Термофильные аэробные органогетеротрофные бактерии антропогенно измененных территорий Санкт-Петербурга и Ленинградской области

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

По результатам многочисленных исследований антропогенно измененных почв и грунтов в различных климатических зонах известно, что состав микробного сообщества, в частности, консорциума нефтедеструкторов, различен [1–4]. Большинство микроорганизмов, обитающих в удаленных от геотермальных районов местах, — мезофилы, растущие при температурах от 0–10 до 40–45 °C, при обычном оптимуме в 37 °C [5, 6]. Термофильные микроорганизмы считаются экологически обособленной группой микроорганизмов, оптимальная температура роста умеренно-термофильных бактерий составляет 50–75 °C, а для экстремально-термофильных и гипертермофильных бактерий и архей она находится в диапазоне 75–105 °C, максимальная температура достигает значений 100 °C и выше [5, 6]. Главные отличительные особенности этих групп — специфический химический состав и прочность клеточных мембран, термостабильные белки и ферменты, повышенное содержание липидов в клеточной стенке, содержание насыщенных жирных кислот и ускоренный обмен веществ, позволяющий в том числе быстро восстанавливать поврежденные клеточные структуры [6].

Естественными местообитаниями термофильных микроорганизмов в условиях современной биосферы являются горячие источники, глубоководные гидротермы, высокотемпературная подземная биосфера, а также экосистемы, связанные с деятельностью человека, — компосты, сточные воды, места хранения навоза, торфа, сена [5]. Многочисленные исследования показали присутствие термофильных микроорганизмов в различных географических зонах, таких как Индонезия, Новая Зеландия, Мексика, Китай, Непал, Таиланд, Индия, КНР, Япония, Турция, Алжир, Саудовская Аравия, Иран, Тунис, Германия, Италия, Болгария, Россия, Армения, Казахстан, Антарктида [6–37]. Обнаруженные микроорганизмы — это преимущественно представители микробиоты горячих источников, пластовых вод высокотемпературных нефтяных месторождений и экосистем, сопряженных с ними, однако среди них присутствуют и обитатели почв и даже вод подледного озера [21], что указывает на приспособленность этих микроорганизмов к самым различным условиям местообитания. Так, по литературным данным, присутствие термотолерантных бактерий было подтверждено и в почвах северных регионов [38], что предположительно связано с антропогенным воздействием и климатическими изменениями. Исследование микроорганизмов, адаптированных к климатическим условиям конкретного региона необходимо учитывать для выбора системы биоремедиации нефтезагрязненных почв и использования в ней препаратов, основанных на внесении микробных культур [19]. При этом термофильные микроорганизмы, одной из основных характеристик которых является быстрый метаболизм, могут существенно ускорить разложение нефтепродуктов в почве. Ранее присутствие термофильных углеводородокисляющих микроорганизмов в почвах Санкт-Петербурга уже было выявлено нами [39], но тем не менее в целом их представителей, обитающих в почвах тех северных регионов, где отсутствует геотермальная активность, все еще считают малоисследованными.

Известно, что в естественных условиях в южных районах, где термофильные микроорганизмы — типичные обитатели, поверхность почвы может прогреваться солнечной радиацией до 60–75 °C [40, 41], а в северных — до 46–57 °C [42, 43], при этом на прогревание закономерно влияет также состояние растительного покрова, гранулометрический состав почвы и ее влагоемкость [44], песчаные почвы прогреваются сильнее холодных и быстрее остывают, контрастность температурного режима характерна и для антропогенно измененных территорий с нарушением или отсутствием почвенно-растительного покрова [45], а также территорий, где почвенный покров полностью заменен насыпными грунтами. Свалки и территории железнодорожных магистралей являются такими антропогенно измененными ландшафтами с локально повышенной температурой окружающей среды и регулярным привнесением в экосистему чужеродной флоры и микрофлоры [46, 47]. Это позволяет вывести гипотезу, что в поверхностном слое грунтов таких измененных ландшафтов могут обитать термофильные микроорганизмы, устойчивые к загрязнению и способные адаптироваться к условиям недостатка органических соединений.

