Assessment of hybridization propensity between genetically modified oilseed rape and nontransgenic relatives

Full Text

ВВЕДЕНИЕ В связи с расширением площадей, занятых генетически модифицированными (ГМ) культурами, всё большую актуальность приобретает вопрос их безопасности для экосистем. К 2014 году трансгенные растения выращивались в 28 странах уже на 1,8 миллиардах га, а стоимость рынка ГМ-семян составила 15,6 миллиардов долларов США (James, 2014). Не возникает сомнений в том, что с каждым годом эти цифры будут расти. Однако количество стран, возделывающих ГМ-растения, в период с 2011 по 2013 год сократилось с 29 до 27 (James, 2013). Таким образом, рынок трансгенных растений увеличивается в основном благодаря странам-лидерам по их производству: США, Бразилии, Аргентине, Индии и Канаде, на которые приходится 90 % площадей, занятых под ГМ-культуры. Одной из причин, обуславливающих отказ многих стран от ГМ-культур, являются возможные пищевые, агротехнические и экологические риски (Куликов, 2005), связанные с их возделыванием и использованием. В центре внимания общественности находятся, прежде всего, пищевые риски, несмотря на то, что о негативном влиянии на организм человека продуктов, полученных из ГМ-источников, не сообщалось. Однако в связи с принятием Постановления Правительства РФ № 839 «О государственной регистрации генно-инженерно-модифицированных организмов, предназначенных для выпуска в окружающую среду, а также продукции, полученной с применением таких организмов или содержащей такие организмы», в России на первый план выходят агротехнические и экологические риски, ранее отсутствовавшие в связи с запретом на возделывание ГМ-культур. Следует отметить, что в связи с проведением политики импортозамещения, предпочтительным является создание и использование отечественных трансгенных сортов с учётом нужд российского сельского хозяйства. Агротехнические риски в целом связаны с возможной неэффективностью использования ГМ-сортов либо с потерей эффективности со временем, что также актуально и для традиционной селекции. Существует множество видов сорных растений и насекомых-вредителей, развивших устойчивость к современным методам борьбы, например, капустная моль Plutella xylostella (Tabashnik et al, 2003) приобрела устойчивость к инсектицидам на основе Bt-токсина. После начала коммерческого возделывания ГМ-растений было отмечено появление устойчивого к Bt-сортам кукурузного жука Diabrotica virgifera (Gassmann, 2014), а также устойчивого к глифосату сорного растения Amaranthus palmeri (Culpepper, 2008). В последнее время появилась тенденция создания растений с множественными вставками трансгенов, в том числе, для предотвращения формирования резистентности у вредителей (например, сортов, вырабатывающих несколько Cry-белков или сортов, устойчивых к нескольким гербицидам, а также одновременно к гербицидам и насекомым-вредителям) (Que et al., 2010). В 2014 году такие растения занимали 28 % от общих площадей, используемых под ГМ-культуры (James, 2014). Существуют также и сорта, имеющие повышенную устойчивость к неблагоприятным условиям окружающей среды (ISAAA's GM Approval Database). Их общая доля пока незначительна, однако именно такие ГМ-растения, вероятно, получат распространение в долговременной перспективе. Особая необходимость в таких сортах существует в зонах рискованного земледелия, где лимитирующим фактором являются суровые климатические условия, причем это характерно для большей части территории России. Однако в отличие от искусственного отбора, который часто способствует снижению адаптивности сельскохозяйственных растений, генная инженерия способна снять ограничения, лимитирующие распространение ГМ-растений и соответствующих трансгенов как в естественных, так и в агроэкосистемах (Gepts, Papa, 2010). Биотехнологами было получено и доведено до полевых испытаний огромное количество различных генетически модифицированных растений, характеризующихся уникальными хозяйственно ценными признаками, например, устойчивые к засухе, холоду, засолению сорта кукурузы и сои, устойчивый к переувлажнению рис, устойчивый к высоким температурам хлопчатник (Warwick et al., 2009). После их выхода на рынок наибольшую актуальность приобретут экологические риски возделывания ГМ-культур, заключающиеся в возможном влиянии трансгенных растений на экосистемы, в том числе и на биоразнообразие. При этом наиболее актуальной проблемой является риск переноса трансгенов к другим растениям в результате переопыления, поскольку межвидовая гибридизация является не только инструментом селекции, но и силой, способной вызвать эволюционные изменения в экосистемах (Zou et al., 2011). Последствия переопыления трансгенных растений с нетрансгенными родственниками, как дикорастущими, так и культурными, являются предметом