Obtaining of transgenic alfalfa for improved phytoremediation the petroleum contaminated soils

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Одним из последствий антропогенного воздействия является загрязнение окружающей среды нефтью и нефтепродуктами. Только по официальным данным, в России потери при добыче, транспортировке, хранении нефти и нефтепродуктов составляют от 5 до 9 млн тонн в год (Фомин, 1999; Stroud et al., 2007), а в мире теряется, загрязняя окружающую среду, в среднем 50 млн тонн нефти и нефтепродуктов ежегодно (Фомин, 1999). В настоящее время в России нуждаются в рекультивации около 1,2 млн гектар земель, имеющих разную степень нефтезагрязненности. Для очистки нефтезагрязненных почв обычно используют механические, физические, химические, биотехнологические, фитомелиоративные технологии. Рекультивация загрязненных нефтью территорий с помощью перечисленных выше подходов требует значительных материальных вложений, не всегда целесообразных, особенно если уровень загрязнения нефтью не превышает 50 г/кг грунта, а его площадь велика (Другов, Родин, 2011). Одним из перспективных и наиболее дешевых способов очистки нефтезагрязненных территорий является фиторемедиация, где для очистки используют растения и ассоциированные с ними микроорганизмы (Frick et al., 1999; Susarla et al., 2002). Несмотря на то, что в последнее время интерес к фиторемедиации нефтезагрязненных территорий сильно возрос, и проблема изучается с различных точек зрения, биотехнологические подходы, включающие генетическую инженерию, редко применяются для этих целей (Бричкова с соавт., 2003). Между тем генетическая инженерия зарекомендовала себя как перспективный способ получения растений для очистки территорий от тяжелых металлов, пестицидов и гербицидов (Abhilash et al., 2009; Cherian et al., 2005; Van Aken et al., 2004). Редкая встречаемость работ по очистке почвы от нефти связана с необходимостью поиска генов, кодирующих белки, воздействующие на группу гидрофобных веществ, входящих в состав нефти. Поскольку основным способом фиторемедиации почвы, загрязнённой нефтью, является ризодеградация, при которой корневые выделения растений создают благоприятные условия для развития микроорганизмов, участвующих в процессах трансформации углеводородов, то целесообразно получение трансгенных форм, способных продуцировать вещества, разрушающие высокомолекулярные фракции нефти, тем самым улучшая их доступность для микроорганизмов. Генетическая конструкция с одним из таких генов - геном рамнозилтрансферазы, контролирующим синтез биосурфактантов - рамнолипидов, из Pseudomonas aeruginosa (rhlА), была создана в Институте генетики и цитологии НАН Беларуси (Brychkova et al., 2004). Этими же авторами была показана принципиальная возможность получения трансгенных растений, способных к очистке почвы от нефти. Однако полученные растения являлись модельными объектами и не обладали свойствами, необходимыми для эффективной фиторемедиации. Люцерна посевная (Medicago sativa L.) широко используется для фиторемедиации нефтезагрязненных территорий, поскольку она устойчива к нефти, обладает хорошо развитой корневой системой, в ее ризосфере создаются благоприятные условия для развития микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов (Киреева с соавт., 2004; Shaw, Burns, 2003). При выращивании люцерны посевной почва обогащается азотом, что является важным условием для восстановления почвы, поскольку при загрязнении нефтью наблюдается дефицит элементов минерального питания (Муратова с соавт., 2003). Целью данной работы было создание биоремедиационного комплекса «растения-микроорганизмы» для очистки почвы от нефтезагрязнений, а также повышение эффективности данного комплекса путем введения в растения гена rhlА. Для этого необходимо было решить несколько задач: изучить фиторемедиационные свойства растений люцерны; оценить эффективность совместного использования растений люцерны посевной (Medicago sativa L.) и микроорганизмов Candida maltosa штамм 569 для биоремедиации нефтезагрязненных почв; исследовать возможность повышения фиторемедиационной способности за счет введения гена rhlA, контролирующего синтез рамнозилтрансферазы; изучить целесообразность использования комплекса «трансгенные растения с геном rhlA - микроорганизмы» для фиторемедиации почвы, загрязненной нефтью. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Объекты исследований В качестве объекта исследований использовали люцерну посевную (Medicago sativa L.) - многолетнее травянистое растение; семейства бобовые (Fabaceae). Это растение хорошо растет и развивается при 22-30 °С. В условиях достаточного увлажнения успешно переносит высокую температуру (37-42 °С). Обладает хорошей холодостойкостью (от -15 до -30 °С). В качестве микробной компоненты использовали нефтеокисляющие дрожжи Candida maltosa, которые широко распространены в воде и почве, загрязненных нефтепродуктами, и способны утилизировать широкий спектр углеводородов нефти. При этом известно, что при добавлении сурфактантов биодоступность нефти для Candida maltosa, а, следовательно, и скорость ее биодеградации, увеличивается (Chrzanowski et al., 2006). Постановка почвенных опытов Для почвенных опытов семена люцерны проращивали на смоченной водой фильтровальной бумаге, 14-дневные проростки для доращивания переносили в специальные контейнеры с дренажем, куда заливали 1/2 раствор макро- и микросолей по Шенку и Хильдебрандту (SH) (Schenk, Hildebrandt, 1972) и выращивали в течение месяца при +23 °С и освещенности 10 000-15 000 лк, после чего их высаживали в почву. Эксперименты с нефтезагрязненным грунтом проводили в специальных емкостях-лотках, куда вносили 400 г. нестерильной почвы и нефть в количестве 4 % масс. Затем высаживали растения по 10 штук в лоток и помещали в термостатированное помещение при температуре +26 °С. Продолжительность экспериментов составляла 56 суток. Опыты проводили в 3-х повторностях. Использованная в работе нефть была получена от Московского нефтеперерабатывающего завода (МНПЗ) и имела следующие характеристики: удельный вес - 0,83 г/см3; суммарное содержание углеводородов - 81,2 %, в том числе: n-алканов - 9,3 %; изоалканов - 7,9 %; нафтенов - 11,7 %; ароматических углеводородов - 64 %; содержание смол - 3,1 %; содержание асфальтенов - 4,0 %. Деградацию нефти исследуемыми штаммами и растениями оценивали по снижению содержания нефти в грунте (почве) и выражали в % относительно начального количества. Определение проводили с помощью гравиметрического метода (Другов, Родин, 2011). Получение асептического материала Для получения асептического материала семена люцерны помещали в 70 % этиловый спирт на 30 с, затем переносили в раствор коммерческого отбеливателя «Белизна» (7-9 % активного хлора) на 30 минут, после чего их 3 раза промывали стерильной дистиллированной водой. Стерильные семена проращивали на среде SH c половинной нормой макро- и микроэлементов и без сахарозы. Подбор питательных сред для получения растений-регенерантов люцерны Растения-регенеранты люцерны получали с помощью прямой регенерации. В качестве эксплантов использовали семядоли семидневных проростков, которые высаживали на модифицированную среду SH с гормонами: 3 мг/л БАП и 0,1 мг/л НУК и 10 г/л сахарозы (Орлова, Степанова, 2012). Регенерировавшие побеги для укоренения пересаживали в стерильные сосуды объемом 100 мл на безгормональную среду SH с половинным содержанием макро- и микроэлементов и 5 г/л сахарозы. Полностью сформированные растения перед высадкой в почву адаптировали в воде в течение 10-14 дней. Частоту регенерации определяли как отношение числа регенерантов к общему числу эксплантов. Каждый опыт повторяли не менее трех раз, каждая повторность включала не менее 100 эксплантов. Генетическая конструкция Для трансформации использовали штамм Agrobacterium tumefaciens LBA4404, содержащий бинарный вектор pBI121 с селективным геном nptII, который кодирует фермент неомицинфосфотрансферазу, обеспечивающую устойчивость к канамицину, под промотором NOS и целевым геном rhlA под промотором 35S вируса мозаики цветной капусты. Штамм LBA4404 выращивали на агаризованной питательной среде YM (Vincent, 1970) с антибиотиками 100 мг/л стрептомицина и 50 мг/л канамицина. Перед трансформацией суспензионную культуру агробактерии наращивали в течение 24 часов при +23 °С на качалке с круговым вращением (амплитуда 5-10 см, скорость вращения 100 об/мин.) с антибиотиками в той же концентрации. Трансформация люцерны Для получения трансгенных растений люцерны использовали инкубацию эксплантов в суспензии и на газоне агробактерии (см. результаты и обсуждение). Канамицин-устойчивые растения с хорошо сформированными корнями рассматривали в качестве потенциальных трансформантов и отбирали для ПЦР-анализа на наличие вставки трансгена. Частоту трансформации оценивали как отношение числа канамицин-устойчивых растений-регенерантов к общему числу эксплантов, инокулированных агробактерией, и выражали в процентах. Анализ канамицин-устойчивых растений люцерны методом ПЦР Трансформанты, устойчивые к канамицину, проверяли на наличие последовательностей генов rhlA и nptII методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). ДНК трансформированных растений выделяли из 50 мг молодых листьев (Moller et al., 1992). Для анализа трансформантов методом ПЦР применяли следующие пары праймеров: rhlA-Dir 5’-TGC-GGC-TCC-GGT-TGC-TTC-AG-3’, rhlA-Rev 5’-CGC-GGG-TTG-ATC-ACC-AAG-GAC-3’ (для гена rhlA); nptII-Dir 5'-GTG-GAG-AGG-CTA-TTC-GGC-TA-3', nptII-Rev 5'-CCA-CCA-TGA-TAT-TCG-GCA-AG-3' (для гена nptII). Праймеры были синтезированы НПФ «Литех» (Россия). Для амплификации использовали Taq-полимеразу и 10-кратный буфер с Mg2+ (700 ммоль/литр Трис-HCl, pH 8.6 при 25 °С, 166 ммоль/литр (NH4)2SO4, 25 ммоль/литр MgCl2) и dNTP компании «Силекс». Амплификацию проводили в программируемом термоциклере Терцик (ЗАО «ДНК-Технология», Россия) при следующих условиях: первичная денатурация 2 мин при 94 °С; 5 циклов: денатурация 20 с при 94 °С, отжиг 10 с при 60-65 °С, элонгация 10 с при 72 °С; 35 циклов: денатурация 5 с при 94 °С, отжиг 5 с при 60-65 °С, элонгация 5 с при 72 °С; заключительная элонгация 2 мин при 72 °С. Продукты реакции разделяли электрофорезом в 2%-ном агарозном геле с 0,01 % бромистым этидием в 1Х буфере ТВЕ. Для определения длины фрагментов использовали маркер M26 (100 bp + 2 Kb + 3 Kb ДНК Маркер) «СибЭнзим» (Россия). Для проверки чистоты реактивов в качестве отрицательного контроля (К-) в реакционную смесь вместо исследуемой ДНК добавляли 2 мкл воды. Анализ транскрипции генов методом ОТ-ПЦР Транскрипцию целевого гена rhlA определяли с помощью метода обратно-транскрипционной ПЦР (ОТ-ПЦР). Для этого проводили выделение тотальной РНК фенольным методом (Krapp et al., 1993) из 400 мг молодых листьев. Очистку полученной РНК от ДНК-примесей осуществляли с помощью набора EN0525 (Fermentas) по протоколу изготовителя. Синтез первой цепи кДНК осуществляли с помощью набора реагентов K1512 (Fermentas) по методике изготовителя. Амплификацию и разделение продуктов реакции проводили аналогично описанному выше ПЦР-анализу. Определение содержания рамнозы Для определения использовали фотоэлектроколориметрический метод с применением антронового реактива (Hodge, Hofreiter, 1962). Оптическую плотность раствора определяли на фотоэлектроколориметре с длиной волны 625 нм. Содержание рамнозы рассчитывали по заранее построенному калибровочному графику. Статистическая обработка данных Статистическую обработку данных проводили с помощью компьютерной программы Microsoft® Excel. В тексте приведены средние арифметические величины параметров. Бары на диаграмме соответствуют максимальным величинам доверительных интервалов при 95 %-ном уровне вероятности по t-критерию Стъюдента. Все эксперименты проводили не менее чем в трехкратной повторности. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Получение трансгенных растений люцерны Первые работы по получению трансгенных растений люцерны с помощью Agrobacterium tumefaciens относятся к 80-90-м годам прошлого века (Deak et al., 1986; Shahin et al., 1986). Однако работы носили поисковый характер - частота трансформации была небольшой, генетические конструкции (вектора) содержали только селективные или репортерные гены. В настоящее время, несмотря на обилие публикаций по успешной агробактериальной трансформации люцерны (Rosellini et al., 2007; Zhang et al., 2010), все еще имеются трудности, связанные с необходимостью индивидуального подбора условий трансформации в зависимости от генотипа, типа экспланта, штамма агробактерии и вектора для трансформации (Nincovic et al., 2004; Ziauddin et al., 2004). В литературе описаны следующие основные подходы, применяемые при агробактериальной трансформации: инкубация эксплантов в суспензии агробактерии (Faragova et al., 2011; Liu et al., 2013; Zhang et al., 2010) в условиях вакуумной инфильтрации; культивирование на газоне агробактерии (Trinh et al., 1998); в редких случаях - трансформация in planta (Weeks et al., 2008). В качестве