The genetic structure of populations of specially protected species Androsace kozo-poljanskii ovsz. in conditions of the south at the central Russian upland using dna markers

Full Text

Оценка состояния популяций уязвимых видов в настоящее время включает комплекс исследований различных сторон их биологии. Одним из важных аспектов такого подхода является изучение популяционных генофондов этих видов, позволяющих с той или иной долей вероятности спрогнозировать дальнейший ход генетических флуктуаций и оценить шансы на выживание этих видов в биосфере. Целью настоящей работы является анализ состояния генофондов популяции особоохраняемого травянистого растения проломника козо-полянского (Androsace kozo-poljanskii Ovсz. [1]), обитающего в условиях юга Среднерусской возвышенности. Проломник козо-полянского является эндемичным видом для Среднерусской возвышенности. Относится к так называемой горно-альпийской флоре, сформировавшейся на территории Среднерусской возвышенности в ледниковую эпоху. Этот вид растет на вершинах и склонах меловых холмов, обычно на открытых или полузадернованных участках, предпочитает разреженный травянистый покров. На территории района исследования вид представлен локальными популяциями, четко отграниченными друг от друга значительными по протяженности территориями. A. kozo-poljanskii внесен в Красную книгу России и Белгородской области (ограничивающими факторами являются интенсивный выпас скота и разработка меловых карьеров). Встречается в Воронежской, Курской и Белгородской областях в бассейне правых притоков Среднего Дона, в верховьях Оскола и Северского Донца (Виноградов, Голицин, 1954; Голицын, 1956). Материал и методика В качестве материалов для исследований были использованы листья растений, собранные в десяти пунктах Белгородской области (рис. 1, табл. 1). Сбор растений производился в мае 2013 года. Все собранные образцы хранятся в криобанке лаборатории популяционной генетики и генотоксикологии НИУ БелГУ. Всего по ДНК-локусам было исследовано 438 особей [2] A. kozo-poljanskii из десяти популяций (см. рис.1, табл. 1). Анализ изменчивости проводили с использованием полимеразной цепной реакции - метод ISSR (Inter simple sequence repeats) (Zietkiewicz et al., 1994). Для анализа использовали два праймера: IT1 (5´-(CA)8GT-3´) и UBC 820 (5΄-(GA)8C-3΄). Амплификацию осуществляли в термоциклерах MJ Mini и MyCycler (Bio-Rad, США). Реакцию проводили в 25 мкл смеси, содержащей 20 нг геномной ДНК, ПЦР-буфер (67 мМ трис-НСl (рН 8,8), 16 мМ (NH4)2SO4, 5 мМ β-меркаптоэтанола, 7 мМ ЭДТА, 3 мМ MgCl, 0,25 мМ dNTP, 0,5 мкМ праймера, 1 единицу Taq ДНК-полимеразы (ингибированной для горячего старта). Реакция проходила в следующих условиях: «горячий старт» - 2 мин/94 ºС, 40 циклов (денатурация - 30 с/94 ºС, отжиг праймера - 30 с/55 ºС, синтез - 2 мин/72 ºС), дополнительный синтез - 10 мин/72 ºС, охлаждение - до 4 ºС. Продукты ПЦР разделяли с помощью электрофореза в 2 % агарозном геле с использованием ТАЕ-буфера (охлажденного до +4 °C), 10 В/см - 45 мин. Блоки окрашивали бромистым этидием. По картинам амплифицированных фрагментов, полученных в ходе электрофореза, составляли бинарные матрицы, где присутствие полосы обозначалось как «1» (аллель p), отсутствие «0» (аллель q). У данного вида нами обнаружен 41 локус: 21 - с использованием праймера IT1 и 20 - с использованием праймера UBC 820. Полученные ДНК-паттерны и их расшифровка приведены на рисунке 2. Обработка полученных данных проводилась с использованием программы GenAlEx (Peakall, Smouse, 2001), POPGENE 32 (Yeh et al., 2000), MEGA5 (Tamura et al., 2011). Полученные результаты и их обсуждение На первом этапе был проведен тест на нейтральность Эвенса-Ваттерсона (Ewens, 1972; Watterson, 1978; Manly, 1985) используемых локусов, который показал, что по большинству аллелей (в среднем 91 %) нет статистически значимых отличий между наблюдаемой гомозиготностью по Харди-Вайнбергу и гомозиготностью, ожидаемой при нейтральном