Таким образом, целью работы стало выявление присутствия термофильных бактерий-нефтедеструкторов в антропогенно измененных почвах Санкт-Петербурга и Ленинградской области, выделение чистых культур, характеристика и идентификация штаммов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектами исследования служили образцы антропогенно загрязненной почвы со свалки в Санкт-Петербурге (образцы K2, K6) и образцы грунта с железнодорожных путей Луги (образцы L1, L2), отобранные в 2019 г. Образец K2 — грунт с территории свалки в районе Кудрово, образец K6 — фоновая почва рядом со свалкой, образец L1 — фоновая почва на склоне железной дороги в Луге, образец L2 — песчаный грунт с железнодорожного полотна в Луге с видимым загрязнением нефтепродуктами. В 5 точках на площади 1 м² в стерильные сосуды отбирали образцы поверхностного слоя почвы или грунта (0–5 см), далее в стерильных условиях их перемешивали и освобождали от твердых включений и растительных остатков.

Для выявления присутствия термофильных бактерий и получения накопительных культур в усредненных пробах проводили высев образцов на модифицированную нами жидкую минеральную питательную среду Ворошиловой–Диановой (далее — ВД) [48] с добавлением ацетата Na в качестве единственного источника энергии и углерода для роста микроорганизмов. Состав среды ВД (на 1 л): NH₄Cl — 1,0 г, NaCl — 1,0 г, K₂HPO₄ — 1,0 г, KH₂PO₄ — 1,0 г, MgSO₄ — 0,2 г, CaCl₂ — 0,02 г, CH₃COONa·3H₂O вносили в количестве 1,36 г. рН среды доводили до 7,0–7,4. Среду стерилизовали методом автоклавирования 30 мин при 1 атм и температуре 121 °C. Растворы микроэлементов, приготовленные как описано в источнике [49], вносили по 1 мл/л каждого в стерильную среду перед посевом. Культивирование бактерий проводили в термостате при постоянной температуре 60 °C. В пробирку со средой ВД в объеме 5 мл добавляли первоначально 0,5 мл водной вытяжки почвы [1 г почвы вносили в пробирку с 10 мл дистиллированной воды, встряхивали на Vortex V-1 plus (Biosan), высев пипеткой из верхней части вытяжки проводили после 15-минутного отстаивания для осаждения почвенных частиц], впоследствии методика была скорректирована и 0,05 г почвенного образца вносили непосредственно в пробирку со средой.

Для выделения чистых культур пересевали накопительные культуры в пробирки с жидкой средой ВД с ацетатом натрия (метод серийных разведений) и культивировали в термостате. После встряхивания на Vortex с помощью пипетки высевали 0,1 мл культуральной жидкости из верхней части пробирки на чашки с твердой средой ГРМ с агаром (состав на 1 л: панкреатический гидролизат рыбной муки — 12,0 г, пептон ферментативный — 12,0 г, NaCl — 6,0 г, агар микробиологический — 12,0 г) и равномерно растирали шпателем, культивация происходила в течении 1 сут, после из выросших колоний методом штриха выделяли чистые культуры.

Микроскопирование в целях проверки чистоты культур проводили на микроскопе Zeiss Axiostar plus, оснащенном фазово-контрастным устройством, при общем увеличении ×400. Использовали суточную культуру, выросшую на твердой среде ГРМ.

Для проверки способности культур использовать нефть в качестве единственного источника углерода проводили посев выделенных культур на жидкую среду ВД с добавлением в качестве субстрата нефти в количестве 10 мл/л. После поверхностного внесения нефти в среду осуществляли посев бактериальной суспензии и культивацию в термостате при постоянной температуре 60 °C. Для подтверждения роста бактерий с использованием углеводородов нефти в качестве единственного источника углерода осуществляли троекратный пересев бактериальной суспензии, полученной на нефти, на аналогичную среду с нефтью и последующую культивацию с измерением оптической плотности.

Динамику роста культур в жидкой среде определяли по изменению оптической плотности среды с помощью спектрофотометра ПЭ 3000-УФ (Промэколаб) при длине волны 570 нм в единицах абсорбции (abs). По результатам измерений на протяжении 2,5 сут (до выхода кривой роста на плато) проводили построение кривой роста культур. Опыт проводили в трех повторностях, замер оптической плотности культуры для каждой точки осуществляли дважды в кювете объемом 2,5 мл, статистическую обработку и построение графика с отображением относительной погрешности проводили в программе MC Excel 2007. Диапазон значений лежит в пределах погрешности (Δ = 0,05).

Идентификацию штаммов молекулярно-генетическими методами проводили в компании «Евроген» (Москва) на основе анализа последовательности нуклеотидов гена 16S рРНК с использованием стандартных праймеров — 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') и 1492R (5'-ACGGYTACCTTGTTACGACTT-3').