эксплантов обычно используют эмбриоиды, каллусы, семядоли, гипокотили, листовые диски, а также проростки и семена (Nincovic et al., 2004; Ziauddin et al., 2004; Uzelac et al., 2007). В нашей работе были использованы две основные схемы агробактериальной трансформации. Для активации vir-области перед трансформацией в обоих случаях в суспензионную культуру агробактерии добавляли экстракт из листьев табака (Messens et al., 1990). Первый вариант предусматривал совместную инкубацию эксплантов (каллусов и семядолей) в суспензии агробактерии в условиях вакуумной инфильтрации (до -0,8 атм.) в течение 40 минут. После вакуумной инфильтрации экспланты высаживали на твердую питательную среду SH без антибиотиков и выдерживали в течение 1-3 суток на сформировавшемся газоне агробактерии, затем пересаживали на ту же среду, но с добавлением антибиотика цефотаксима (500-700 мг/л) и канамицина 100 мг/л. По этой схеме было обработано 248 каллусов и 257 семядолей, но не было получено растений-регенерантов, поскольку экспланты теряли способность к морфогенезу в результате токсического действия бактерии. Во втором варианте экспланты помещали на газон агробактерии на сутки, затем пересаживали на среду SH c 3 мг/л БАП и 0,1 мг/л НУК с 10 г/л сахарозы с цефотаксимом (500-700 мг/л). После появления побегов, их высаживали на ту же среду, но с добавлением и цефотаксима (300 мг/л), и канамицина (100 мг/л) и выдерживали в течение месяца. Зеленые побеги переносили на среду для укоренения с обоими антибиотиками. При использовании в качестве эксплантов семядолей было получено 290 растений-регенерантов, из которых 61 растение оказалось канамицин-устойчивым (табл. 1). Увеличение времени совместного культивирования семядолей на газоне агробактерии до 48-72 часов приводило к потере возможности регенерации, возможно, из-за токсического действия агробактерии на экспланты. Из каллусов, как и в случае предыдущей трансформации, не удалось получить растений-регенерантов (табл. 1, опыты 7, 8), в результате сильного зарастания Agrobacterium tumefaciens. Укоренившиеся регенеранты проверяли на наличие генов nptII и rhlA с помощью ПЦР (рис. 1). Было показано, что 58 % канамицин-устойчивых растений содержали ген nptII и только 32 % nptII+rhlA (рис. 1). Транскрипцию целевого гена rhlA оценивали с помощью метода ОТ-ПЦР. Было показано, что интродуцированный ген rhlA транскрибируется у большинства ПЦР-положительных растений (рис. 2, 3). Известно, что в некоторых случаях присутствие сигнала о наличии генов при проведении ПЦР зависит не от встроенной в геном растений Т-ДНК, а от присутствия A. tumefaciens в растительных тканях. Поэтому для оценки возможности присутствия A. tumefaciens, используемой для трансформации, в растениях люцерны после культивирования на среде с цефатоксимом проводили ПЦР-анализ полученных растений с праймерами к агробактериальному гену VirD2. Результаты данного анализа показали, что агробактерия отсутствует в тканях растений-трансформантов (данные не приведены). Таким образом, двухнедельное культивирование на среде с 500-700 мг/л цефатоксима приводило к полной элиминации агробактерий. Поскольку ген rhlA кодирует фермент рамнозилтрансферазу, которая участвует в биосинтезе рамнолипидов, нами была проведена оценка их содержания по количеству выделяемой рамнозы. Надо отметить, что, по данным литературы, рамноза присутствует в экссудатах растений (Vancura, 1964). Это было показано и в наших экспериментах: контрольные растения и растения с геном rhlA секретировали рамнозу. Тем не менее ее содержание в воде в случае выращивания трансгенных растений было выше в 8,9 раз по сравнению с контролем. Среднее содержание рамнозы составляло 16,6 мг/мл и 147,5 мг/мл для контроля и растений с целевым геном, соответственно. Примерное содержание рамнолипидов с учетом поправочного коэффициента (2,25), предложенного Deziel et al. (Deziel et al., 2000) для липидной компоненты, составляет 37,3 и 332 мг/л для контроля и растений с rhlA. Для сравнения: количество рамнолипидов, выделяемых в среду микроорганизмами-деструкторами нефти Pseudomonas sp., может варьировать от 2 до 600 мг/л в зависимости от температуры и рН среды (Ochsner, Reiser, 1995; Wang et al., 2007) и доходить до 1500 мг/л в случае трансгенных бактерий с rhlAB (Wittgens et al., 2011), что вполне соответствует нашим данным, полученным на