислотные последовательности выравнивались c помощью алгоритма MUSCLE на сайте Европейского института биоинформатики (EMBL-EBI 10.12.2015), после чего выравнивания проверялись «вручную». Для анализа последовательностей, подбора оптимальных эволюционных моделей по критериям BIC (информационный критерий Байеса) и AIC (информационный критерий Акаике), построения дерева методом объединения соседей (NJ) использовали программу MEGA 6 (Tamura et al., 2013). Филогенетические деревья методами объединения соседей строили на основе аминокислотных р-расстояний и эволюционных расстояний JTT (Jones et al., 1992). Для пропущенных данных и делеций была выбрана опция partial deletion coverage cutoff 95 %. В качестве показателя устойчивости дерева использовали бутстреп-индексы, рассчитанные на основе 500 повторностей. Филогенетические деревья методами максимального правдоподобия (ML) строили с использованием оптимальной эволюционной модели согласно критерию BIC. Метод максимального правдоподобия был реализован в пакете PhyML (Guindon, Gascuel, 2003) через графический интерфейс программы Unipro UGENE 1.19 (Okonechnikov et al., 2012). Для статистической оценки ветвей деревьев, построенных методом максимального правдоподобия, использовали непараметрический тест SH-aLRT (Anisimova, Gascuel, 2008). Байесовский анализ проводили с помощью программы MrBayes 3.1 (Huelsenbeck, Ronquist, 2001). Оптимальную эволюционную модель определяли по вкладу модели в распределение апостериорной вероятности. Для каждой субъединицы в программе запускали два независимых анализа MCMC со следующими условиями: 500 000 генераций, 50 000 отбрасываемых начальных генераций (burn-in), 4 цепи (одна холодная и три горячих), гамма-распределение с четырьмя категориями (G). Трассировочные файлы, сгенерированные в ходе MCMC, анализировались с помощью программы Tracer 1.16 (Rambaut et al., 2014). Для статистической оценки ветвей деревьев, построенных методом Байеса, использовали оценку апостериорной вероятности. Для графической работы с филогенетическими деревьями использовали программу FigTree v. 1.4.2 (FigTree 10.12.2015). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Результаты. Характеристика выравнивания аминокислотных последовательностей Для реконструкции филогении субъединиц белкового комплекса Н+-АТФазы тонопласта нами были выбраны восемнадцать видов из разных групп цветковых растений. Эти виды представляли два класса цветковых: двудольные и однодольные. Из двудольных были выбраны представители нескольких семейств из групп астерид и розид. В настоящее время филогенетические отношения между этими группами хорошо известны (Angiosperm Phylogeny Webcite 10.12.2015), и мы можем сопоставить с ними построенные в нашей работе филогенетические деревья белковых субъединиц. Некоторые субъединицы были проанализированы по меньшему числу видов, так как несколько последовательностей были отбракованы из-за ненадлежащего качества. У большинства видов было обнаружено несколько изоформ каждой из субъединиц. Число изоформ варьирует в зависимости от вида и от конкретной белковой субъединицы. Больше всего изоформ отмечается для субъединицы a трансмембранного комплекса V0. У этой же субъединицы мы обнаружили самое большое число полиморфных сайтов: 63,2 %, из которых 90 % парсимонично информативны. Также высокое число полиморфных сайтов наблюдается у субъединиц C и D периферического домена V1, самое низкое число - у субъединицы с интегрального домена (табл. 4). Таким образом, мы можем разделить исследованные субъединицы на две группы: с высоким уровнем полиморфизма (C, D, a) и низким (A, B, c, d). Похожую картину можно наблюдать по межаминокислотным р-расстояниям: наибольшие значения у a и D, самые маленькие у B и c. Результаты подбора эволюционных моделей представлены в таблице 4. В число оптимальных вошло три семейства моделей: Le-Gascuel (LG), Jones-Taylor-Thornton (JTT) и General Reversible Chloroplast (cpREV). Для трех субъединиц (B, C, a) была выбрана модель JTT. Эта модель была предложена в 1992 г. на основе усовершенствованной матрицы аминокислотных замен (Jones et al., 1992) вместо матрицы PAM (Dayhoff et al., 1978). Модель LG была выбрана для субъединиц A, D и d. Так как эта модель не включена в программу MrBayes, то по апостериорной вероятности вместо нее для указанных субъединиц оптимальными были модели JTT и WAG. По критериям AIC и BIC для этих субъединиц следующей по оптимальности моделью после LG была JTT. Более современные модели используют матрицы аминокислотных замен, рассчитанные по большему числу накопленных данных, и чаще всего последние модели лучше подходят для реконструкции филогении, но есть и исключения (Le, Gascuel, 2008). Довольно неожиданным результатом стал выбор оптимальной модели cpREV для протеолипидной субъединицы c. Модель cpREV разработана для белков, закодированных хлоропластными генами водорослей и высших растений (Adachi et al., 2000). Существуют предположения, что субъединица с АТФаз V-типа возникла в результате слияния двух протеолипидных субъединиц АТФаз F-типа (Nelson, 1992; Kibak et al., 1992), которые локализованы на мембранах хлоропластов и митохондрий и участвуют в синтезе АТФ в ходе процессов фотосинтеза и дыхания. Выбор модели cpREV является дополнительным аргументом в пользу родства протеолипидных субъединиц АТФаз вакуолей и хлоропластов. Филогения субъединиц периферического комплекса V1 Для построения филогенетических деревьев были использованы три метода: NJ, ML и метод Байеса. На рисунке 1 представлены филогенетические деревья субъединицы А, построенные различными методами. Можно видеть, что топологии всех трех моделей в достаточной степени схожи. Больше всего узлов с поддержкой более 50 % наблюдалось при построении деревьев методом ML, поэтому на остальных рисунках представлены реконструкции, проведенные именно им. Филогенетическое дерево субъединицы А сходно с филогенией растений, что характерно для последовательностей ортологов. Для нескольких видов были выделены изоформы субъединицы А: три изоформы у Brassica rapa, по две у Glycine max, Solanum lycopersicum, S. tuberosum, Oryza sativa, Zea mays. В случае S. tuberosum и S. lycopersicum две изоформы (А1 и А2) оказались паралогами. Дупликация исходного гена, которая привела к их образованию, по-видимому, произошла еще у общего предка томата и картофеля. Такая же картина наблюдается для изоформ риса O. sativa. Филогенетическое дерево некаталитической АТФ-связывающей субъединицы В в меньшей степени согласуется с филогенией растений, представители только некоторых семейств образуют монофилетичные клады (рис. 2 Б). Изоформы были обнаружены для всех видов кроме Cucumis melo, C. sativus, Nicotiana sylvestris, N. tabacum, Triticum aestivum и T. urartu. В большинстве случаев изоформы одного вида попадали в разные клады, что говорит о том, что они являются паралогами. Топология филогенетического дерева субъединиц С (рис. 2 А) и D (рис. 2 В) была близка с таковой для А. У обеих субъединиц изоформы являлись ортологами. Изоформы субъединицы С были обнаружены только у четырех видов: G. max, B. rapa, O. sativa и Z. mays. Изоформы субъединицы D найдены у Malus domestica, G. max, N. sylvestris, B. rapa, A. thaliana, Z. mays и O. sativa. Все изоформы одного вида образовывали монофилетичные группы, что позволяет предположить их относительно недавнее происхождение. Сходные по топологии филогенетические деревья были получены для субъединиц G и H, по 26 и 15 аминокислотным последовательностям, соответственно. У субъединицы G были обнаружены изоформы почти во всех изученных видах. Изоформы одного вида являлись паралогами и попадали в разные клады. Филогенетические деревья субъединиц G-H не представлены, т. к. они были сходны по топологии с деревом субъединицы А. Филогения субъединиц мембранного комплекса V0 На молекулярно-филогенетическом дереве