процессе (табл. 2). Оценки ожидаемой гетерозиготности различных локусов и уровня подразделенности популяций, полученные на основе модели М. Неи (Nei, 1975) (табл. 3), также могут давать определенное представление о степени выраженности селективных процессов в изучаемых группах по используемым ДНК-маркерам. Известно, что средние величины Gst соответствуют уровню генетической дифференциации при селективно-нейтральном процессе. В таком случае локусы с большими значениями Gst, вероятнее всего, могут испытывать действие дизруптивного отбора, а локусы с низкими показателями индекса подразделенности подвержены влиянию стабилизирующего отбора (Динамика популяционных генофондов…, 2004). Согласно полученным данным, наибольшая дифференциация между популяциями зафиксирована по локусам It1-1 и UBC 820-7, -11. При этом наиболее изменчивыми были локусы It1-16 и UBC 820-6, -12. Значения показателей генетической гетерогенности представлены в таблице 4. Данные демонстрируют, что по всем показателям генетического разнообразия популяции достоверно не отличаются друг от друга (при p = 0,05). Таким образом мы наблюдаем определенное сходство географически изолированных групп проломника. Можно предположить, что в недавнем прошлом популяционные ареалы данного растения в районе исследования были намного больше и между группами происходил интенсивный обмен генетической информацией, что вело к формированию подразделенной панмиктической популяции в районе исследования, которая в большей степени соответствовала островной модели. Затем, в результате изменения климата и влияния человека, произошло дробление населения вида на изолированные группы, вплоть до полного прекращения обмена генами между ними. Однако темпы снижения уровня гетерозиготности, вызванные дрейфом генов в результате инбридинга, могли быть одинаковыми в изучаемых популяциях и после их изоляции. Различия, вероятно, были нивелированы большим количеством особей в изучаемых группах (все изучаемые нами популяции представлены обширными зарослями, протяженностью сотни метров и имеющими в своем составе тысячи куртин). Генетическую близость изучаемых популяций A. kozo-poljanskii демонстрирует и анализ молекулярной дисперсии (AMOVA, Excoffier et al., 1992) (табл. 5). Только 14 % изменчивости пришлось на межпопуляционные различия, при этом индекс подразделенности Фst = 0,136, а уровень потока генов между популяциями Nm = 1,588 особи за поколение. Еще более слабую генетическую дифференциацию исследуемых групп проломника показал анализ на основе модели M. Неи (Nei, 1975) (см. табл. 3), согласно которой индекс подразделенности (Gst) равен 0,091, а Nm = 5,022 особи за поколение. Стоит отметить, что согласно «теории эволюции со смещающимся равновесием» (Wright, 1970) для поддержания панмиксии в метапопуляции требуется поток генов 1-2 особей за поколение. В нашем случае, несмотря на высокие оценки Nm, вряд ли можно говорить об интенсивном обмене генами между изолированными группами проломника (межпопуляционные географические дистанции здесь варьируют от 4 до 140 км). Такую общую схожесть генетической структуры, вероятно, можно объяснить либо сходными векторами естественного отбора, происходящими в популяциях, связанных единой ландшафтной структурой, либо их сравнительно недавним разобщением. Степень генетической близости между изучаемыми популяциями A. kozo-poljanskii показывают также попарные оценки генетической дифференциации Фst (табл. 6). Согласно полученным данным наиболее оригинальной и отличной от других популяций является группа из окрестностей с. Хмелевое (пункт 1). Аналогичный результат демонстрируют результаты кластерного анализа на основе генетических расстояний (Nei, 1978) невзвешенным парногрупповым методом (UPGMA) (рис. 3), а также полигоны Дебеца, построенные по частотам q-аллеля (рис. 4). При этом выявляется одна закономерность. Наибольшее генетическое сходство наблюдается между группами, располагающимися в одних и тех же долинах рек или их