интенсивного изучения, и в литературе имеется большое количество данных по этому направлению исследований, тогда как в России такие работы из-за запрета на возделывание ГМ-растений пока не проводились. Среди возможных последствий переопыления с трансгенными растениями называют, в первую очередь, увеличение инвазивного и сорного потенциала гибридов (Ellstrand, 2001; Lu, Snow, 2005; Rieseberg et al., 2007), а также исчезновение и ассимиляцию диких видов (Wolf, Rieseberg, 2001). Хотя на сегодняшний день большинство трансгенных растений не имеют серьёзных конкурентных преимуществ вне агроэкосистем, в будущем же, после появления на рынке устойчивых к неблагоприятным условиям окружающей среды сортов, вероятность наступления таких последствий увеличится. Таким образом, для получения преимуществ, которые могут дать сельскому хозяйству ГМ-сорта, необходимо со всей серьёзностью отнестись к сопутствующим рискам, которые несёт всё увеличивающееся многообразие трансгенных растений. Необходимо продолжать исследования в этой области, в том числе, с учётом особенностей новых сортов, ещё не поступивших в продажу. В связи с возможным скорым началом возделывания ГМ-растений в России, особенно пристального внимания заслуживает проблема переноса трансгенов к диким и культурным родственным растениям. Как известно, из ГМ-культур наиболее распространены в мире трансгенные соя, хлопок, кукуруза и рапс (James, 2014). Из этих растений наибольшим уровнем риска переопыления с дикими родственниками обладает рапс (Brassica napus), о чём свидетельствует значительный объем данных о внутри- и межвидовой гибридизации внутри семейства крестоцветных (Fitz John, 2007). К тому же, именно эта культура наилучшим образом приспособлена к суровым климатическим условиям России. Следует отметить, что рапс играет важную роль в оптимизации структуры агроценозов и агроэкосистем как сидеральная и промежуточная культура, способная к ускоренному накоплению органического вещества. Возделывание рапса позволяет повысить полноту использования климатических ресурсов и восстановить баланс органического вещества почв в севообороте (Зыбалов, 2002; Зыбалов, Миркин, 2002) Таким образом, ГМ-рапс является наиболее подходящим объектом для обсуждения проблемы гибридизации ГМ-культур с нетрансгенными родственными растениями. В данном обзоре рассматриваются исследования вероятности переопыления рапса с культурными и дикорастущими родственными растениями в зависимости от их вида и места произрастания, а также возможность закрепления новых признаков в ряду поколений. Анализируются проблемы, возникающие при исследовании переноса трансгенов в результате переопыления, предлагаются возможные пути их решения. Рапс и его дикие родственники Рапс - одна из наиболее перспективных сельскохозяйственных культур, производство которой в нашей стране неуклонно растёт. Благодаря холодостойкости он пригоден для выращивания в условиях Поволжья и Сибири. В России рапс возделывается в основном в Татарстане, Башкортостане, в Омской, Тюменской, Иркутской областях и на Алтае. Получаемое сырье востребовано как в РФ, так и за рубежом, причем наблюдается тенденция к росту спроса. Производство рапса, безусловно, будет активно наращиваться и дальше как в нашей стране, так и за рубежом, в связи с усугубляющимися энергетическими и продовольственными проблемами. Рапс используется в пищевых и технических целях. Это не только масличное и кормовое растение и распространённый сидерат, но также сырьё для производства олеиновой и стеариновой кислот, глицерина и биотоплива. Рапс является перспективным видом для очистки почв от загрязнения тяжёлыми металлами. На территории РФ работают заводы по производству рапсового масла (ООО «Либойл», ОАО «Астон», ООО «Лабинский МЭЗ», ОАО «Казанский МЭЗ», ООО «МЭЗ Юг Руси» и др.), которые экспортируют свою продукцию на мировые рынки. На данный момент лишь 7 из 32 одобренных к коммерческому возделыванию за рубежом сортов рапса имеют улучшенные пищевые свойства (повышенное содержание жиров, а также способность связывать фосфор), тогда как 25 сортов отличаются устойчивостью к гербицидам (ISAAA's GM Approval Database), причем последние для России представляют меньший интерес, так как правильное применение комплекса агротехнических приемов обычно позволяет эффективно бороться с сорняками на рапсовых полях. Гораздо более актуальна проблема повышения урожайности и устойчивости рапса к фитофагам, при этом наибольший урон урожаю наносят жуки семейства листоедов (Chrysomelidae). Однако отметим, что проводятся полевые испытания сортов рапса, характеризующихся увеличенной всхожестью, фертильностью и урожайностью, изменённой скоростью роста и развития, устойчивостью к стрессовым факторам, бактериальным и грибковым заболеваниям, а также насекомым-вредителям (Warwick et al., 2009), которые уже в скором времени могут быть выведены на мировой рынок. В связи с этим, весьма актуальными представляются нам финансирование и проведение таких же работ по созданию отечественных ГМ-сортов рапса, причем с учетом местного климата и тех проблем, которые возникают при возделывании этой культуры на территории нашей страны. Использованию ГМ-рапса, особенно новых его сортов, должна предшествовать оценка экологических рисков, что трудно сделать без учёта опыта стран, где эта трансгенная культура уже выращивается. Поскольку 30 % возделываемого рапса представлено трансгенными сортами, переопыление ГМ-рапса с дикими и культурными родственниками исследуется не только в лабораторных и полевых контролируемых экспериментах, но и в условиях коммерческого возделывания. Актуальность изучения вопросов экологической безопасности при возделывании трансгенного рапса объясняется ещё и тем, что это единственное культивируемое в коммерческих масштабах ГМ-растение, имеющее дикорастущие родственные виды во всех регионах коммерческого культивирования (Warwick et al., 2003). Огромное разнообразие крестоцветных имеется и на территории России. Стюарт и др. (Stewart, 2003), относят рапс к группе умеренного риска наряду с подсолнечником, сахарной свеклой, пшеницей и люцерной. Способность этих растений переопыляться с дикими родственниками подтверждена многочисленными данными. Наиболее распространенным свойством ГМ-сортов является устойчивость к глифосату и глюфосинату, которая обеспечивается доминантными аллелями (Knispel, 2008). Совокупность этих факторов сделала посевы устойчивого к гербицидам рапса модельными системами для изучения рисков и возможных экологических последствий переноса и закрепления трансгенов в свободнорастущих популяциях (Londo et al., 2011). Рапс (Brassica napus) - один из наиболее распространённых видов рода Brassica семейства крестоцветных, представленного в том числе капустой (Brassica oleracea), репой (Brassica rapa), горчицей (Brassica nigra, Brassica juncea), среди которых есть не только повсеместно распространённые сельскохозяйственные культуры, но и сорные растения. Рапс является аллотетраплоидом B. rapa и B. oleracea и имеет в своём составе полный геном B. rapa, чем обусловлена высокая фертильность межвидовых гибридов (Snow, 1999). Несмотря на то, что первые эксперименты в Британии показывали, что переопыление рапса с B. rapa происходит редко и риском можно пренебречь, первое сообщение о переносе генов устойчивости к гербицидам к дикому растению касалось именно рапса, коммерчески возделываемого в Канаде (Warwick et al, 2003). Перекрестное опыление рапса возможно и с другими видами рода Brassica (табл. 1), а также представителями других родов семейства крестоцветных. Например, изучалась вероятность переноса генов от рапса к Raphanus raphanistrum, Sinapis arvensis, Hirschfeldia incana и Erucastrum gallicum (табл. 2). Несмотря на редкость случаев переопыления с этими видами, их нельзя оставлять без внимания, поскольку гены рапса могут оставаться в потомках гибридов и после нескольких обратных скрещиваний, что было показано на примере с R. raphanistrum (Chevre et al., 1998; Gueritaine et al., 2002: Chevre et al., 2007). Для оценки склонности растений к интрогрессивной гибридизации был предложен метод вычисления индекса переноса трансгенов, который рассчитывается с учетом переноса пыльцы, распространения семян и встречаемости родственного вида на данной территории, а также многих других признаков, указывающих на высокую вероятность появления гибридов и закрепления трансгенов в популяции. При совпадении всех условий максимальное значение индекса может достигать 26 баллов. Индекс переноса трансгенов от рапса к диким популяциям, рассчитанный на территории Бельгии составил 11,5 для B. rapa, 6,7 для H. incana и R. raphanistrum, 5,1 для B. juncea, 4,5 у D. tenuifolia и S. arvensis. Для некоторых видов, таких как S. alba, индекс не был рассчитан по причине отсутствия данных об успешном скрещивании с рапсом. Полученные результаты позволяют путем наложения карт в ГИС выявлять участки, где существует возможность скрещивания, с целью проведения экологического мониторинга (Devos, 2009). Хотя переопыление с дикими родственниками и влияние на природные экосистемы исследуется гораздо чаще (Crawley et al., 1993, 2001; Scott, Wilkinson, 1998; Warwick et al., 2003), внимание также уделяется и переносу генов культурным сортам растений (Chiang et al., 1977; Ellstrand, 2001; Beckie, 2003; Friesen, 2003), что требует даже более пристального изучения, особенно в случаях, когда ГМ-сорта имеют фармацевтическое или промышленное назначение. В целом существуют данные о возможности переопыления рапса с 23 видами растений: Brassica