субъединицы a аминокислотные последовательности формировали две клады с высокой поддержкой при любом методе анализа (реконструкция методом ML представлена на рис. 3). У всех видов присутствовало не менее двух изоформ этого белка. В первой кладе содержались изоформы, обозначенные как а1, во второй - а2 и а3. Разделение на однодольные и двудольные происходило уже внутри клад а1 и а2/а3. У некоторых видов было несколько изоформ в группе а1 (B. rapa, S. tuberosum, S. lycopersicum, G. arboretum, G. max). В кладе а2/а3 двудольные распадались на две подклады. Филогенетическое дерево последовательностей субъединицы а свидетельствует о древней дупликации кодирующих ее генов. Первая древняя дупликация произошла у предков цветковых растений или еще раньше, у предков наземных растений. Таким образом сформировались изоформа а1 и общая предковая изоформа для а2 и а3. Вторая дупликация привела к образованию изоформ а2 и а3 и происходила уже после разделения двудольных и однодольных. На филогенетическом дереве протеолипидной субъединицы с было меньше клад с высокой статистической поддержкой (рис. 4 А). Это связано с низким числом вариабельных сайтов при выравнивании (табл. 4), среди которых высока доля парсимонично неинформативных замен. Также для этой субъединицы отмечено самое низкое значение средней длины филогенетического дерева (табл. 4). Несмотря на низкую вариабельность, у многих видов существуют изоформы, отличающиеся между собой одной или несколькими аминокислотами. У Zea, Solanum и Nicotiana изоформы являются паралогами, возникшими в результате недавней дупликации. Для остальных видов из-за низкой поддержки клад филогенетического дерева нельзя определенно сказать, являются ли изоформы паралогами или ортологами. Филогенетическое дерево третьего белка трансмембранного комплекса, субъединицы d, было похоже на деревья субъединиц периферического комплекса D (рис. 4 Б). Изоформы были идентифицированы у N. sylvestris, G. max, A. thaliana, B. rapa, C. sativus, T. cacao, T. aestivum, O. sativa. Как и для а, для этой субъединицы отмечено довольно низкое значение средней длины филогенетического дерева (табл. 4). Обсуждение Интерес к эволюции вакуолярной АТФазы возник еще в начале 90-х гг., однако большинство исследований было посвящено ее происхождению от F-АТФаз митохондрий и хлоропластов, по-видимому, из-за общего принципа субъединичного строения фермента (Gogarten et al., 1992). Особенностям эволюции данного фермента внутри царства растений уделялось мало внимания. Возможно, это объяснялось еще и недостатком информации, так как клонировать и секвенировать такой мультиферментный комплекс - это трудоемкая и затратная по времени задача. В настоящее время благодаря интенсивному развитию технологий секвенирования нового поколения и реализации геномных проектов появилась возможность сравнения десятков последовательностей, что позволило говорить о молекулярной эволюции каждой из субъединиц. Необходимые данные представлены в широкодоступных базах данных. Именно они были использованы нами для данного исследования характера изменчивости различных субъединиц фермента. Нами показано, что различные субъединицы V-АТФазы изменяются в ходе эволюции по-разному, хотя и являются структурными частями одного белка. На основе проведенного анализа можно охарактеризовать несколько основных особенностей эволюции, которые по-разному сочетаются у разных субъединиц этого фермента. 1. Древние дупликации. Филогенетический анализ субъединицы а показывает как минимум два события дупликации ее генов. Согласно современным представлениям древние цветковые отделились примерно 374 миллионов лет назад (Silvestrо et al., 2015). Результаты молекулярно-филогенетического анализа субъединицы а позволяют предположить, что дупликация кодирующего ее гена произошла до этого события. Возможно, дупликация этого белка связана с переходом растений к наземному существованию. Вторая дупликация произошла у двудольных, после отделения однодольных, не позднее 100 млн лет назад (примерное время дивергенции - Poales, Hertweck et al., 2015). Предположение о древней дупликации, произошедшей около 300 млн лет назад, ранее было сделано для субъединицы А периферического комплекса на основе сравнения длины уникального для растений интрона (Gogarten et al., 1992; Starke, Gogarten, 1993). Наши данные не подтверждают этого для А домена V1, но достоверно показывают для а домена V0. 2. Новые дупликации. В большинстве случаев новые дупликации субъединиц вакуолярной Н+-АТФазы происходили либо при становлении отдельных семейств цветковых (такая картина наблюдается у Solanaceae), либо позже, при дивергенции таксонов внутри семейства (например, O. sativa из Poaceae). Изоформы, возникшие в результате новых дупликаций, могут различаться тканеспецифичностью экспрессии и участием в адаптации к стрессовым воздействиям (Bageshwar et al., 2005). 3. Высокая консервативность. Проведенный анализ свидетельствует, что аминокислотные последовательности субъединицы с очень близки у всех цветковых растений. Об этом говорит и низкое число вариабельных сайтов выравнивания, и наименьшая длина филогенетического дерева, и выбор в качестве оптимальной эволюционной модели, разработанной для хлоропластных белков. Консервативность субъединицы с можно объяснить ее функциональностью как трансмембранного канала. В то же время клонировано нескольких изоформ этой субъединицы, по-разному отвечающих на солевой стресс (Lehr et al., 1999). Изоформы, рассмотренные нами, отличались между собой всего несколькими аминокислотами. По-видимому, даже такие минимальные различия в столь консервативном белке могут приводить к существенному изменению работы фермента. Консервативностью отличалась и другая субъединица интегрального домена - d, что может быть связано с ее ролью в ротационном механизме V-АТФазы. Также относительно консервативной оказалась субъединица В, что может быть связано с выполнением регуляторной функции. Хотя она не участвует в гидролизе АТФ, но содержит АТФ-связывающие сайты, которые модулируют активность фермента, а при определенных мутациях в центрах связывания АТФ на субъединице В происходит полное выключение работы фермента или разобщение транспортной и каталитической составляющих активности (Liu et al., 1996; Vasilyeva et al., 2000). Кроме того, показано, что именно субъединица В может быть фосфорилирована по серину (Martiny-Baron et al., 1992), что является одним из механизмов посттрансляционной регуляции фермента. Таким образом, эволюция Н+-АТФазы тонопласта представляет собой сложный процесс. Субъединицы периферического комплекса V1 характеризовались высокой вариабельностью, за исключением субъединицы В, которая отличалась консервативностью. Наиболее консервативной была субъединица V0-с, формирующая протонный канал. В то же время субъединица а дуплицировалась несколько раз, что привело к появлению большого разнообразия изоформ. Благодаря сочетанию древних и новых дупликаций, консервативности и изменчивости отдельных субъединиц могло происходить появление V-АТФаз с новыми свойствами, необходимыми для приспособления к меняющимся условиям окружающей среды. Таким образом, филогенетическое сравнение субъединиц демонстрирует возникновение баланса между изоформами, который позволяет растениям гибко адаптироваться к условиям окружающей среды и смене морфогенетических программ.

About the authors

Tingzhuo Chen

Saint Petersburg State University

Email: ctz1985@mail.ru
PhD student, Department of plant physiology and biochemistry

Yulia Vladimirovna Mikhaylova

Komarov Botanical Institute, Russian Academy of Sciences

Email: YMikhaylova@binran.ru
junior reseacher, Laboratory of Biosystematics and Cytology

Maria Fiodorovna Shishova

Saint Petersburg State University

Email: mshishova@mail.ru
Professor, Department of plant physiology and biochemistry

References

Supplementary files