люцерне. Оценка фиторемедиационных свойств трансгенной люцерны В следующей части работы необходимо было оценить биоремедиационный потенциал трансгенных и нетрансгеных растений люцерны, а также комплекса с микроорганизмами Candida maltosа в качестве тест-культуры. Известно, что эффективные деструкторы нефти встречаются как среди бактерий, так и среди грибов, но большинство исследований сконцентрировано на бактериях. Среди бактерий часто встречаемыми являются: Pseudomonas fluorescens, P. aeruginosa, Bacillus subtilis, Bacillus sp., Alcaligenes sp., Acinetobacter sp., Flavobacterium sp., Micrococcus roseus (Das, Chandran, 2011); среди грибов: Candida, Yarrowia, Pichia (Chaillan et al., 2004). Хотя, согласно некоторым авторам, перспективнее использовать грибы, поскольку они утилизируют больший круг углеводородов (Chrzanowski et al., 2006). В качестве контроля служила почва с нефтью, но без растений. Было показано, что даже без применения специальных мер, за счет деятельности аборигенной микрофлоры наблюдалось снижение содержания в почве нефтепродуктов на 15 % к 56 суткам, что свидетельствует о высокой способности к деструкции нефти микроорганизмами почвы (рис. 4). При выращивании нетрансгенных растений люцерны в загрязненном грунте наблюдалось более отчетливое снижение содержания нефти, после 56 суток в почве оставалось 50,5 % нефти по сравнению с первоначальным уровнем. Полученные результаты подтверждают высокий фиторемедиационный потенциал люцерны. Однако применение только Candida maltosа позволило повысить утилизацию нефти до 62 %, что выше, чем при использовании растений. При совместном выращивании люцерны и микроорганизмов деградация нефти была еще больше и составила 69 %, что свидетельствует о благоприятном влиянии растений на утилизацию нефти грибами Candida maltosа. Интересно, что при выращивании только трансгенных растений люцерны утилизация нефти составляла 71 %, что сопоставимо с результатами, полученными на микроорганизмах, и выше, чем при использовании нетрансгенных растений. Следовательно, наши предположения о том, что выделение биосурфактантов должно способствовать утилизации нефти, за счет повышения ее биодоступности, оказалось верным. Это подтверждается и прямыми экспериментами, когда добавление к трансгенным растениям Candida maltosa позволило увеличить деградацию нефти до 86 %. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В настоящей работе предложен подход для повышения эффективности фиторемедиации нефтезагрязненных территорий. В основу этого подхода легло представление о том, что основным механизмом фиторемедиации почвы, загрязнённой нефтью, является ризодеградация. Следовательно, улучшение взаимодействия между растениями и микроорганизмами могло способствовать ускорению деструкции углеводородов нефти. Для этого были получены трансгенные растения люцерны с геном rhlA, ответственным за синтез биосурфактантов - рамнолипидов. Предполагалось, что выделяемые трансгенными растениями биосурфактанты солюбилизируют углеводороды нефти, облегчая их доступность для микроорганизмов-деструкторов нефти. Действительно, трансгенные растения улучшали фиторемедиацию, а в комплексе с микроорганизмами-деструкторами нефти Candida maltosa значительно повышали утилизацию нефти в почве (до 86 %), что свидетельствует о перспективности использования комплекса «трансгенные растения - микроорганизмы» для биоремедиации. Таким образом, повышение эффективности взаимодействия между растениями и микроорганизмами посредством получения трансгенных растений является перспективным для фиторемедиационных технологий и представляет интерес для теоретических исследований.

About the authors

Anna Yurievna Stepanova

Timiryazev institute of plant physiology, RAS

Email: step_ann@mail.ru
senior researcher, PhD, group of specialized metabolism of roots

Ekaterina Vladimirovna Orlova

Timiryazev institute of plant physiology, RAS

Email: ekatia@inbox.ru
researcher, group of specialized metabolism of roots

Dmitriy Viktorovich Tereshonok

Timiryazev institute of plant physiology, RAS

Email: diman_ter_vi@mail.ru
researcher, PhD, laboratory of genetics of cell cultures

Yulia Ivanovna Dolgikh

Timiryazev institute of plant physiology, RAS

Email: ivan-d1@yandex.ru
head of the lab, prof., MD, group of specialized metabolism of roots

References

Supplementary files