napus, B. juncea, B. oleracea, B. carinata, B. nigra, B. fruticulosa, B. maurorum, B. tournefortii, Hirschfeldia incana, Diplotaxis erucoides, D. catholica, D. muralis, D. tenufolia, Eruca sativa (E. vesicaria), Erucastrum gallicum, Orychophragmus violaceus, Raphanus sativus, R. rugosum, R. raphanistrum, Rorippa islandica, Sinapis alba, S. arvensis, S. pubescens (Scheffler, Dale, 1994; Fitz John, 2007). Большая их часть встречается на территории России в дикорастущем виде, либо выращивается в культуре. Гипотетически же существует около 100 видов растений (Eastham, Sweet, 2002), способных образовывать гибриды с рапсом при искусственном переопылении, но по разным причинам этого в природе не происходит. Значительная изменчивость существует внутри каждого вида, у разных видов же наблюдаются сходные формы (FitzJohn, 2007), что указывает на необходимость исследования различных популяций растений для получения объективных данных. Вероятность гибридизации ГМ-рапса с Brassica napus Наиболее вероятной выглядит возможность переопыления рапса с дикорастущими и культурными представителями того же вида. Свободноживущие популяции могут появляться в результате потери ГМ-семян при транспортировке и служить источником распространения трансгенов через пыльцу и семена. В Японии, где ГМ-растения не возделываются, были обнаружены устойчивые к гербицидам B. napus, произрастающие вблизи портов и на обочинах дорог. Предположительно, семена рассыпались при перевозке на грузовиках из портов к фабрикам по переработке (Saji et al., 2005). Позднее были обнаружены гербицидоустойчивые B. rapa, а также растения рапса, устойчивые к нескольким гербицидам одновременно, что свидетельствует о переносе генов в дикорастущих популяциях (Aono, 2011). В США, где ГМ-рапс широко распространён, из 288 образцов дикорастущего рапса из придорожных популяций 41 % оказались устойчивы к глифосату, 39 % глюфосинату и 0,7 % к обоим гербицидам (Schafer et al., 2011). В Канаде устойчивость к глифосату наблюдалась в 14 (88 %) исследованных придорожных популяциях, к глюфосинату в 13 (81 %) и к имидазолинону в 5 (31 %). Устойчивость сразу к нескольким гербицидам одновременно была обнаружена в 10 (62 %) популяциях. Процент перекрестного опыления разнился от 6 до 81 % (Knispel, 2008). Появление дикорастущего рапса, устойчивого к двум гербицидам, также отмечалось в Канаде и ранее (Hall, 2000). В 14 образцах из партий семян собранной в Канаде нетрансгенной канолы контаминация устойчивостью к гербицидам превысила 0,25 %, а в трёх образцах - 2 % (Friesen, 2003). Из 70 образцов семян от 14 свободно переопылявшихся чувствительных к гербицидам канадских сортов, в половине была обнаружена устойчивость к глифосату, в 59 % - к глюфосинату. Только в двух образцах не было ни одного трансгена. В полевом эксперименте по изучению скрещивания между двумя ГМ-сортами, устойчивыми к глифосату и глюфосинату соответственно, одновременную устойчивость к двум гербицидам показывали от 1,4 % проростков семян, собранных на общей границе между полями, до 0,04 % на расстоянии 400 м. На следующий год гибриды были обнаружены на расстоянии 800 м (Beckie, 2003). Переопыление с культурными сортами также может привести к неблагоприятным последствиям. Обнаружение ГМ-вставок в продукции органического сельского хозяйства неизбежно приведёт к убыткам для производителей. К тому же, ГМ-сорта являются интеллектуальной собственностью компаний-производителей, которые могут предъявить фермерам обвинения в незаконном использовании запатентованных семян, в то время как трансгены попали в их урожай в результате переопыления. Вероятность гибридизации ГМ-рапса с Brassica rapa В наибольшей степени изучено переопыление рапса с сорными представителями вида B. rapa. На данный момент уже неоднократно зафиксирован перенос трансгенов от ГМ-рапса к диким популяциям репы с образованием плодовитых гибридов. Значительное влияние на уровень гибридизации, вероятно, оказывает соотношение доноров и акцепторов пыльцы. Так, было показано, что до 93 % семян растений датской популяции B. rapa, произрастающих на полях с культивируемым рапсом, являются гибридными (Jorgensen et al., 1996), но в естественных популяциях, где растения получают больше пыльцы от представителей своего вида и обособлены от посевов рапса, гибридов образуется меньше. Вероятность перекрестного опыления, вероятно, зависит также от используемого ГМ-сорта и изучаемой популяции. Так, в рамках одного исследования на территории США семь линий Bt-рапса в лабораторных и полевых условиях скрещивали с представителями двух географически изолированных популяций B. rapa. В полевом эксперименте исследовалась только калифорнийская популяция, гибридными оказались от 0,7 до 16,9 % семян B. rapa. В лаборатории растения из популяции штата Монтана успешно скрещивались с ГМ-рапсом сорта Westar 45 (33/35 семян оказались трангенными), тогда как гибридов с сортом Oscar 96 получить не удалось. Результаты для калифорнийской популяции существенно отличались: гибридными оказались 1/7 полученных семян при переопылении с сортом Westar 45 и 5/9 семян с сортом Oscar 96. От Westar 58 не удалось получить трансгенных гибридов в теплице, однако они были получены в полевом эксперименте. При обратном скрещивании гибридов с B. rapa трансген был утерян в первом же поколении в случаях с сортами Oscar 96, Oscar 52 и Westar 63, но сохранялся как минимум в двух поколениях в экспериментах с сортами Westar 45, Oscar 48 и Oscar 124. Белок Cry1Ac экспрессировался в них на уровне родительских ГМ-растений (Halfhill, 2002). При эксперименте в теплице из трех линий ГМ-рапса, имеющих устойчивость к гербицидам, насекомым, или оба признака сразу, наибольшая частота гибридизации наблюдалась для сорта, устойчивого к глифосату, в том числе и по сравнению с контролем. В среднем для всех линий при обработке гербицидом перенос трансгенов происходил в 2008 г. в 25 %, а в 2009 г. в 31 % случаев (Londo, 2011). Эти данные позволяют предположить, что, в условиях селективного давления, признак устойчивости к гербицидам может закрепиться в дикой популяции. В полевом эксперименте с использованием популяций США и Канады исследовались 11 линий трансгенного рапса с генами GFP и Bt-токсина. При высоком соотношении рапса и B. rapa (600 : 1) частота скрещивания в полевых условиях в среднем составляла 10 %, причем у двух линий (GT5 и GFP2) частота превышала 20 %, а при меньшем соотношении растений (180 : 1) составляла в среднем 2 %. На частоту скрещивания влияло также место произрастания диких растений, например, в центре она составила 37,2 %, а по краям участка - 5,2 %. При скрещивании гибридов с B. rapa процент трансгенных растений составлял 50 %, когда гибриды выступали в качестве материнских растений, и 0,06-0,08 %, когда материнскими были растения B. rapa (Halfhill et al., 2004). Гибриды были обнаружены во всех восьми исследованных популяциях, расположенных на границах фермерских полей рапса в Канаде (от 1,1 до 17,5 % семян) и в одной из трёх, расположенных на удалении до 10 м (1,1 %). Частота гибридизации снижалась в геометрической прогрессии по мере удаления от полей (Simard, 2006). В другом эксперименте с использованием устойчивого к глифосату трансгенного рапса гибридизация между B. rapa и B. napus была отмечена в полевых экспериментах на уровне 7 % и в диких популяциях на уровне 13,6 %. С 2002 года количество гибридов в естественных условиях снизилось с 85 на 200 растений до 5 на 200 растений в 2005 году. Большая часть гибридов имела устойчивость к глифосату, но сниженную фертильность пыльцы (55 %), однако они успешно могли быть опылены пыльцой других растений. В отсутствие обработки гербицидом, устойчивость к нему сохранялась в течение как минимум шести лет (Warwick et al., 2003, 2008). Однако фертильность гибридов, вероятно, может изменяться относительно родительских растений в зависимости от условий среды. Так, продуктивность гибридов с трансгенным рапсом сорта Westar, вырабатывающим Bt-токсин, в засушливый год была на том же уровне, что и у родительских растений, а во второй, более влажный год - снизилась. По урожайности и жизнеспособности гибриды были сравнимы с родительскими растениями (Millwood, 2011). Возможность переопыления ГМ-рапса с дикими родственниками так же подробно изучалась для британской популяции B. rapa. На примере нетрансгенного рапса была вычислена вероятность скрещивания, которая составила 0,4 %-1,5 % в диких популяциях (Scott, Wilkinson, 1998). В теплице в результате искусственного переноса пыльцы трансгенной линии рапса сорта Westar к 27 растениями B. rapa, пыльники которых были предварительно удалены, уровень скрещивания колебался от 5 % (в двух случаях) до 100 % (в 9 случаях), причем трансгены передавались во всех случаях гибридизации. Таким образом, было показано, что к гибридизации склонны 36 % особей популяции. (Pallett et al., 2006) В полевых же испытаниях при этом было получено всего лишь два гибрида, устойчивых к глюфосинату, что составило 0,00021 % от исследованных семян B. rapa (Daniels et al., 2005). Приспособляемость спонтанных гибридов с нетрансгенным рапсом в США была выше, чем в природных популяциях Великобритании, где урожай гибридов первого поколения составил 46,9 % от урожая B. rapa, а мужская фертильность была на уровне 16,9 %, причем гибриды также демонстрировали повышенный уровень самоопыления. На различных участках гибридными оказались 0,28, 0, 1,28 и 0,56 % семян. 