Для анализа нуклеотидных последовательностей и построения филогенетического древа использовали библиотеки NCBI BLAST и методы Neighbour-Joining и Maximum Likelihood [49–53] (программы MUSCLE, Gblocks, PhyML, TreeDyn). Длина анализируемых последовательностей составляла 1439–1444 нуклеотидов.

Нуклеотидные последовательности фрагментов генов 16S рРНК депонированы в базе данных GenBank NCBI под номерами MW676172–MW676177.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение чистых культур

Посев водных вытяжек почвы в вариантах K2 и K6 на жидкую среду ВД и последующее инкубирование не привели к ожидаемому результату, рост термофильных микроорганизмов не был обнаружен, ввиду, вероятно, малого количества их клеток в почве. Поэтому впоследствии методика была модифицирована, и в качестве инокулюма использовали 0,05 г почвенно-грунтового образца, который вносили непосредственно в пробирку со средой. В этом случае рост микроорганизмов начинался уже через сутки после посева. Микроорганизмы, способные расти при температуре 60 °C, были обнаружены во всех исследованных пробах — K2-2, K6, L1, L2.

В результате нескольких серийных разведений и последовательных пересевов микроорганизмов, выросших из исследованных нами почвенных образцов K2 и K6, L1 и L2, были получены стабильно растущие накопительные культуры термофильных бактерий. В дальнейшем из накопительных культур были выделены чистые культуры K2-2, K6, а также L1, L2-1, L2-2, L2-3. Культура L2-1 перестала расти после нескольких пересевов и в последующих экспериментах не использована. Выделение накопительных культур К2 и К6 описано Е.Н. Волковой и соавт. [39]. Выделение чистых культур бактерий из проб Кудрово и Луги приведено в данной публикации.

Посев накопительной культуры L2 на поверхность агаризованной среды ГРМ привел к росту визуально различающихся по цвету и характеру роста колоний бактерий. Три чистые культуры бактерий, L2-1, L2-2 и L2-3, были выделены методом истощающего штриха на этой среде, тогда как культура L1 изначально представляла собой однородную монокультуру. Можно отметить выявление большего разнообразия культивируемых термофильных микроорганизмов в образце загрязненного грунта по сравнению с фоновым, что говорит о большей адаптивности микробного сообщества в условиях техногенного загрязнения.

Характеристика культур

Микроскопирование культур показало, что культуры K2-2, K6, L1, L2-2 и L2-3 представляют собой неподвижные, способные к спорообразованию мелкие тонкие палочки, L2-1 — неподвижные, способные к спорообразованию длинные палочки.

Общий вид микробных клеток и спор представлен на рис. 1.

Рис. 1. Общий вид клеток и спор: a — L1, b — L2-1, c — L2-2, d — L2-3, e — K2-2, f — K6

Все выделенные культуры были способны расти за счет использования ацетата в качестве источника энергии и углерода. Динамика роста культур K2-2 и K6 показаны на рис. 2–3. Максимальная оптическая плотность (0,25 ± 0,012) наблюдалась через 2–3 сут для культуры K2-2, и 1,7 сут — для культуры K6.

Рис. 2. Кривая роста бактериальной культуры K2-2 на жидкой среде ВД с ацетатом натрия и без органического субстрата на протяжении 2,5 сут. OD — оптическая плотность культуры

Рис. 3. Кривая изменения оптической плотности бактериальной культуры K6 на среде ВД с ацетатом натрия и без органического субстрата на протяжении 2,5 сут. OD — оптическая плотность культуры

Выделенные штаммы бактерий были проверены на способность к росту за счет использования нефти. Было установлено, что штаммы K2–2 и K6 были способны расти за счет использования углеводородов нефти. Способность использовать углеводороды нефти штаммами, выделенными из проб Луги, требует дальнейшего изучения. Максимальная оптическая плотность культур K2-2 и K6 в конце опыта при культивации в течение 2,5 сут их на жидкой среде ВД с добавлением нефти составляла 0,143 ± 0,011 для культуры K2-2 и 0,064 ± 0,005 — для культуры K6, что указывало на способность этих культур использовать различные углеводороды нефти в качестве ростового субстрата. Возможно, что штамм K2-2, выделенный из загрязненного грунта на территории свалки, способен разрушать больше компонентов нефти и, соответственно, представляется более перспективным для дальнейших исследований в этом направлении.

