Транскрипционная активность генов, участвующих в регуляции диапаузы колорадского жука, и ее изменения под влиянием инсектицида фипронила

Полный текст

Введение

Успех исследований генетической основы адаптациогенеза во многом зависит от выбранного объекта, и мы полагаем, что такой моделью может служить широко известный вид насекомого-фитофага — колорадский картофельный жук Leptinotarsa decemlineata Say [1]. Для этого вида характерна не только способность к быстрому формированию устойчивости к инсектицидам, обеспеченная высоким уровнем генетического полиморфизма, но и значительный уровень полифенизма в отношении форм покоя — диапаузных состояний [2, 3]. Для вида установлено наличие сезонных форм покоя, запрограммированных и обусловленных фотопериодической реакцией (проспективная диапауза), а также способность к быстрому развитию диапаузного состояния при резком неожиданном изменении условий, в частности при интенсивном воздействии инсектицидов — конзекутивная диапауза.

Формирование диапаузы у насекомых может проходить с участием нескольких различных механизмов, что выражается как разнообразие экспрессионных профилей генов, ассоциируемых с диапаузными состояниями у разных видов насекомых [3, 4]. Мониторинг экспрессии ряда генов, в число которых входят гены, кодирующие запасные белки (DP1), белки, обеспечивающие устойчивость к отдельным неблагоприятным факторам среды (DAT2, DAT3), позволил установить глубину диапаузных состояний в популяциях колорадского жука на территории Северной Америки [3]. Такие данные дают основание для долгосрочного прогноза развития и динамики численности популяций и, соответственно, для выбора стратегии и тактики контроля численности фитофага.

Наступление глубокого длительного покоя в период зимней гибернации у колорадского жука предваряется периодом репродуктивной диапаузы. Как в природных условиях, так и в лабораторных культурах у взрослых насекомых может сохраняться двигательная активность, у колорадского жука даже отмечено неоднократное спаривание, однако откладка яиц не наступает. Наши исследования [5] показали, что для популяций колорадского жука на территории Южного Урала наступление репродуктивной диапаузы у самок характеризуется остановкой развития ооцитов на стадии превителлогенеза, несмотря на присутствие в семяприемниках запаса спермы.

В лабораторных условиях на протяжении зимнего периода имаго способны формировать диапаузное состояние, при котором прекращается питание и снижается подвижность, т. е. внешние поведенческие реакции соответствуют фазе поддержания диапаузы [2, 3, 6]. Регуляция индукции диапаузы у L. decemlineata осуществляется с преимущественным вкладом фоторецепторной сигнальной системы [2]. Неотъемлемой частью фоторецепторной системы являются рецепторы гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК, GABA). Кодирующие их субъединицы гены экспрессируются в органах зрения и в соответствующих зонах центральной нервной системы у всех животных, в том числе и у насекомых [7]. Можно предположить, что у насекомых, жизнь которых регулируется рядом фотопериодических реакций, экспрессия генов, кодирующих компоненты этих рецепторов, возможна не только в фоторецепторных органах, но и в тканях органов, для которых фотопериодический сигнал определяет переход от одного состояния к другому. Нас интересует, имеет ли отношение ГАМК-сигнальная система к регуляции репродуктивной диапаузы у колорадского жука. Для ответа на этот вопрос мы выясняли, как меняется транскрипционная активность генов, участвующих в регуляции диапаузы — запасных белков DP1и ферритина fer [8], белков, ответственных за устойчивость в период диапаузы (DAT1, DAT2), гена рецептора экдизона, регулирующего репродуктивные процессы (EcR), гена, кодирующего фермент ацетилхолинэстеразу (Ldace-1), активность которой характеризует функциональное состояние нейроэндокринной системы насекомых, и гена rdl, кодирующего субъединицу Rdl — компонент рецептора GABA, участвующего в передаче фотосигнала в тканях гонад и мышцах имаго в период инициации диапаузы (ИД) и в середине января, когда у большинства насекомых определяется фаза поддержания диапаузы (ПД). Кроме того, проведено сравнение между контрольными группами самок и самцов и группами особей, в конце сентября перенесших топикальную обработку сублетальной дозой фипронила, неконкурентного ингибитора ионотропного канала, образованного рецептором GABA типа А, связывающегося с аллостерическим сайтом субъединицы Rdl.

Материалы и методы

Лабораторная культура колорадского жука представлена выборкой (общий объем 450 особей) имаго летней генерации 2014 года, собранной на частной плантации картофеля в августе. Насекомых в лабораторных условиях содержали на свежем корме при естественном свете до конца сентября, после чего их поместили в условия полной темноты. Затем в ходе эксперимента с использованием направленного освещения были выделены группы активных и неактивных самок и самцов. Фотосигнал, использованный как фактор инициации таксиса, позволяет выделить в лабораторной культуре группы активных (подвижных) и неактивных (не реагирующих на направленный свет) особей за короткое время — не более 15 минут при яркости 120 лк. Для них (в трехкратной повторности, по 3 особи из каждой группы) определена транскрипционная активность перечисленных генов (оценка числа копий мРНК для каждого гена) относительно референсного гена домашнего хозяйства rp4 [9] методом количественной ПЦР в режиме реального времени [10]. Повторный аналогичный эксперимент проводили в контрольной группе (36 имаго) и в группе особей (38 имаго), обработанных фипронилом в концентрации 0,0001 % (1 мкл/особь, нанесение микрошприцем МШ-1 в выемку на вентральной стороне проторакса), через 4 месяца, в конце января 2015 года.

Выделение РНК проводили на льду из объединенных для трех имаго мышц торакса или гонад, извлеченных и промытых в растворе Рингера, с использованием набора РНК-Экстран («Синтол») в соответствии с протоколом производителя. Оценку активности ацетилхолинэстеразы (АХЭ) по Эллману в гемолимфе, взятой из спинного сосуда имаго, и определение концентрации белка по методу Бредфорда осуществляли для каждой особи в 5 мкл гемолимфы/100 мкл трис-НСl экстрагирующего буфера рН 7,2 по вышеописанным методикам [11]. Статистическую обработку с применением теста Манна – Уитни для оценки значимости различий данных по экспрессии генов между группами особей и критерия Стьюдента для оценки биохимических данных, а также графическую обработку данных проводили с использованием программ Excel. Для удобства сопоставления экспрессии генов на графических иллюстрациях показано не просто рассчитанное относительно референсного гена число копий мРНК (поскольку оно сильно различается для отдельных генов), а отношение расчетного числа копий мРНК в тканях гонад к аналогичному показателю для тканей мышц либо отношение этих показателей между группами, обработанных фипронилом, и необработанных особей.

Результаты и обсуждение

Детальные исследования группы американских ученых под руководством профессора Джорджа Йокума позволили разработать способ определения фазы диапаузного состояния для особей колорадского жука, успешно апробированный на природных популяциях США [3, 6]. Ими предложена таблица по уровню экспрессии нескольких генов, ассоциированных с диапаузой, — генов пищеварительных протеиназ DG1 и DG2 и нескольких запасных белков (DP1, DAT1, DAT2, DAT3). Наши результаты позволяют расширить представление об изменениях в транскрипционной активности генов диапаузных белков и генов, участвующих в регуляции фотопериодической реакции, на разных этапах диапаузы имаго колорадского жука в лабораторных условиях.

К сожалению, полное сопоставление с данными G. Yocum et al. [3, 6] невозможно, поскольку в работе американских коллег не было проведено разделение по полу, а для выделения РНК были использованы тотальные гомогенаты. Тем не менее наши результаты во многом согласуются с результатами этой группы. Содержание мРНК генов DP1, DAT1, DAT2, DAT3 и Ld EcR в гонадах самок и самцов колорадского жука выше, чем в мышечной ткани, и в фазе инициации диапаузы оно повышается относительно референсного гена rp4 в сравнении с активными в данное время особями. Однако копийность мРНК перечисленных выше генов отличается на порядки, и поэтому в качестве показателя, характеризующего транскрипционную активность диапаузирующих и активных особей и в то же время удобного для его графической демонстрации, мы приняли отношение числа копий мРНК в гонадах и мышцах.

Соотношение уровня содержания мРНК гена DP1 в тканях гонад и мышц насекомых, определенного в начале диапаузы, оказалось выше для самок (рис. 1). Согласно определительной таблице наступления фаз диапаузы [3] неактивные самки уже находились к моменту эксперимента в фазе инициации диапаузы, тогда как в остальных группах этот процесс только начинался (у самок) либо еще не начался (у самцов вне зависимости от двигательной активности).

Гены DAT заметно сильнее экспрессированы в гонадах самок, особенно у неактивных особей, вступивших в период формирования диапаузы. Сравнивая наши результаты с предложенной для мониторинга диапаузного состояния таблицей экспрессии генов [3], мы подтвердили то, что проходящие период подготовки к диапаузе особи находились в фазе ИД независимо от степени их активности. В середине периода покоя в соответствии с данными G. Yocum et al. [3, 6] неактивные особи находились в фазе ПД, тогда как у подвижных особей отмечалась незавершенная фаза ИД. Следует отметить, что во всех случаях разница между самками и самцами очень существенна. По-видимому, именно эти различия лежат в основе многообразия паттернов экспрессии генов, ассоциируемых с диапаузой колорадского жука, выявленного ранее [3, 6]. Сопоставление транскрипционной активности генов, ассоциируемых с наступлением диапаузы (рис. 2, а), в группах обработанных фипронилом особей показало повышенное содержание мРНК, особенно заметное у неактивных имаго. Интересные данные получены для гена EcR, не включенного G. Yocum et al. [3, 6] в число ассоциируемых с диапаузой (рис. 2, b). Тест Манна – Уитни позволил выявить достоверное повышение содержания мРНК гена EcR у обработанных особей. Следует подчеркнуть, что для самок в обеих группах отмечено значимо более высокое содержание мРНК в гонадах. Для самцов различия между тканями не были существенными. Усиленная транскрипционная активность в тканях репродуктивных органов позволяет предположить, что такое изменение — компонент стрессового ответа на воздействие ксенобиотика. Сходные изменения экспрессии гена экдизонового рецептора при токсическом стрессе, вызванном действием ряда ароматических инсектицидов, были обнаружены у представителя отряда двукрылых, Chironomus riparius [12, 13]. Фипронил, нарушающий работу всей нейроэндокринной системы не только у насекомых, но и у позвоночных [14–16], способен в малых дозах давать эффекты повышения плодовитости у комнатной мухи [11]. Такое проявление стресс-реакции позволяет считать выявленные нами изменения дифференциальной экспрессии гена EcR закономерным проявлением токсического стресса.

При сравнении реакции на направленное освещение в сентябре в группе самок доля неактивных особей составляла 40,6 %, а в группе самцов — 50 %. В январе в контрольных группах доля неактивных особей достигла 85 %, тогда как среди обработанных фипронилом особей неактивные особи составляли не более 38 %.

При переходе к глубокой диапаузе на фазе ее поддержания интенсивность метаболизма снижается. Меняется тип газообмена, подавляются процессы обмена, секреции и экскреции, снижается интенсивность работы нейроэндокринной системы, что было показано для многих видов насекомых, в том числе и для колорадского жука [4, 17–19]. Признанным маркером этих процессов является активность фермента ацетилхолинэстеразы — важного компонента холинергических синапсов и одновременно участника метаболизма стероидов [20]. Содержание мРНК гена Ldace-1у диапаузирующих особей колорадского жука из контрольных групп также понижено.

Внешние признаки диапаузы у неактивных имаго после обработки фипронилом сохранились, однако при оценке активности ацетилхолинэстеразы у всех обработанных особей зарегистрирована индукция (рис. 3) с превышением значений для контрольных групп в 1,5–5 раз. Транскрипционная активность гена Ldace-1 у этих имаго также превышала значения для контрольных групп. Эти результаты свидетельствуют о повышенной функциональной активности нейроэндокринной системы, что не соответствует представлению о состоянии глубокой диапаузы.

До последнего времени о рецепторах GABA было известно, что в основном они экспрессируются в нейронах оптических долей мозга насекомых [14] аналогично их роли в ЦНС позвоночных [21], принимая участие в циркадианной регуляции нейронной активности. Экспрессия гена rdl в репродуктивных органах имаго колорадского жука, выявленная нами как повышенное содержание мРНК rdl в гонадах активных особей, еще не вступивших в фазу формирования диапаузы (рис. 4, а), резко снижается при переходе к фазе ИД, в сентябре наступившей у неактивных особей. В фазе поддержания диапаузы у активных самцов в гонадах содержание мРНК rdl снижается более чем в 40 раз, у активных самок — в 12 раз, у неактивных особей это снижение не так заметно. Изменения транскрипционной активности гена rdl у особей, обработанных фипронилом, имеют четко выраженные гендерные особенности (рис. 4, b). У самцов отмечено резкое снижение содержания мРНК, тогда как для самок этого не наблюдалось. Эти данные позволяют нам предположить, что такие различия могут быть обусловлены особенностями гормонального баланса самок и самцов, обусловливающими различия в ответе генома на нарушения работы ионных каналов [22].

Снижение транскрипционной активности гена rdl в ответ на действие фипронила может быть вызвано связыванием субъединицы Rdl с фипронилом, сопровождающимся конформационными изменениями рецептора, в результате чего активируется гипотетический супрессор, ингибирующий транскрипцию гена. Эта реакция характерна не только для фипронила. Показано, что и другие ксенобиотики также связываются с субъединицей рецептора, снижая уровень экспрессии как у насекомых, так и у теплокровных [23]. В частности, установлено, что у Anopheles gambiae эта субъединица является мишенью также для пиретроидов и неоникотиноидов [24], а кроме того, отмечено связывание с этим аллостерическим сайтом как у насекомых, так и у теплокровных барбитуратов и стероидов [14, 25]. Полученные результаты позволяют выдвинуть предположение о том, что фипронил, ингибируя связывание GABA с рецептором, тем самым значительно изменяет регуляторные процессы, сопровождающие развитие диапаузных состояний. Повышенная экспрессия целого ряда генов является, по-видимому, компенсаторной реакцией на действие фипронила. Высокая активность АХЭ в гемолимфе у обработанных особей маркирует чрезмерную активность нейроэндокринной системы, не соответствующую состоянию диапаузы. Повышенная транскрипционная активность генов может привести к чрезмерному расходованию энергетических ресурсов и понизить жизнеспособность в период диапаузы, что подтверждается полученными нами ранее данными [26].

Благодарности. Работа поддержана грантом РФФИ № 15-04-04801-а.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах

Юрий Михайлович Никоноров

ФГБУН «Институт биохимии и генетики» Уфимского научного центра РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: nikonorov@anrb.ru
старший научный сотрудник, лаборатория молекулярной биологии и нанобиотехнологии Россия

Лиана Ахнафовна Сыртланова

ФГБУН «Институт биохимии и генетики» Уфимского научного центра РАН

Email: slian4ik@mail.ru
аспирант, лаборатория физиологической генетики Россия

Константин Альбертович Китаев

ФГБУ «Башкирский референтный центр» Россельхознадзора

Email: cordek@ya.ru
энтомолог, лаборатория фитосанитарных исследований Россия

Галина Васильевна Беньковская

ФГБУН «Институт биохимии и генетики» Уфимского научного центра РАН

Email: bengal2@yandex.ru
ведущий научный сотрудник, лаборатория физиологической генетики Россия

Список литературы

Дополнительные файлы