26 полученных гибридов имели меньше семян в стручке, но большее количество стручков, чем у B. rapa (Allainguillaume, 2006). В одном из экспериментов, проведенных в лабораторных условиях, шесть гибридов устойчивого к гербициду рапса сорта Drakkar (93B1104) и B. rapa из природной популяции Дании с таким же количеством хромосом, как и у последней, дважды повторно скрещивались с B. rapa. В третьем поколении у 457 проанализированных растений устойчивость к гербициду проявлялась в среднем у половины (от 36 до 64 % в зависимости от того, от какого из шести гибридов были получены семена). На фертильность гибридов трансген не повлиял. Различия были отмечены только в количестве плодов и семян (у трансгенного потомства двух из шести гибридов плодов было на 20 % меньше по сравнению с нетрансгенным). У одной из этих линий частота передачи трансгена была снижена на 36 % (Snow, 1999). Также изучались экологические риски выращивания транспластомных растений рапса. На примере нетрансгенного рапса было исследовано 47 образовавшихся в природе гибридов и было показано, что вероятность переноса ГМ-вставок через пыльцу отсутствует, либо ничтожно мало, так как хлоропласты передаются по материнской линии. Однако интрогрессия трансгенов может происходить в смешанных популяциях, если рапс будет выступать в качестве материнского растения (Scott, Wilkinson, 1999). Вероятность гибридизации ГМ-рапса с Brassica nigra Поскольку в естественных условиях не было зафиксировано возникновения гибридов между рапсом и горчицей чёрной, скрещивание между этими двумя видами изучается крайне редко. Так, в результате одного из немногих экспериментов, проведённого в теплице с использованием трансгенного рапса, имеющего устойчивость к гербицидам, насекомым или несущих два признака одновременно, было проанализировано 10 798 семян B. nigra и ни одно из них не оказалось трансгенным (Londo, 2011). Тем не менее известно несколько случаев получения гибридов B. nigra с нетрансгенным рапсом в лабораторных экспериментах, а также с другими видами, которые, в свою очередь, способны скрещиваться с рапсом (B. rapa, B. juncea). Также был зафиксирован случай спонтанного скрещивания B. nigra с B. oleracea в природных условиях (FitzJohn, 2007). Таким образом, в условиях высокой концентрации, родственные растения могут служить связующим звеном в переносе генов между рапсом и горчицей чёрной. Вероятность гибридизации ГМ-рапса с Brassica oleracea Переопыление трансгенного рапса с преимущественным самоопылителем B. oleracea практически не исследовано, несмотря на то, что эти два вида весьма близки между собой. Возможность появления гибридов капусты с нетрансгенным рапсом подтверждено рядом исследований. Из 842 образцов листьев B. oleracea, обнаруженных на расстоянии 1-25 м от границы полей в Великобритании, был достоверно определён один гибрид с нетрансгенным рапсом (Ford et al., 2006). В Канаде в результате 1095 опылений капусты пыльцой брюквы (B. napus) был получен один гибрид. Когда растения B. napus использовались в качестве материнских, было получено 18 гибридов на 10187 опылённых цветов (Chiang et al., 1977). Вероятность гибридизации ГМ-рапса с Brassica juncea У горчицы сарептской B. juncea, которая возделывается в Азии, Сибири, США и Канаде, а также встречается в диком и сорном виде, перекрестное опыление в среднем достигает 30 %. Гибридизация с рапсом хорошо изучена и подтверждена многочисленными исследованиями популяций B. juncea, произрастающих в том числе на территории Канады (Bing et al., 1996), Турции (Liu et al., 2010), Новой Зеландии (Heenan et al., 2007). При совместном культивировании с озимым Bt-рапсом, полученным из сорта Westar, гибридными оказались в среднем 0,24 % семян B. juncea из дикорастущей китайской популяции (0,17 % растений в тепличном эксперименте и 0,52 % в полевом) (Shen et al., 2006). Позднее этим же коллективом учёных была исследована передача трансгенов в последующих поколениях. Гибриды, родительские растения, а также нетрансгенный рапс выращивались в условиях, имитирующих время после сборки урожая, когда могут появиться свободнорастущие экземпляры. Наибольшей выживаемостью отличалась дикорастущая B. juncea, гибриды же характеризовались средней выживаемостью и самой низкой репродуктивной способностью. В следующих поколениях показатели сравнялись. В третьем поколении из 115 потенциальных гибридов с 53 из 60 участков, 85 растений оказались гибридными (на 47 участках), девять растений с шести полей оказались полностью нетрансгенными (Di et al., 2009). В сходных исследованиях вероятность гибридизации была оценена в 1,252-2,328 % (Pu et al., 2005; Zhao et al., 2005) и 0,109-0,951 % (Huiming et al., 2007). В условиях теплицы путём обратного скрещивания с B. juncea были успешно получены четыре поколения растений. При обработке гербицидом признак устойчивости к нему стабильно наследовался по Менделю во втором и третьем поколениях. Первое поколение устойчивых к гербициду растений, полученных при обратном скрещивании, производило