притоков. Например, пункты Погромец (№ 8) и Конопляновка (№ 9) располагаются в долине реки Оскол, пункты Озерово (№ 4) и Гнездиловка (№ 5) - в долине реки Северский Донец, пункты Белая Гора (№ 7) и Новохуторное (№ 6) - в долине реки Тихая Сосна. При этом довольно обособленная группа из окрестностей с. Свистовка (№ 3) оказалась в «оскольском» кластере. Группы, обитающие в бассейне реки Оскол, популяции Ямская Степь (№ 2) и Балка Ханова (№ 10) оказались также генетически близки (хотя и удаленными от других групп этого бассейна № 8 и 9), а популяция Хмелевое (№ 1) по соотношению частот аллелей дистанцировалась от всех изученных групп. Тем не менее, несмотря на указанное выше расположение, географическая близость популяций не являлась решающим фактором, обусловливающим близость генетическую. То есть относительно большая генетическая дистанция наблюдалась как между географически близко расположенными группами, так и удаленными. Данный вывод подтверждается графиком прямолинейной регрессии (рис. 5), который демонстрирует слабую корреляцию (r = -0,276) между логарифмами географических расстояний G между популяциями и логарифмами попарных показателей уровня потока генов Nm между ними, вычисленными через попарные индексы дифференциации Фst. Это демонстрирует нарушение модели изоляции расстоянием в популяционной структуре A. kozo-poljanskii и усиление роли стабилизирующего отбора в его популяциях. В этой связи стоит отметить следующее. Выявленная генетическая близость между популяциями, относящимися к одним и тем же бассейнам рек, может свидетельствовать о том, что в прошлом расселение проломника, вероятно, проходило по речным долинам, в результате чего сформировались панмиктические группы, приуроченные к данным элементам ландшафта[3]. После дальнейшего дробление популяционных ареалов оставшиеся группы сохранили сходный аллельный набор. В результате популяции, находящиеся рядом, но в разных речных долинах, оказались более генетически различными, чем географически более удаленные популяции, но находящиеся в одной долине. Кроме того, нельзя исключать того, что перенос пыльцы и семян вдоль речных долин проходит в настоящее время, что обусловливает ограниченный поток генов между некогда едиными, а ныне разделенными популяциями проломника. Однако последний вывод требует определенной доли осторожности и экспериментального подтверждения возможности переноса семян и пыльцы этого растения на столь большие расстояния. Ввиду того что для анализа жизнеспособности популяций A. kozo-poljanskii были использованы выборки ограниченной численности, содержащие лишь небольшую часть популяционного аллелофонда, нами был проведен анализ мультилокусной изменчивости. Для этого были рассчитаны мультилокусные комбинации для каждой из 438 особей. Затем в каждой группе было оценено общее количество мультилокусных генотипов (NMLG) и число уникальных мультилокусных генотипов (NMLG-1), т. е. тех комбинаций, которые были отмечены в одной-единственной выборке. В дальнейшем, основываясь на распределении частот мультилокусных генотипов, для каждой популяции было вычислено потенциальное генетическое разнообразие, ожидаемое при увеличении объема выборки до бесконечности (Nmax). Анализ проводили с помощью двух непараметрических методов: метод Chao1-bc (bias-corrected form for the Chao1) (Chao, 2005) и метод «сломанного ножа» первого порядка (1st order jackknife) (Burnham, Overton,1978). Все расчеты были проведены с помощью программы SPADE (Chao, Shen, 2009). Результаты анализа мультилокусных генотипов представлены в таблице 7. Анализ продемонстрировал, что общее количество мультилокусных генотипов, количество уникальных комбинаций и, соответственно, максимально возможное количество комбинаций значительно выше по праймеру It1. Стоит отметить, что И.