Research of the influence of LIG4 gene polimorphism on chromosomal aberrations level in human lymphocytes, with background and excessive exposure to radon

Full Text

Введение Генетические основы индивидуальной чувствительности человека к радиационному воздействию в настоящее время остаются изученными крайне слабо. И хотя имеются данные о наследственной предрасположенности к повышенной радиочувствительности (Kadhim et al., 2010), многие молекулярные аспекты процессов повреждения ДНК и компенсаторных механизмов еще предстоит установить. В этой связи актуальным является поиск ассоциаций между индуцированными радиацией цитогенетическими повреждениями в соматических клетках человека и отдельными полиморфными вариантами генов репарации ДНК, обеспечивающими стабильность генома. В ряде исследований (Минина и др., 2011; Сальникова и др., 2010; Au et al., 2003; Sram et al., 2006; Wilding et al., 2005) в качестве возможных маркеров повышенной чувствительности к радиационному воздействию рассматривались полиморфные участки генов эксцизионной репарации оснований (BER) и нуклеотидов (NER): XRCC1, XRCC3, APE1, XPD, hOGG1, ADPRT и др. Однако, по нашим сведениям, влияние полиморфизма гена лигазы-4 (LIG4), участвующего в процессах негомологичного воссоединения концов ДНК (NHEJ) (Jeggo, 1998), на показатели цитогенетического гомеостаза до сих пор не изучали. В данном исследовании мы оценили значение двух полиморфных маркеров гена LIG4 (rs1805388 и rs1805389) для формирования индивидуального уровня хромосомных аберраций в лимфоцитах крови лиц, подверженных хроническому воздействию излучений радона, и в контрольной группе. Вариабельность этих маркеров связана с нуклеотидными заменами C4044T и C4062T в экзонах, что приводит к замене одного аминокислотного остатка в зрелом белке Ala3Val и Thr9Ile соответственно. Материал и методы Обследованы две выборки детей и подростков, проживающих в условиях фонового уровня α-излучения (контрольная группа), и подвергающихся избыточному α-излучению за счет сверхнормативного воздействия радона и продуктов его распада («группа Rn»). Первая группа включала 185 мальчиков и девочек из сел Красное, Пача и Зарубино Кемеровской области (средний возраст обследованных составил 14,4 ± 0,19 года). Вторая группа сформирована из 368 детей и подростков обоих полов, постоянно проживающих и обучающихся в школе-интернате г. Таштагол Кемеровской области. Средний возраст детей данной группы составил 12,4 ± 0,14 года. На момент исследования все доноры были практически здоровы, не проходили медикаментозное лечение и не подвергались медицинским рентгенологическим процедурам в течение 3 месяцев, предшествовавших обследованию. На каждого обследуемого был оформлен протокол информированного согласия, подписанный родителями или лицами, осуществляющими опеку несовершеннолетних. Замеры удельной объемной активности радона в воздухе жилых и учебных помещений выполнены с использованием радиометра радона РРА-01 М-01 «Альфарад» в режиме Air 1 в период 2007–2011 гг. При проведении измерений ориентировались на нормативно-методическую документацию Минздрава России (2003) и Федерального центра гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора (2009). Культивирование клеток крови и подготовку препаратов хромосом проводили по стандартному протоколу, описанному ранее (Дружинин, 2003). Отбор метафаз, включаемых в анализ, и критерии для регистрации цитогенетических нарушений соответствовали общепринятым рекомендациям (Бочков и др., 1972). В среднем анализировали по 190 метафаз на каждого донора. Регистрировали все типы хромосомных аберраций, ахроматические пробелы в число аберраций не включали и фиксировали отдельно. В дальнейшем для каждого обследованного осуществляли пересчет общего числа аберраций на 100 клеток, что позволяет обобщать цитогенетические показатели, установленные для лиц с неравным количеством проанализированных метафаз. После соответствующей группировки