Идентификация штаммов

Изучение филогенетического положения выделенных культур на основе последовательности нуклеотидов гена 16S рРНК с использованием стандартных праймеров 27F и 1492R показало их принадлежность к представителям разных родов грамположительных спорообразующих бактерий типа фирмикутов (Firmicutes) класса бацилл (Bacilli) порядка Bacillales семейства Bacillaceae. Так, штамм L2-1 принадлежит к роду Geobacillus, штаммы K2-2, K6, L1, L2-2, L2-3 — к близкому к нему роду Aeribacillus (рис. 4), который сравнительно недавно был отделен от Geobacillus [10]. Этот род на данный момент содержит 2 вида [10, 55].

Рис. 4. Филогенетическое дерево близкородственных штаммов, полученное путем применения алгоритмов Neighbor-Join и BioNJ к матрице попарных расстояний [50–54]. Длина ветвей представлена в масштабе и измеряется количеством нуклеотидных замен на сайт

По литературным данным, типовые штаммы бактерий Aeribacillus pallidus и Geobacillus thermodenitrificans — видов, наиболее сходных с обнаруженными нами по результатам секвенирования 16S рРНК, — являются обитателями жарких географических регионов, они были обнаружены в Мексике [11], Иране [35], Турции [9], об их способности разлагать углеводороды имеется мало сведений. При этом некоторые штаммы этих видов способны к разложению углеводородов нефти (алканов <С17, ароматических углеводородов, нафталина, фенантрена) — Aeribacillus pallidus 8m3, SL-1, VP3, XS2, XS3 [20, 24, 56–59], Geobacillus thermodenitrificans NG80-2 [60]. Как правило, термофильные бациллы рода Aeribacillus были обнаружены в горячих источниках и зонах с геотермальной активностью [12, 13, 20, 61], сведения об их присутствии в почвах регионов Санкт-Петербурга и Ленинградской области были получены нами впервые. При этом, по литературным данным, на территории России были обнаружены некоторые другие термофильные представители рода Geobacillus [18, 62, 63], и эти виды также были обнаружены преимущественно в горячих источниках, тогда как о присутствии их в почве на территории России на настоящий день информации очень мало, имеются лишь отдельные сведения о присутствии термофильных микроорганизмов в антропогенно измененных почвах, таких как территории лесозаготовок [64], а также сельскохозяйственные почвы после внесения продуктов переработки сточных вод [65].

Таким образом, подтверждена гипотеза о присутствии термофильных бактерий в антропогенно измененных грунтах Санкт-Петербурга и Ленинградской области и показано, что в целом нетипичные для северных регионов представители термофильных бактерий с их быстрым метаболизмом могут быть способны к адаптированию и выживанию в условиях антропогенного загрязнения, используя для размножения краткий период повышенных температур и пережидая неблагоприятные периоды в состоянии спор.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследована микрофлора антропогенно измененных грунтов района Кудрово (Санкт-Петербург) и города Луги (Ленинградская область). Обнаружено присутствие термофильных аэробных бактерий, способных расти за счет разрушения ацетата натрия при повышенной температуре (60 °C). Выделены чистые бактериальные культуры (6 штаммов) и проведено их описание, а также идентификация полученных штаммов молекулярно-генетическими методами, показавшая их принадлежность к родам Geobacillus и Aeribacillus. Сведения о присутствии представителей рода Aeribacillus в регионе Санкт-Петербурга и Ленинградской области получены нами впервые.

В дальнейшем будет проведено выявление адаптивности полученных бактериальных культур к различным температурным условиям, а также способности к разложению отдельных углеводородов.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Научное исследование проведено при частичной поддержке РФФИ (грант № 19-34-90156).

Об авторах

Анна Сергеевна Журавлева

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Агрофизический научно-исследовательский институт»

Автор, ответственный за переписку.
Email: zhuravlan@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-7204-9653

младший научный сотрудник, аспирант

Россия, 195220, Санкт-Петербург, Гражданский просп., д. 14

Елена Николаевна Волкова

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский государственный университет промышленных технологий и дизайна», Высшая школа технологии и энергетики

Email: ele-ven@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-7429-4046

д-р с.-х. наук, профессор

Россия, Санкт-Петербург

Александр Сергеевич Галушко

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Агрофизический научно-исследовательский институт»

Email: galushkoas@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0002-0387-7997

канд. биол. наук, ведущий научный сотрудник

Россия, 195220, Санкт-Петербург, Гражданский просп., д. 14

Список литературы

Дополнительные файлы