И. Шмальгаузен (1968) назвал аллельное разнообразие «мобилизационным резервом» популяции, обеспечивающим ей более стабильное существование во времени. По нашим данным, среди изученных популяций наиболее потенциально богатым генофондом обладают группы из окрестностей с. Хмелевое (№ 1) и из заповедного участка Ямская Степь (№ 2). Самой мономорфной оказалась группа Балка Ханова (№ 10). Мультилокусные генотипы, полученные с помощью праймера UBC 820, оказались более однообразными. Среди изученных популяций по этому праймеру наиболее полиморфной оказалась популяция Белая Гора (№ 7), а самой мономорфной - популяция Гнездиловка (№ 5). Стоит отметить, что при объединении комбинаций, полученных при использовании обоих праймеров, нам не удалось получить значимых отличий между популяциями. Фактически в каждой группе количество отмеченных комбинаций (NMLG и NMLG-1) было равно объему выборки, и максимально возможное число мультилокусных генотипов стремилось к бесконечности. Очень важной проблемой, решаемой в ходе мониторинговых мероприятий, проводимых в природоохранном аспекте, является оценка эффективной численности популяций изучаемых видов, т. е. минимальной численности, необходимой для выживания вида. С генетической точки зрения под эффективной численностью понимают численность идеальной популяции, в которой уровень дрейфа генов соответствует таковому в реальной популяции (Write, 1931). Именно такое понимание эффективной численности позволяет более объективно подходить к разработке программ по сохранению видового разнообразия. Кроме того, эти знания очень полезны для контроля за искусственным разведением, а также для изучения эволюционных процессов, происходящих в естественных популяциях. В своей оценки эффективной численности мы использовали два подхода. Первый способ расчета основан на коэффициентах линейной функции между попарными оценками потока генов (Nm) и географического расстояния между популяциями (G): log Nm = a + b · log G. М. Слаткин (Slatkin, 1993) показал, что эффективную численность популяции (для всех исследованных популяций в целом) можно получить как Ne = 10a, где а - коэффициент, полученный в уравнении. Исходя из уравнения, приведенного на рисунке 5, эффективная численность (Ne) оказалось равной 4,9 особи. Несколько иной результат был получен при вычислении эффективной численности с помощью интегральной модели, основанной на значениях индекса подразделенности популяции (Wright, 1951): Fst = , 1 - tk 1 + tk где tk = exp - Ne 1 [ln(K - 0,5) + 0,5772] + + 2 ∙ Ne2 1 1,6449 - + 2 ∙ K - 1 2 + 3 ∙ Ne3 1 1,202 - , (2 ∙ K - 1)2 2 где K - количество использованных популяций. Ввиду того что для определения степени подразделенности популяций в данной работе нами вместо индекса Fst было задействовано два других интегральных и взаимозаменяемых показателя Gst и Фst, мы сочли возможным модифицировать указанную формулу, внося в нее поочередно значения этих индексов. В результате эффективная численность (Ne), вычисленная по индексу Gst, оказалась равной 20,4 особи, а по индексу Фst - 13,7 особи, что значительно больше, чем аналогичное значение, вычисленное по уравнению регрессии (4,9). Тем не менее полученные оценки эффективной численности входят в диапазон эффективного размера популяций, рассчитанного для травянистых растений (от 3 до 282 особей) (Silvertown, 1993). Полагаем, что полученные результаты могут быть полезными в ходе наблюдений за состоянием популяций A. kozo-poljanskii, а также возможной интродукции этого вида с целью его восстановления в элементах ландшафта юга Среднерусской возвышенности.

About the authors

Edward A Snegin

Belgorod national research university

Email: snegin@bsu.edu.ru
Dr.Biol.Sci., the senior lecturer, the head of department of ecology, physiology and biological evolution

Elena A Snegina

Belgorod national research university

Email: sneginа@bsu.edu.ru
assistant of department of ecology, physiology and biological evolution

Tatiana A Novomlinskaya

Belgorod national research university

Email: sneginа@bsu.edu.ru
undergraduate of department of ecology, physiology and biological evolution

References

Supplementary files