данных единицей варьирования становились индивидуальные значения учитываемых цитогенетических показателей. Соответственно, вычисляемые при статистическом анализе ошибки средних значений отражали внутригрупповую изменчивость числа аберраций в пересчете на 100 клеток. Очистку геномной ДНК проводили путем экстракции смесью хлороформ/фенол (Sambrook et al., 1989). Для генотипирования аллелей rs1805388 и rs1805389 гена LIG4 использовали коммерческие наборы реагентов «SNP-экспресс» производства НПФ «Литех», г. Москва. Затем проводили аллель-специфическую ПЦР с последующей визуализацией результатов в 3%-м агарозном геле с добавлением бромистого этидия. Статистический анализ первичных данных выполняли с помощью ППП «STATISTICA v.6». Сопоставление групп осуществляли с использованием непараметрического метода Манна–Уитни. Статистически значимыми считали различия, соответствующие величине p < 0,05. Результаты исследования Результаты многолетнего мониторинга состояния радиационной обстановки на территориях, где проводилось исследование, были подробно изложены в ранее опубликованной работе (Минина и др., 2011). В ходе исследования было установлено, что средняя удельная объемная активность радона в воздухе помещений школы-интерната (г. Таштагол) на протяжении всего периода проведения радиологического мониторинга достоверно превышала соответствующий уровень, зарегистрированный на контрольных территориях. Расчеты с использованием норм радиационной безопасности (НРБ 99/2009) показали, что при постоянном пребывании на территории школы-интерната индивидуальная эффективная доза ингаляционного облучения детей только за счет изотопов радона и их короткоживущих дочерних продуктов в воздухе составляет около 20 мЗв/год. При этом доза, обусловленная растворением газообразного 222Rn в крови и последующим облучением внутренних органов, достигает 1 мЗв/год. Таким образом, результаты радиологических исследований позволили заключить, что условия проживания и обучения воспитанников школы-интерната г. Таштагола не соответствуют санитарно-эпидемиологическим нормам по параметрам радиационной безопасности. Установлено, что данная популяция подвержена хроническому воздействию сверхнормативных доз радонового излучения, что в свою очередь может вызывать выраженные генотоксические последствия. Сопоставление значений цитогенетических показателей, характеризующих уровень мутагенных эффектов, в двух группах обследованных позволило установить ряд статистических различий. Средняя частота аберраций у лиц из «группы Rn» достигала 4,4 ± 0,13, тогда как в контрольной выборке лишь 2,7 ± 0,11 (Um-w = 20654; p < 0,001) (табл. 1). Из всех выявляемых вариантов цитогенетических повреждений лишь обмены хроматидного типа имели в сравниваемых группах близкие значения, не отличающиеся достоверно. Особенно важен тот факт, что количество обменов хромосомного типа: дицентрических и кольцевых хромосом, являющихся маркерами радиационного воздействия, оказалось достоверно выше в выборке со сверхнормативным воздействием радона относительно соответствующего значения в контрольной группе (Um-w = 26924; p < 0,001). В ходе дальнейшего анализа были сопоставлены цитогенетические показатели у лиц, носителей различных аллелей LIG4 (маркер rs1805389, полиморфный вариант Ala3Val и маркер rs1805388, полиморфный вариант Thr9Ile), находящихся в условиях различающегося радиационного воздействия. В контрольной группе среди носителей генотипа Ala/Ala частота аберраций составила 2,4 ± 0,17, а среди представителей генотипической группы Ala/Val — 2,0 ± 0,28 (рис. 1). Отличие не являлось статистически значимым. По итогам генотипирования в «группе Rn» был выявлен только один носитель варианта Val/Val полиморфизма rs1805389, поэтому в дальнейшем он был включен в группу гетерозиготных доноров. Частота аберраций у гомозигот Ala/Ala из данной экологической группы в среднем составила 4,3 ± 0,15 (рис. 1). Среди носителей генотипов Ala/Val и Val/Val эта величина достигла 4,8 ± 0,44, но достоверно не отличалась от предыдущего значения. При дальнейшем рассмотрении количества и спектра выявленных хромосомных аберраций у представителей двух когорт с различным уровнем радиационного воздействия было установлено, что в обеих группах существенно преобладали аберрации хроматидного типа (табл. 2). В контрольной выборке у гомозигот Ala/Ala в среднем их выявлено 1,9 ± 0,14 на 100 клеток, у носителей варианта Ala/Val — 1,4 ± 0,23 на 100 клеток при отсутствии достоверного отличия по данному показателю. Среди аберраций хроматидного типа в обеих группах регистрировались одиночные фрагменты и крайне редко — обмены. Спектр хромосомных нарушений данного типа был сходный в двух группах, а численные значения отдельных типов аберраций достоверно не отличались. Как видно, в условиях сверхнормативного воздействия радона сохраняется преобладание аберраций хроматидного типа вне зависимости от генотипа обследованных (3,1 ± 0,13 и 3,3 ± 0,36 на 100 клеток в двух генотипических группах). Уровень аберраций хромосомного типа также повышается относительно контрольных значений как у гомозигот Ala/Ala, так и у прочих обследованных, достигая соответственно 1,2 ± 0,06 и 1,5 ± 0,15 на 100 метафаз. При этом в «группе Rn» среди лиц с генотипами Ala/Val и Val/Val наблюдается достоверное повышение количества парных фрагментов до 1,3 ± 0,13 по сравнению с уровнем, характерным для гомозигот Ala/Ala — 1,0 ± 0,05 (UM-U = 4456; p = 0,045). Значения прочих цитогенетических показателей статистически не отличались в двух генотипических группах. Мы оценили также количество спонтанных и индуцированных радоном хромосомных аберраций в лимфоцитах детей с различными полиморфными вариантами LIG4, маркер rs1805388 (аминокислотный полиморфизм Thr9Ile). Как и в случае маркера rs1805389, ввиду немногочисленности гомозигот по минорному варианту Ile (2 в контрольной и 4 в «группе Rn»), таких доноров в ходе дальнейшего исследования объединяли в одну группу с гетерозиготными обследованными. В контрольной группе среди носителей генотипа Thr/Thr средняя частота аберраций составила 2,8 ± 0,15, а среди представителей смешанной генотипической группы — 2,5 ± 0,22 (рис. 2) при отсутствии достоверного отличия. Количество аберраций у носителей сочетания Thr/Thr из «группы Rn» достигало в среднем 4,4 ± 0,16, а в когорте обследованных с прочими генотипами — 4,3 ± 0,31 при отсутствии статистического отличия между этими значениями (рис. 2). При анализе уровня хромосомных аберраций отдельных типов в группе сравнения установлено, что у гомозигот Thr/Thr число аберраций хроматидного типа составило в среднем 2,2 ± 0,12 на 100 клеток и статистически не отличалось от величины, характерной для носителей прочих генотипов — 1,9 ± 0,17 (табл. 3). Количество аберраций хромосомного типа практически совпадало в двух группах (0,7 ± 0,07 и 0,6 ± 0,09). У лиц, проживающих в условиях сверхнормативного воздействия радона, как среди гомозигот Thr/Thr, так и в смешанной генотипической группе, отмечено повышение частоты хроматидных аберраций (3,1 ± 0,13 и 2,9 ± 0,26 в двух группах соответственно) и хромосомных аберраций (1,3 ± 0,07 и 1,4 ± 0,12 в двух группах соответственно) относительно контрольных значений. Не было установлено статистически значимых отличий между величинами каких-либо цитогенетических показателей у обследованных из данной экологической группы с различными вариантами маркера rs1805388. Обсуждение результатов Анализ радиационной обстановки в местах обучения и проживания обследованных детей и подростков Кемеровской области показал, что в условиях школы-интерната г. Таштагол учащиеся испытывают хроническое сверхнормативное воздействие радона и продуктов его распада. Избыточное α-излучение, вероятно, стало причиной повышенного уровня хромосомных аберраций среди детей из этой группы (табл. 1). Причем в спектре аберраций, выявленных у представителей данной экологической группы, относительно большую долю составляют обмены хромосомного типа, их частота наиболее значительно отличалась от уровня, установленного в контрольной группе. Этот факт является дополнительным аргументом в пользу предположения о радиационном характере наблюдаемых хромосомных повреждений, так как именно перестройки хромосомного типа (в частности, дицентрические и кольцевые хромосомы) считаются цитогенетическими индикаторами воздействия радиации (Balakrishnan, Rao, 1999; Jha, Sharma, 1991). Сравнительный анализ цитогенетических показателей, характерных для выборок детей, проживающих и обучающихся в условиях фонового и сверхнормативного воздействия радона, показывает высокую значимость данного экологического фактора при формировании уровня хромосомных аберраций. При этом сверхнормативное воздействие излучений радона и продуктов его распада может являться своеобразным «проявителем» репарационных возможностей организма, находящихся в зависимости от генетической конституции индивидуума. Действительно, ранее было установлено, что при облучении культур лейкоцитов in vitro менее устойчивыми оказывались клетки доноров-носителей минорного аллель 977G гена hOGG1 и аллеля C589 и G1996 гена XRCC1 (Сальникова и др., 2010). В другой работе было выявлено дезадаптивное значение полиморфных вариантов 751Lys гена XPD, 194Trp и 399Gln гена XRCC1 и 241Met гена XRCC3 в условиях воздействия на клеточную культуру рентгеновских лучей (Kadhim et al., 2010). В нашем исследовании установлено, что в условиях фонового радиационного воздействия полиморфизм гена лигазы (маркеры rs1805388 и rs1805389), по-видимому, не имеет существенного значения при формировании индивидуального уровня хромосомных аберраций. Соотношение общего количества и отдельных типов повреждений хромосом у представителей разных генотипических групп из контрольной выборки достоверно не отличалось. Вне зависимости от сочетания аллелей rs1805388 и rs1805389 гена LIG4 сверхнормативное воздействие радона in vivo приводит к увеличению количества хромосомных нарушений (рис. 1, 2). При этом обращает на себя внимание широкий диапазон индивидуальных значений рассматриваемых цитогенетических показателей у представителей данной экологической группы, как у носителей маркера rs1805388, так и rs1805389. Очевидно, в сходных радиоэкологических условиях проживания индивидуумы с одинаковыми генотипами демонстрируют существенно отличающуюся резистентность к избыточному облучению. Причиной этого может являться специфика индивидуального сочетания аллелей прочих генов, а также влияние неучтенных экзогенных факторов. В то же время анализ количества аберраций отдельных типов на 100 клеток (табл. 2) позволил установить, что в условиях сверхнормативного воздействия радона наличие гомозиготного генотипа по маркеру rs1805389 может являться фактором более высокой устойчивости к избыточному радиационному воздействию установленного типа. Вместе с тем полиморфизм Ala3Val гена LIG4 нельзя считать ключевым фактором, определяющим варьирование индивидуальной чувствительности к воздействию излучений радона и продуктов его распада.

About the authors

Aleksey Nikolayevich Volkov

Kemerovo State University

Email: volkov_alex@rambler.ru
docent, candidate of biological sciences

Tatyana Aleksandrovna Golovina

Kemerovo State University

Email: druzhinin_vladim@mail.ru
chief engineer, Chair of Genetics

Vladimir Gennadyevich Druzhinin

Kemerovo State University

Email: druzhinin_vladim@mail.ru
professor, doctor of biological sciences

Aleksey Viktorovich Larionov

Kemerovo State University

Email: larionov@mail.ru
engineer, candidate of biological sciences

Varvara Ivanovna Minina

Institute of Human Ecology SB RAS

Email: vminina@mail.ru
senior research fellow, candidate of biological sciences

Anna Aleksandrovna Timofeyeva

Institute of Human Ecology SB RAS

Email: vminina@mail.ru
engineer, Laboratory of Сytogenetics

References

Supplementary files