меньше стручков, чем дикие B. juncea, но во втором и третьем поколениях различий не наблюдалось. В третьем и четвертом поколении количество семян приблизилось к количеству, получаемому при самоопылении B. juncea, за исключением растений, унаследовавших устойчивость к гербицидам, которые производили меньшее количество семян. По всхожести семян различий не наблюдалось. Наличие фертильных трансгенных сорных растений уже в третьем поколении говорит о высокой вероятности распространения трансгенов в диких популяциях B. juncea. Было отмечено, что перенос признака устойчивости к глифосату более вероятен, чем признака устойчивости к глюфосинату. Также более вероятен перенос генов в случае последующего скрещивания гибридов с B. juncea в качестве материнского растения, так как в этом случае образуется большее количество семян (Song et al., 2010). В полевом эксперименте с устойчивым к гербициду рапсом сорта Drakkar количество гибридных семян, производимых датской популяцией B. juncea, зависело от соотношения количества растений рапса и горчицы сарептской на поле. В каждом случае было исследовано по 100 проростков из семян каждого из 10 материнских растений. При соотношении горчицы к рапсу как 1 : 3, процент гибридных проростков из семян B. juncea составил 2,3 %, при соотношении 1 : 10-1,1 % и при соотношении 1 : 15-0,3 %. Когда материнским растением являлся рапс, процент гибридных проростков составил 1,1, 1,1 и 1,3 % соответственно. Различные генетические маркеры рапса передавались при скрещивании гибридов с B. juncea с разной частотой (Jorgensen et al., 1996). В полевом эксперименте на территории Японии в первый год гибридов горчицы с рапсом обнаружено не было, во второй год, благодаря смещению периодов цветения по сравнению с первым годом, образовались устойчивые к гербициду гибриды: 36 (1,62 %) в смешанных посевах и 15 (0,306 %) в соседствующих. На расстоянии более 20 м гибридов обнаружить не удалось (Tsuda et al., 2012). Вероятность гибридизации ГМ-рапса с Raphanus raphanistrum Из диких родственников рапса, не относящихся к роду Brassica, дикая редька наиболее подробно исследована на предмет перекрестного опыления с ним. Гибриды между B. napus и R. raphanistrum были впервые получены в одном из ранних исследований, согласно результатам которого редька из французской популяции, располагавшаяся внутри участка с устойчивым к гербициду ГМ-рапсом, давала три гибрида на 100 растений. Рапс с мужской стерильностью, располагавшийся внутри участка с редькой, давал до 37 гибридов на растение. Плодовитость гибридов последующих поколений составила 0,4 и 2 % от показателя дикой редьки. В полевом эксперименте было получено два гибрида в случае, когда концентрация дикой редьки на поле была низкой (590 растений на гектар) и ни одного, когда концентрация была высокой. Это объясняется тем, что изолированное растение получает очень мало пыльцы от представителей своего вида. Таким образом, чем удачнее будет борьба с сорняками, тем выше шанс формирования гибридов. В таких условиях их количество может составлять от 0,006 до 0,2 % (Darmency et al., 1998). Гибридизация дикой редьки с ГМ-рапсом, устойчивым к гербицидам, была отмечена в двух других полевых экспериментах. В первом эксперименте из 32821 проростков семян R. raphanistrum из популяций Канады, Франции, Италии, России и Австрии, гибридным оказался только один (вероятность переноса трансгена составила 3 × 10-5). Это гибридное растение унаследовало устойчивость к гербициду, морфологически было схоже с дикой редькой, но имело перегородку в стручке, что свойственно B. napus. Жизнеспособность пыльцы составляла 0,12 %, самоопыления не происходило. В лабораторном эксперименте, а также при анализе дикой редьки вблизи фермерских полей, гибриды обнаружить не удалось (Warwick et al., 2003). В следующем эксперименте из 189 084 проростков семян редьки, произрастающей во Франции, был обнаружен только один устойчивый к гербицидам гибрид, росший на краю поля с ГМ-рапсом. Частота гибридизации могла составлять от 10-7 до 3 × 10-5. С рапсом в роли материнского растения скрещивание происходило чаще. Гибридными оказались все мелкие семена с диаметром менее 1,6 мм. На основе анализа 73847 проростков рапса, вероятность скрещивания была оценена на уровне от 2 × 10-5 до 5 × 10-4. Чаще всего переопыление происходило при наличии рядом групп дикой редьки (Chevre, 2000). Позже из семян устойчивого к гербицидам рапса с мужской стерильностью удалось получить более 500 межродовых гибридов. Геномная структура гибридов (от 24 до 80), а также доля гибридов, устойчивых к гербицидам (43,3-52,7 %), разнились в зависимости от линии ГМ-растения. Их женская фертильность была очень низкой - от 1,14 до 3,76 семян на растение при норме в несколько тысяч семян. Было получено 5 поколений гибридов, обладающих устойчивостью к гербицидам. В пятом поколении расщепление происходило также по Менделю. При обратном скрещивании количество хромосом уменьшалось по-разному в зависимости от линии родительского трансгенного растения (Chevre, 2007). В полевом эксперименте, проведённом на территории США с использованием 10 различных линий трансгенного рапса, содержащих GFP и Bt-трансгены, гибридных семян местной популяции R. raphanistrum обнаружено не было (Halfhill, 2004). В полевом опыте на территории Австралии на примере нетрансгенных растений рапса из 25000 семян дикой редьки также не было обнаружено ни одного трансгенного. При использовании же рапса в качестве материнского растения было получено два гибрида (вероятность составила менее 4 × 10-8) (Rieger et al., 2001). Гибриды были получены и в лабораторных экспериментах, так, при исследовании канадской популяции было получено два гибрида с рапсом в качестве материнского растения (0,44 гибрида на 100 опылённых цветов) (Lefol et al., 1997). Вероятность гибридизации ГМ-рапса с Hirschfeldia incana Во Франции исследовалось искусственное и спонтанное переопыление местной популяции гиршфельдии серой с двумя сортами ГМ-рапса, один из которых был устойчив к гербициду, второй же обладал мужской стерильностью. Опыты проводились как в лабораторных, так и в полевых условиях. В лаборатории при искусственном опылении H. incana пыльцой устойчивого к гербициду рапса было получено шесть гибридов на 100 цветков, при использовании рапса в качестве материнского растения - 2,3 гибрида на 100 цветков. В полевом же эксперименте в результате спонтанного опыления H. incana пыльцой рапса был получен один гибрид на одно растение (830 гибридов на гектар). При этом устойчивость к гербициду наследовалась, но фертильность гибридов была низкой и после обратного скрещивания с H. incana было получено в среднем 0,5 семян с растения. От 168 гибридов было получено 32 семени, из которых удалось получить пять проростков. В результате спонтанного переопыления в теплице на одно растение рапса с мужской стерильностью приходилось от 1,5 гибридов при равном соотношении рапса и H. incana и до 26 гибридов в случае преобладания H. incana. В полевом эксперименте при равном соотношении донора и реципиента пыльцы образовывалось 0,36 гибридов на одно растение рапса (Lefol et al., 1996a). За три года полевых экспериментов во Франции средний уровень спонтанной гибридизации с устойчивым к гербициду рапсом составил в среднем 0,6 гибридов на одно материнское растение местной популяции H. incana. После обратного скрещивания гибридов с H. incana через пять поколений трансген утрачивался (Darmency, Fleury, 2000). Таким образом, была показана возможность скрещивания рапса с гиршфельдией серой, которая могла выступать как в качестве донора, так и реципиента пыльцы. Вероятность гибридизации ГМ-рапса с Sinapis arvensis Теоретическая возможность перекрестного опыления трансгенного рапса с горчицей полевой упоминается во многих источниках, однако исследователи не добились заметных успехов в получении гибридов. В полевом исследовании был обнаружен один гибрид рапса и S. arvensis из естественной популяции Великобритании, оказавшийся трансгенным и устойчивым к гербициду, вероятность скрещивания была оценена в 0,0001 % (Daniels, 2005). В лабораторных условиях при искусственном опылении 10 209 растений S. arvensis пыльцой устойчивого к гербицидам ГМ-рапса Westar, гибридизации не произошло. Однако в результате 1127 опылений горчицы полевой пыльцой нетрансгенных сортов рапса, удалось получить один гибрид с сортом Strathclyde, имеющий 28 хромосом и морфологические признаки обоих родителей. При такой частоте переопыления, гибридные трансгенные семена могут составлять 0,015 % урожая S. arvensis. Однако полученный гибрид не производил пыльцу и семена. Также пыльца S. arvensis была искусственно перенесена на 5400 цветков каждого из шести сортов нетрансгенного рапса и 4280 цветков ГМ-рапса Westar 10. Семена были плохого качества и удалось получить лишь два растения, оказавшихся триплоидными гибридами (с ГМ-линией Westar и нетрансгенным сортом Falcon). У обоих гибридов было снижено количество пыльцы и семян (гибрид с ГМ-рапсом дал одно семя). При такой часто

About the authors

Elena Vladimirovna Mikhaylova

Bashkir State University

Email: mikhele@list.ru
Postgraduate, assistant, faculty of biology, ecology department

Bulat Razyapovich Kuluev

Institute of Biochemistry and genetics, Ufa Sci. Center of RAS

Email: Kuluev@bk.ru
Senior Researcher, laboratory of molecular biology and nanobiotechnology

Rashit Mukhametovich Khaziakhmetov

Bashkir State University

Email: eco3110@rambler.ru
Doctor of biological sciences, professor, faculty of biology, ecology department

References

Supplementary files