Expression of kisspeptin and matrix metalloproteinases in human endometrial culture: a study of invasive and migratory properties

Full Text

Обоснование

Наружный генитальный эндометриоз (НГЭ) характеризуется ростом ткани, сходной с эндометрием, за пределами полости матки, что обусловлено протеолитическими свойствами стромы внутренней оболочки матки. В этом механизме задействованы различные протеазы, в том числе металлопротеиназы 2-го и 9-го типов [1, 2]. Очаги эндометриоза могут быть локализованы в слизистой оболочке, мышечной ткани, серозе, клетчатке, коже и даже в костной ткани [3]. Эндометриоз обладает способностью метастазировать — по одной из теорий распространение клеток осуществляется током крови или лимфы. Различные молекулы были интенсивно исследованы как потенциальные терапевтические цели, среди них ароматаза P450 [4], эстрогены [5], цитокины [6], фактор некроза опухоли [7] и др. Однако ни одна из предложенных сейчас терапий не гарантирует выздоровления и отсутствие рецидивов заболевания.

Кисспептин — пептидный гормон, подавляющий миграционную активность клеток трофобласта [8] и, возможно, регулирующий образование гетеротопий при эндометриозе. KISS1 был первоначально описан как белок, супрессирующий метастазирование опухолевых клеток при меланоме кожи [9]. У человека он был обнаружен как лиганд рецептора, связанного с G-белком 54 (GPR54), в настоящее время называемого KISS1R [10]. Ген KISS1 кодирует несколько белков, которые составляют семейство кисспептинов. Кисспептин представляет собой пептид, содержащий 145 аминокислотных остатка [11]. От C-конца может отщепляться 54-аминокислотный пептид — кисспептин 54 (КISS-54), который в основном вырабатывается в плаценте. Существуют также КISS-14, КISS-13, КISS-10. Они тоже обладают биологической активностью, хотя пока неясно, в какой степени эти пептиды генерируются эндогенно [12].

Ранее нами было выполнено исследование экспрессии кисспептина и его рецептора в ткани эндометрия и эндометриальных гетеротопий [13]. При иммуногистохимическом исследовании эндометрия и гетеротопий было выявлено, что KISS1/KISS1R экспрессируется как в основной, так и в контрольной группе. Уровень экспрессии KISS1/KISS1R в ткани эндометрия, взятого у пациентки с диагнозом НГЭ, был статистически значимо снижен по сравнению с контролем. Эти данные подтверждает другое исследование, в котором изучали НГЭ I и II степеней: при гормональном обследовании было обнаружено, что уровень кисспептина в периферической крови пациенток с НГЭ достоверно выше по сравнению с уровнем в контрольной группе. Было также показано, что в очагах эндометриоидных гетеротопий, которые располагались на брюшине малого таза, отмечалось достоверное повышение экспрессии белка КISS1 и рецептора KISS1R по сравнению с фрагментами интактной брюшины [14].

Многие исследователи сообщают, что в развитии эндометриоидных гетеротопий большую роль играют матриксные металлопротеиназы (ММП). Семейство ММП — это группа родственных по структуре цинксодержащих эндопептидаз, разрушающих базальные мембраны и внеклеточный матрикс при физиологических и патологических условиях [15]. KISS1 подавляет активность ряда ММП, что может рассматриваться в качестве механизма, посредством которого KISS1 подавляет метастазирование, а возможно, и прикрепление и проникновение фрагментов эндометриоидной ткани в различные органы при эндометриозе. В ряде исследований было продемонстрировано подавление 2-го или 9-го типа ММП белком кисспептином [1, 16]. Важно отметить, что активные ММП могут расщеплять пептидную связь между Gly118 и Leu119 в белковой последовательности KISS-54. В результате этого удаляются три аминокислоты с N-конца пептида, что приводит к инактивации КISS-54. Этот механизм может регулировать обратную связь между кисспептином и ММП.

Эндометрий — это сложная, многокомпонентная система, состоящая из покровного и железистого эпителия, стромы, основного вещества и кровеносных сосудов. Первые клеточные культуры эндометрия были выделены в 70-х гг. прошлого века [17], но до сих пор эта модель для изучения взаимодействия клеток и оценки действия лекарственных препаратов остается актуальной. Культуру эндометрия использовали также для изучения инвазии бластоцисты в стромальный слой эндометрия [18], исследования ориентации эмбриона в полости матки [19] и для получения мезенхимальных стволовых клеток [20].

Цель данного исследования заключалась в выделении клеточной культуры эндометрия от пациенток с НГЭ, характеристике миграционных свойств полученной культуры и оценке экспрессии KISS1/KISS1R с целью дальнейшего использования в качестве возможной модели для изучения лекарственных препаратов.

Методы

Дизайн исследования

Исследование проводили на материале, взятом у 7 пациенток. Весь материал был разделен на две группы: контрольную (n = 4) и группу с НГЭ. В группу с НГЭ входил материал от пациенток с НГЭ I (n = 1) и IV (n = 2) стадий. В контрольной группе биопсию эндометрия выполняли с диагностической целью путем проведения гистеро- или лапароскопии и пайпель-биопсии. Способ и результат выделения клеточной культуры не зависели от метода получения материала. Возраст пациенток составил от 23 до 38 лет. Все доноры проходили обследование в отделении оперативной гинекологии. В контрольной группе пациентки имели регулярный менструальный цикл. При обследовании у пациенток инфекций репродуктивного тракта выявлено не было. Материал для выделения клеточной культуры забирали на 21–22-й день менструального цикла в пяти случаях и на 7–12-й день — в двух случаях.

Методика выделения эндометриальной клеточной культуры отработана и подробно описана в статье Э.К. Айламазяна и др. [21]. В данной работе в качестве фермента использовали коллагеназу II типа (Gibco), клетки культивировали в среде DMEM/F-12 с 10 % FBS, оптимальная концентрация при высаживании на флакон равнялась 1 ∙ 10³ клеток в миллилитре. Описанная методика позволяет получить культуру эндометриальных клеток стромального и железистого происхождения для широкого спектра исследований. Для образования монослоя культуре клеток требовалось 1–2 дня. Иммуноцитохимический анализ проводили с помощью покровных стекол Menzel (d = 6 мм) на первом пассаже. В качестве первичных антител использовали: anti-kisspeptin monoclonal antibody (1 : 100, Abcam), anti-KISS1R polyclonal antibody (1 : 200, Abcam), anti-MMP-9 monoclonal antibody (1 : 100, abcam) и anti-cytokeratin-8 (1 : 100, Dako). В качестве вторичных антител применяли антитела, конъюгированные с флуорохромом Alexa Fluor 647 и AlexaFluor 488 (1 : 1000, Abcam). В качестве контроля специфичности антител производили иммуноцитохимическую реакцию без использования первичных антител.

Культуры криоконсервировали в 10 % DMSO на сыворотке, разливали суспензию клеток в криовиалы с концентрацией не менее 1 ∙ 10⁶. Криовиалы переносили в контейнер для замораживания при –80 °С (Mr. Frosty, Nalgene). Через сутки клетки переносили в сосуды Дюара с жидким азотом для длительного хранения. Процедуру оттаивания проводили в водяной бане при 37 °С. Жизнеспособность размороженной культуры определяли с помощью красителя трипанового синего.

Для оценки инвазии клеток применяли вставки Falcon в 24-луночные планшеты (BD Biosciences, США) диаметром пор 8 мкм. Суспензию эндометриальных клеток в среде DMEM/F-12 вносили в верхнюю камеру (вставку), а в нижнюю камеру (лунку) вносили фетальную телячью сыворотку, а во второй серии экспериментов в нижнюю камеру вводили аутологичную перитонеальную жидкость. Планшеты инкубировали 10 ч при 37 °С в атмосфере с 5 % CO₂ и затем подсчитывали количество клеток, проникших через поры вставки в нижнюю камеру.

Тест на зарастание раны (Scratch-тест) проводили с помощью µ-Dish 35 mm, high (Ibidi). Культуру высаживали в две лунки в концентрации 35 000 кл/мл, монослой доводили до 90–95 % конфлюэнтности, наносили на монослое «рану», убирая специальную рамку из чашки Петри. Открепившиеся клетки удаляли промывкой DPBS и добавляли свежую среду. Сканирование осуществляли через 12, 24, 48 и 72 ч.

Анализ в подгруппах

Результаты иммуноцитохимического исследования архивировали на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе