Метаболическое профилирование листьев четырех видов лютика

Полный текст

АКТУАЛЬНОСТЬ

Понятие индивидуального «метаболического профиля» внутренней среды организма, отражающего состояние пациента, сформировалось в медицине к середине XX в. Методы хроматографического анализа состава метаболитов стали активно применяться в клинических исследованиях с конца 1960-х годов [1]. С развитием системно-биологических дисциплин по аналогии с терминами «геном» и «протеом» в 1998 г. для обозначения совокупности всех метаболитов биологической системы был предложен термин «метаболом» [2]. В настоящее время метаболомный подход широко применяется в медицине, спортивной биологии и ветеринарии [3]. Только к концу XX в. были разработаны методы экстракции, дериватизации и хроматографии, применимые для изучения растений [4]. С 2000 г. начался экспоненциальный рост исследований, посвященных изучению метаболома растений. Метаболическое профилирование является относительно дешевым и быстрым способом фенотипирования биохимического состояния (хемотипирования) растений. Этот подход применяется для изучения процессов как у модельных объектов, так и у сельскохозяйственных и дикорастущих растений. Метаболомный анализ используется для фенотипирования сортов, популяций и видов растений. Преимущества метаболомных исследований заключаются в том, что они позволяют оценить сложные изменения обмена веществ растений в процессе развития и выявлять биохимические особенности различных тканей и органов в нормальных и стрессовых условиях. Исследования последних лет направлены на выяснение метаболической изменчивости под действием как абиотических, так и биотических стрессовых факторов (засухи, засоления, низких и высоких температур, тяжелых металлов, атаки патогенов и др.) [5]. К сожалению, количество работ, посвященных метаболическому профилированию растений в условиях такого воздействия, как дефицит кислорода, весьма ограничено по сравнению с исследованиями, анализирующими другие типы стрессовых воздействий [6].

Дефицит (гипоксия) или полное отсутствие (аноксия) кислорода — достаточно распространенный неблагоприятный фактор среды, который возникает в агроценозах и природных растительных сообществах в связи с временным или постоянным переувлажнением, с избытком воды при наводнениях, весенних паводках и во время выпадения обильных осадков, формированием асфальтового покрытия, уплотнения почв и т. п. [7, 8]. Ежегодные потери урожая от кислородной недостаточности составляют до 50 % в год [8, 9]. Дефицит кислорода в этих условиях приводит к значительным изменениям обмена веществ растений, в частности подавлению аэробного дыхания и оксигенного фотосинтеза и, как следствие, сильнейшему кризису энергетического метаболизма [7, 8, 10]. Единственным процессом, способным поставлять молекулы АТФ при гипо-/аноксии, становится гликолиз с последующим молочнокислым и спиртовым брожением, что провоцирует накопление токсичных продуктов анаэробного обмена, таких как ацетальдегид и этанол, а также закисление цитоплазмы [7, 10]. Тем не менее именно в ходе брожений происходит окисление НАДН, необходимое для эффективного функционирования гликолиза. У ряда устойчивых к гипоксии растений показана способность перенаправлять промежуточные метаболиты гликолиза в альтернативные аноплеротические пути, которые приводят к накоплению малата, сукцината, глицерина, аланина и γ-аминомасляной кислоты (ГАМК) [7, 10]. Синтез этих альтернативных гипоксических метаболитов позволяет растению реокислять НАД(Ф)Н в НАД(Ф)⁺, необходимый для гликолиза, и предотвращает аккумуляцию токсичных метаболитов во время кислородной недостаточности. Важно отметить, что накопление аланина и ГАМК также предотвращает закисление цитоплазмы при гипо-/аноксии [10]. Эти результаты получены методами конвенциональной классической биохимии.

В последние годы появились данные о проведении метаболомных исследований резуховидки [11], лядвенца [12], риса [13, 14], пшеницы [13, 15], ячменя [16], сои [17] и других культурных растений. Известны также единичные сообщения о воздействии недостатка кислорода на метаболом водных растений — гидрофитов: взморника (Zostera marina) [18] и рдеста (Potamogeton anguillanus) [19]. Сопоставление данных метаболомного профилирования различных растений при действии гипо-/аноксии, недавно проведенное в обзоре [20], позволило выявить «отпечатки метаболических пальцев», специфичные для растений в условиях дефицита кислорода. В большинстве случаев были показаны существенные изменения уровня содержания растворимых сахаров, аккумуляция пирувата, сукцината и лактата в тканях растений. Кроме того, у них преимущественно возрастало содержание аминокислот, связанных с такими метаболитами гликолиза, как фосфоглицерат (серин и глицин), фосфоенолпируват (фенилаланин, тирозин и триптофан) и пируват (аланин, лейцин и валин). Накапливались также аминокислоты — производные аспартата (аспарагин, лизин, метионин, треонин и изолейцин), глутамат и его производные (пролин, аргинин и ГАМК), которые, как известно, связывают гликолиз с измененным в бескислородной среде циклом Кребса и обеспечивают альтернативные пути окисления НАД(Ф)Н, что позволяет избежать чрезмерного накопления токсичных метаболитов брожения [7, 10, 12, 20, 21]. Весьма любопытно, что среди 63 проанализированных сортов, линий и видов растений 40 были от средне- до сильноустойчивых к дефициту кислорода [20], то есть вышеизложенные «отпечатки метаболических пальцев» характерны в основном для видов, адаптированных к гипоксии. Уровень сахаров также сильно варьировал в метаболических профилях разных растений. Выявленные изменения метаболомов касаются кислородной недостаточности в широком смысле, от гипоксии до аноксии, поскольку в разных экспериментах авторы использовали различные способы создания и сроки действия данного стрессора. Отсутствие стандартизации аналитических методов метаболического профилирования [газовая хроматография-масс-спектрометрия (ГХ-МС), жидкостная хроматография-масс-спектрометрия, капиллярный электрофорез-масс-спектрометрия, ядерный магнитный резонанс] также приводило к несколько разным результатам профилирования даже у одних и тех же растений. Имеющиеся в настоящее время данные, к сожалению, не позволяют сделать окончательный вывод, какой из метаболитов и/или метаболических путей можно признать специфичным для гипоксии и/или аноксии. Нельзя также однозначно различить метаболические профили устойчивых и неустойчивых к дефициту кислорода растений.

В связи с этим, актуальность метаболического профилирования растений, неустойчивых к гипоксии, и сопоставление метаболомов растений, различающихся по устойчивости к действию данного стрессора, не вызывает сомнений. Нам представляется перспективным сравнение метаболических профилей близкородственных видов растений мезофитов и гидрофитов, различающихся по устойчивости к затоплению и произрастающих на одной территории в разных биотопах, для выявления изменений метаболома, отличающих по-разному адаптированные растения. Знание характерных «отпечатков метаболических пальцев» устойчивых и неустойчивых растений можно использовать для диагностики устойчивости к дефициту кислорода у растений, что представляет интерес для селекционеров и агробиотехнологов.

Ранее мы провели метаболическое профилирование трех видов кипрея: мезофитного кипрея (иван-чая) узколистного [Epilobium angustifolium L. = Chamaenerion angustifolium (L.) Scop.] и двух гидрофитов, кипрея волосистого (E. hirsutum L.) и кипрея болотного (E. palustre L.) [22]. В профиле мезофита были обнаружены высокие уровни сахаров. У гидрофитных кипреев метаболомы практически не отличались друг от друга и характеризовались типичным анаэробным ответом, заключающимся в накоплении аминокислот, дикарбоновых кислот и метаболитов гликолиза и молочнокислого брожения, что отражало стимуляцию у них анаэробного дыхания, азотного обмена и альтернативных путей реокисления НАД(Ф)Н. Тем не менее гидрофитные E. hirsutum и E. palustre относятся к секции Epilobium, а E. angustifolium — к секции Chamaenerion. Таким образом, выявленные различия метаболических профилей могли быть обусловлены не столько экологическими, сколько таксономическими различиями изученных видов [22].

Цель — сравнение метаболических профилей листьев четырех видов лютика, различающихся разной степенью и стратегиями устойчивости к кислородной недостаточности и принадлежащих к двум подродам рода Ranunculus, для выявления характерных изменений метаболома, свойственных устойчивым к дефициту кислорода гидрофитным растениям.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследований

Объектами настоящего исследования являются представители рода лютик (Ranunculus L.) — одного из крупнейших родов цветковых растений, объединяющего, по последним оценкам, от 1616 [23] до 1723 [24] видов. В пределах этого обширного рода встречаются самые разнообразные представители, как эндемичные [лютик Лайолла, Ranunculus lyallii (A. Gray) Rydb.], так и космополитные (лютик ползучий, R. repens L.), занимающие огромное количество экологических ниш по всему земному шару. На территории бывшего СССР встречается около 160 видов лютика [25], из них 16 видов произрастают в Ленинградской области и Санкт-Петербурге [26]. Нами были исследованы листья четырех видов, относящихся к двум ключевым подродам: лютик длиннолистный (R. lingua L.) и лютик ядовитый (R. sceleratus L.) — представители подрода Auricomus Spach., а также лютик едкий (R. acris L.) и лютик ползучий (R. repens L.) — представители подрода Ranunculus [27]. Помимо филогенетического родства, выбранные для исследования виды различаются по экологическим предпочтениям и формируемым жизненным формам. Большая часть видов этого рода является многолетними поликарпическими травами, а их развитие так или иначе связано с увлажненными местообитаниями, такими как берега рек, озер, временных водоемов или даже гипно-осоковые и тростниковые болота [28]. Тем не менее некоторые виды развиваются как однолетние монокарпики (R. sceleratus) или могут предпочитать более сухие местообитания (R. acris) [29].

Растения собирали в парке «Сергиевка» и на прилегающей территории (Петродворцовый район Санкт-Петербурга). Координаты места сбора: R. lingua — 59°54'00,5''N 29°50'32,5''E, на маршевом тростниковом болоте по берегу Финского залива; R. sceleratus — 59°53'04,7''N 29°50'33,6''E, в воде дренажной канавы прилегающего к территории парка садоводства; R. repens — 59°52'53,9''N 29°50'05,0''E, временная лужа вдоль пешеходной дорожки у факультета прикладной математики — процессов управления СПбГУ; R. acris — 59°52'43,5'' N29°49'54,3''E, суходольный луг напротив входа в здание математико-механического факультета СПбГУ. Парк «Сергиевка» расположен вблизи Финского залива, что придает его климату черты морского. Главнейшим фактором климатообразования здесь является интенсивное движение воздушных масс, приводящее к частому выпадению дождей даже в зимний период. Самый холодный месяц — февраль, в течение которого среднесуточная температура опускается до –8,1 °C. Летом усиливается влияние западных ветров, которые обусловливают значительную облачность и обильное выпадение осадков. Наиболее жаркий месяц — июль, среднесуточная температура 16–17 °C [28].

Для исследования гидрофитов собирали листья растений, произраставших в подтопленной почве в непосредственной близости от водоема (R. lingua и R. repens) или частично погруженных в воду (R. sceleratus). Листья мезофильного R. acris собирали на суходольном лугу, вне зоны подтопления. Образцы анализировали в 6 биологических повторностях, собирая их от разных растений. Отбирали листья одной генерации и примерно одного размера, не поврежденные патогенами и фитофагами. Образцы собирали в середине июля. На портативных электронных весах брали навеску листьев лютиков (200 мг), которую помещали в микропробирку и заливали 1 мл метанола прямо на месте сбора.

Пробоподготовка

В течение 1–2 ч образцы доставляли в лабораторию, где метанольный экстракт переливали в новую микропробирку, а остаток растительного материала измельчали в шаровой мельнице (Tissue Lyser LT, QIAGEN, Германия, 50 уд./с, 3 раза по 2 мин) с 1 мл метанола, проводили пробоподготовку, как описано нами ранее [22]. До анализа высушенные образцы хранили при –80 °C.

Далее осадок в микропробирке растворяли в 100 мкл пиридина, содержащего внутренний стандарт (С₂₃, трикозан), затем добавляли 100 мкл силилирующего агента [1 % раствор триметилхлорсилана в бис(триметилсилил)-N,O-трифторацетамиде, Sigma, США] и дериватизировали пробы на термошейкере TS-100C (BioSan, Латвия) при 800 об./мин, 90 °C в течение 20 мин.

Газовая хроматография, сопряженная с масс-спектрометрией

Для ГХ-МС использовали газовый хроматограф Agilent 5860 с автоматической системой ввода проб Agilent 7893 под контролем программного обеспечения MassHunter (Agilent Technologies, США). Ввод проб осуществляли в режиме без деления потока, объем вводимой пробы 0,5 мкл. Разделение проводили на капиллярной колонке Agilent VF-5MS (длина 30 м, диаметр 0,25 мм, толщина пленки неподвижной фазы 0,25 мкм, Agilent Technologies). Газом-носителем служил гелий (постоянный поток 1 мл/мин, температура испарителя 250 °C). Температурный режим колонки: начальная температура 70 °C, далее — линейное повышение со скоростью 6 °C/мин до 320 °C [30]. Хроматограммы регистрировали с помощью масс-селективного детектора Agilent 5975. Диапазон масс: 50–800 m/z. Температура источника ионов 230 °C, квадрупольного фильтра масс — 150 °C. Исследования проводили на хроматографическом оборудовании Ресурсного центра Санкт-Петербургского государственного университета «Развитие молекулярных и клеточных технологий».

Интерпретация результатов ГХ–МС

Хроматограммы обрабатывали с использованием программного обеспечения PARADISE [31] в сочетании с NIST MS Search (National Institute of Standards and Technology, NIST, США). Для деконволюции и идентификации метаболитов использовали AMDIS (Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System, NIST, США). Соединения идентифицировали по полученным масс-спектрам и индексам удерживания Ковача с использованием библиотек NIST2020 (США), Golm Metabolome Database (GMD, Германия) [32] и собственной библиотеки Лаборатории аналитической фитохимии Ботанического института РАН (Санкт-Петербург, Россия). Пик учитывали, когда коэффициент соответствия был >800. Индексы удерживания определяли путем калибровки с использованием насыщенных углеводородов.

Статистический анализ

Анализ метаболомных данных проведен с использованием R 4.3.1 «Beagle Scouts» [33]. Данные нормализованы по выборочной медиане, логарифмированы и автомасштабированы. Если соединение не было обнаружено в конкретном образце, но присутствовало в остальных повторностях, это считалось технической ошибкой, и проводилась импутация с помощью метода KNN (k-ближайших соседей) пакета impute [34]. Тепловые карты строили с помощью ComplexHeatmap [35]. Метод Random Forest (RF) выполняли в randomForest [36]. Точность среднего уменьшения (Mean Decrease Accuracy, MDA) использовали для определения вклада признака в разницу классов. PCA (англ. Principal Component Analysis, метод главных компонент) проводили с помощью pcaMethods [37]. Диаграмму филогенетических взаимоотношений видов лютиков по материалам статьи [27] строили в программе Icytree [38]. Метод проекций на латентные структуры для дискриминационного анализа (PLS-DA) выполняли с помощью ropls [39]. Для анализа обогащения наборов метаболитов (metabolite set enrichment analysis, MSEA) применяли U-тест из пакета tmod [40]. Наборы метаболитов для метаболитных путей были загружены из базы данных KEGG [41] с использованием KEGGREST [42]. В качестве референсного организма использовали Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Список метаболитов, относящихся к различным биохимическим путям, корректировали вручную, поскольку для некоторых метаболитов были добавлены обязательные необходимые пути. Соединения, идентифицированные до класса (гексоза, дисахарид и др.), помещали в соответствующие пути.

РЕЗУЛЬТАТЫ

С помощью ГХ-МС нами было проведено профилирование метаболитов листьев четырех видов лютиков: Ranunculus acris (мезофит), R. lingua, R. repens и R. sceleratus (гидрофиты). Полученные метаболитные профили включали около 360 соединений, из которых по базам данных было идентифицировано 74 индивидуальных соединения; еще для 109 соединений был определен класс (рис. 1). Результаты представлены в форме тепловой карты, совмещенной со столбчатыми диаграммами MDA (Mean Decrease Accuracy,) из классификации Random Forest. Наиболее широко в профилях были представлены сахара и их производные (114), в том числе пентозы (28), гексозы (34) и олигосахариды (52). Было также обнаружено 10 аминокислот (7 протеиногенных), 23 карбоновые кислоты, включая интермедиаты гликолиза (пируват), брожения (лактат) и цикла Кребса (цитрат, сукцинат, фумарат и малат), а также 6 свободных жирных кислот и ацилглицеринов. Стерины были представлены всего тремя молекулами. Удалось обнаружить 17 вторичных соединений, представленных различными фенолами.

 

Рис. 1. Тепловая карта среднего нормализованного содержания идентифицированных метаболитов в листьях лютиков. Столбчатые диаграммы — Mean Decrease Accuracy из Random Forest. В названиях метаболитов: RI — индекс удерживания, compsug — сложные сахара или молекулы с сахарными частями, FA — жирная кислота, MG — моноацилглицерин

Fig. 1. Heatmap of mean normalized content identified metabolites. Barplots — Mean Decrease Accuracy from Random Forest. In metabolite names: RI — retention index, compsug — complex sugars or molecules with sugar parts, FA — fatty acid, MG — monoacylglycerol

 

На теплокарте видно, что наиболее своеобразными и отличными друг от друга были метаболомные профили гидрофитного R. sceleratus и мезофитного R. acris (рис. 1). Листья произрастающего в воде R. sceleratus содержали больше всего аминокислот, карбоксилатов, жирных кислот и стеринов, тогда как уровни дисахаридов и фенольных соединений были понижены. Важно, что среди аккумулируемых R. sceleratus метаболитов присутствовали типичные представители анаэробного метаболома — интермедиаты гликолиза (глицерат и пируват) и брожений (лактат), карбоксилаты цикла Кребса (цитрат, сукцинат, фумарат и малат), аминокислоты, связанные с гликолизом (валин, лейцин, серин и фенилаланин), а также ГАМК, глутамат и оксопролин (рис. 1). Мезофитный R. acris характеризовался наименьшей представленностью аминокислот, жирных кислот и стеринов среди исследованных нами видов. R. lingua и R. repens, так же как и R. sceleratus, собранные в гидрофитных местообитаниях, по метаболитному профилю занимали промежуточное положение между R. sceleratus и R. acris. Как видно на теплокарте, в метаболоме R. repens были более представлены пентозы, сложные сахара и фенольные соединения, а профиль R. lingua отличался пониженным уровнем органических кислот и спиртов (рис. 1).

Для определения общих закономерностей в сходствах профилей мы представили их в пространстве меньшей размерности с использованием метода PCA. Профили метаболитов четко группировались согласно видовой принадлежности (рис. 2, a). Профили метаболитов R. sceleratus показали наибольшее своеобразие, они отличались от остальных по ГК1 (главная компонента 1), объясняющей 30 % дисперсии. Образцы R. lingua отделялись от R. repens и R. acris вдоль ГК2 (20,8 %). Последние, в свою очередь, расходились по ГК3 (19,1 %) (рис. 2, a). Затем мы провели иерархический кластерный анализ с использованием дистанции Спирмена (1 – rho, где rho — коэффициент корреляции Спирмена). Такой подход также выявил сильное своеобразие метаболомов R. sceleratus, которые кластеризовались в отдельную ветвь на дендрограмме (рис. 2, b). Далее профили R. lingua отделялись от R. repens и R. acris, которые и на дендрограмме также расходились последними.

 

Рис. 2. Анализ без обучения профилей метаболитов четырех видов Ranunculus: a — графики счетов методом главных компонент (ГК); b — дендрограмма иерархической кластеризации метаболических профилей, с расстоянием Пирсона (1 – rho), агломерация методом Уорда; c — диаграмма филогенетических взаимоотношений четырех исследованных видов рода Ranunculus (по: [27], с изменениями). Построена на основе анализа методом максимальной парсимонии с использованием ядерного (ITS-область ядерной рибосомной ДНК) и двух хлоропластных маркеров (matK/trnK)

Fig. 2. Unsupervised analysis of metabolite profiles from four Ranunculus species: a — PCA score plots; b — dendrogram of hierarchical clustering of metabolic profiles, with Pearson distance (1 – rho), Ward method; c — dendrogram of the phylogenetic relationships of studied Ranunculus species of the combined plastid and ITS dataset based on Maximum Parsimony analyses (after: [27], with modifications)

 

Таким образом, на уровне метаболома гидрофитный R. sceleratus, произрастающий частично погруженным в воду, сильно отличался от остальных видов, причем как от R. lingua и R. repens, являющихся гидрофитами, так и от мезофитного R. acris. Данные кластерного анализа показали близость гидрофитного R. repens и мезофитного R. acris.

Для выявления метаболитов, накапливающихся в разных количествах у мезофита и гидрофитов, мы применили дискриминантный анализ методом проекции на латентные структуры PLS-DA. Построенная PLS-DA модель включала три предиктивные компоненты, Q²Y = 0,914. На рис. 3 представлен график счетов, сходный с таковым из PCA. Под ним расположен график нагрузок. Если положение метаболита на графике нагрузок соответствует положению образцов на графике счетов, то его накопление выше в соответствующих образцах. Расхождение R. sceleratus и других видов было связано с p1 (предиктивная компонента 1), объясняющей 29,9 % дисперсии (рис. 3, a). Как видно из рисунка нагрузок (рис. 3, b) и анализа обогащения (MSEA, рис. 3, c) с p1 был связан широкий репертуар дифференциально накапливающихся метаболитов, включая карбоксилаты, аминокислоты и жирные кислоты, стерины, которые R. sceleratus аккумулировал в большем количестве. В то время как три других вида превосходили его по накоплению сахаров и вторичных соединений.

 

Рис. 3. Классификация четырех видов Ranunculus по результатам анализа PLS-DA: a — график счетов PLS-DA моделей; b — график нагрузок PLS-DA моделей, символы и цвета соответствуют классам веществ; c — анализ обогащения набора метаболитов (U-тест) по нагрузкам первых трех компонентов PLS-DA моделей и наборов метаболитов, представляющих химические группы. q — Уровень ложноположительных результатов

Fig. 3. PLS-DA classification of four Ranunculus species: a — PLS-DA score plots; b — PLS-DA loading plots, colors and symbols correspond to chemical classes; c — metabolite set enrichment analysis (U-test) on loadings of first three components and sets of metabolites representing chemical groups. q — False discovery rate

 

С p2 (20,8 % дисперсии) были связаны отличия R. lingua от R. repens и R. acris. Как показывают нагрузки (рис. 3, b) и результаты MSEA (рис. 3, c), эти различия были сфокусированы в группе спиртов и органических кислот, которые показывали тренд к меньшему накоплению у R. lingua. Среди дифференциально накапливающихся метаболитов, отличающих R. lingua от других видов, присутствовали и соединения других классов, аминокислоты (ГАМК и оксопролин), ряд жирных кислот, фенолов и сахаров.

Различия в профилях метаболитов, характеризующие расхождение R. repens и R. acris, были связаны с p3 (19 % дисперсии) и затрагивали преимущественно такие метаболиты, как пентозы, жирные кислоты и карбоксилаты (рис. 3). По результатам MSEA (рис. 3, c), различия мезофитного R. acris и гидрофитного R. lingua были связаны преимущественно с органическими и жирными кислотами. Важно, что по этой компоненте (p3) все гидрофитные лютики отличались от мезофита. R. acris превосходил R. repens и другие виды по уровню ряда С₄ соединений, таких как дезокситетроновая кислота, эритритол, тартрат (за исключением R. sceleratus, рис. 1, 3). Для R. acris были свойственны относительно высокие уровни глицеральдегида, диоксиацетона, глицерата и малоната. Нужно отметить, что R. acris и R. lingua накапливали меньше шикимата по сравнению с двумя другими видами, причем R. acris отличался пониженным уровнем гидрофобных соединений — жирных кислот и стеринов (рис. 1, 3).

ОБСУЖДЕНИЕ

Имеющиеся в научной литературе немногочисленные данные о метаболическом профилировании лютиков охватывают в первую очередь целевую детекцию вторичных метаболитов — ранункулина [43], аминов и фенольных соединений [44]. Ряд исследований посвящен изучению метаболомов листьев и корнеклубней декоративного лютика азиатского (R. asiaticus) при яровизации, прорастании, цветении, разном фотопериоде и интенсивности света [45–47]. Только одна публикация посвящена проблемам экологической метаболомики травянистых растений в арктической тундре Исландии при действии на них геотермальной активности [48]. Повышение температуры почвы вызывало изменение метаболомов, хотя у R. acris это происходило в меньшей степени, чем у злака полевицы тонкой (Agrostis capillaris L.). Повышение температуры на 5–15 °C приводило к аккумуляции ряда углеводов, аминокислот, карбоксилатов и вторичных соединений, фенолов и терпенов в листьях R. acris. Большинство детектированных метаболитов было вовлечено в адаптацию к повышенной температуре [48].

В нашем эксперименте с помощью ГХ-МС было проведено метаболическое профилирование листьев мезофитного R. acris и гидрофитных R. lingua, R. repens и R. sceleratus, собранных в естественных местах их обитания. Профили всех четырех изученных видов лютиков отличались друг от друга по результатам всех проведенных анализов методами мультивариантной статистики, как с применением обучения, так и без него (рис. 1–3). Гидрофитный R. sceleratus показал наибольшее своеобразие метаболома, который кластеризовался по результатам иерархического кластерного анализа отдельно от остальных. Далее, ближе всех к R. sceleratus располагался R. lingua, а затем — R. repens и R. acris, которые на дендрограмме группировались вместе (рис. 2, b). Весьма любопытно, что результаты кластеризации по данным метаболического профилирования полностью совпали с дендрограммой филогенетических взаимоотношений исследованных нами видов рода Ranunculus (рис. 2, c), построенной на основе анализа объединенного набора маркеров пластид и ядерного ITS (Internal Transcribed Spacer, внутренний транскрибируемый спейсер), а именно — ITS-области ядерной рибосомной ДНК и двух хлоропластных маркеров (matK/trnK), на основе анализа максимальной парсимонии (maximum parsimony) [27]. Следовательно, обнаруженные нами различия в метаболических профилях изученных видов обусловлены в том числе и видовыми различиями. Виды R. repens и R. acris, входящие в подрод Ranunculus, кластеризовались вместе как по молекулярно-генетическим, так и метаболическим маркерам, так же как и виды R. lingua и по R. sceleratus, принадлежащие подроду Auricomus (рис. 2, b, c). Таким образом, профилирование центрального метаболома позволяет находить родственные связи и наряду с классическими методами вычислительной филогенетики, использующей молекулярно-генетические методы, может быть востребовано при построении филогенетических дендрограмм. Следует заметить, что в предшествующих хемотаксономических исследованиях изучали преимущественно вторичные метаболиты.

Ранее мы обнаружили существенные различия между метаболическими профилями листьев мезофитного E. angustifolium и гидрофитных E. hirsutum и E. palustre, причем метаболомы гидрофитных кипреев практически не отличались друг от друга. Было высказано предположение, что выявленные различия могли быть обусловлены не только экологическими, но и таксономическими различиями изученных видов [22]. В настоящем исследовании характерные для гидрофитных кипреев анаэробные «отпечатки метаболических пальцев» были наиболее полно обнаружены только у R. sceleratus, образцы листьев которого собирали у произраставших погруженными в воду растений. Так же как и E. hirsutum и E. palustre [22], R. sceleratus характеризовался пониженным уровнем олигосахаридов и аккумулировал интермедиаты гликолиза (глицерат и пируват) и брожений (лактат), органические кислоты цикла Кребса (цитрат, сукцинат, фумарат и малат), аминокислоты, связанные с гликолизом (валин, лейцин, серин и фенилаланин), а также ГАМК и глутамат (рис. 1, 3), что отражает стимуляцию у него анаэробного дыхания, азотного метаболизма и альтернативных путей реокисления НАД(Ф)Н [7, 20, 22]. Об активации аноплеротических путей окисления пиридиновых динуклеотидов свидетельствует также повышение уровня глицерина, шикимата и стимуляция липидного обмена (рис. 1). Кроме того, в листьях R. sceleratus накапливались малонат и оксопролин, что может быть следствием усиливающихся при действии затопления окислительных повреждений липидов (аккумуляция малоната, формирующегося из малонового диальдегида), глутатиона и белков (оксопролин) [7, 49–51]. У мезофитного R. acris метаболом наиболее сильно отличался от такового у R. sceleratus (рис. 1; 2, b). Метаболиты, уровни которых повышались у гидрофита (аминокислоты, жирные кислоты и стерины), были понижены у мезофита, в то время как мезофит, в отличие от R. sceleratus, содержал больше сахаров (пентоз и олигосахаридов) и фенольных соединений. Метаболитные профили двух других гидрофитных лютиков R. lingua и R. repens занимали промежуточное положение между R. acris и R. sceleratus (рис. 2). В целом, различия между гидрофитами и мезофитами затрагивали изменение уровней карбоксилатов и гидрофобных соединений (рис. 3), причем R. repens накапливал большее количество метаболитов, характерных для устойчивых к гипоксии растений [аминоксилот (в том числе ГАМК), карбоксилатов (в том числе лактата, малата, сукцината и шикимата), липидов, стеринов и глицерина (рис. 1)]. R. lingua отличался меньшим уровнем содержания сахаров и фенолов по сравнению с R. repens и меньшим уровнем содержания аминокислот, карбоксилатов и гидрофобных соединений по сравнению с R. sceleratus (рис. 1). Исследованные нами гидрофитные виды лютиков имеют практически идентичные экологические ниши: они произрастают по заболоченным лугам, в поймах рек, по берегам водоемов и болотам [29]. R. repens и R. sceleratus также могут расти в увлажненных местах по придорожным канавам, на пустырях, в садах и огородах, по рудеральным местообитаниям [29]. С другой стороны, между ними есть целый ряд существенных различий. R. lingua — высокое (до 1,5 м) многолетнее растение с прямым полым стеблем и корневищеобразными подземными побегами, типичный гелофит [29]. R. repens так же представляет собой многолетнее травянистое растение со стелющимся, укореняющимся в узлах стеблем (до 0,5 м длиной) и коротким ветвистым корневищем [29]. R. sceleratus — однолетнее травянистое растение со стеблем до 0,5 м высотой. Более того, этот вид отличается от остальных исследованных гидрофитов стратегией адаптации к дефициту кислорода. R. sceleratus обладает хорошо развитой конститутивной аэренхимой, а при затоплении стимулирует рост осевых органов, междоузлий стебля и черешков листьев [52], то есть демонстрирует стратегию избегания затопления (low oxygen escape syndrome, LOES) [7, 10, 20]. R. repens обладает лизигенной аэренхимой, а при полном затоплении, которого не было в нашем эксперименте, у него стимулируется в первую очередь не рост, а метаболические адаптации, включая подводный фотосинтез, гликолиз и брожения [52], то есть для него характерна стратегия покоя (low oxygen quiescence syndrome, LOQS) [7, 10, 20].

Важно, что выращивание гидрофитного рдеста P. anguillanus в условиях усиливающейся кислородной недостаточности (нормоксия → гипоксия → аноксия) проводило к последовательным перестройкам метаболизма на анаэробный тип [19]. Соответственно, метаболический ответ многолетних R. repens и R. lingua, произрастающих на подтопленных почвах, был не таким интенсивным, как у однолетнего R. sceleratus, растущего в условиях полного затопления. Незначительные отличия метаболитных профилей у гидрофитных E. hirsutum и E. palustre [22] также могли быть связаны с тем, что они произрастали в одинаковых условиях затопления.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что различия метаболомных профилей гидрофитных видов лютика обусловлены генетическими детерминантами (жизненная форма и стратегия адаптации), экологической нишей (биотоп) и непосредственным действием стрессора (затопление). Для подтверждения данного вывода в дальнейшем необходимо провести сравнение метаболомов близкородственных гидрофитных и мезофитных растений для большего числа видов и исследовать воздействие кислородного голодания на метаболомы гидрофитов и мезофитов в лабораторных экспериментах.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Благодарности. Исследования выполнены с использованием оборудования Ресурсного центра Санкт-Петербургского государственного университета «Развитие молекулярных и клеточных технологий» и посвящаются 300-летию Санкт-Петербургского государственного университета.

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией. Вклад каждого автора: П.Д. Смирнов — концепция и дизайн исследования, сбор и обработка материалов, написание текста, внесение окончательной правки; Р.К. Пузанский — хроматографическое исследование, анализ полученных данных, написание текста; С.А. Ванисов, М.Д. Дубровский — сбор и обработка материалов; А.Л. Шаварда — хроматографическое исследование, анализ полученных данных; М.Ф. Шишова — анализ полученных данных, обзор литературы; В.В. Емельянов — концепция и дизайн исследования, сбор и обработка материалов, хроматографическое исследование, анализ полученных данных, написание текста, обзор литературы, внесение окончательной правки, привлечение финансирования.

Источник финансирования. Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 22–24–00484, https://rscf.ru/project/22-24-00484/).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Об авторах

Павел Дмитриевич Смирнов

Санкт-Петербургский государственный университет

Email: p.d.smirnov@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-4663-8398
SPIN-код: 4273-1520
Россия, Санкт-Петербург

Роман Константинович Пузанский

Санкт-Петербургский государственный университет; Ботанический институт им. В.Л. Комарова РАН

Email: puzansky@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5862-2676
SPIN-код: 6399-2016

канд. биол. наук

Россия, Санкт-Петербург; Санкт-Петербург

Сергей Алексеевич Ванисов

Санкт-Петербургский государственный университет

Email: s.vanisov@mail.ru
Россия, Санкт-Петербург

Максим Дмитриевич Дубровский

Санкт-Петербургский государственный университет

Email: max.d10@mail.ru
Россия, Санкт-Петербург

Алексей Леонидович Шаварда

Санкт-Петербургский государственный университет; Ботанический институт им. В.Л. Комарова РАН

Email: stachyopsis@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-1778-2814
SPIN-код: 5637-5122

канд. биол. наук

Россия, Санкт-Петербург; Санкт-Петербург

Мария Федоровна Шишова

Санкт-Петербургский государственный университет

Email: mshishova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3657-2986
SPIN-код: 7842-7611

д-р биол. наук, профессор

Россия, Санкт-Петербург

Владислав Владимирович Емельянов

Санкт-Петербургский государственный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: bootika@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2323-5235
SPIN-код: 9460-1278
http://www.bio.spbu.ru/staff/id179_evv.php

канд. биол. наук, доцент

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы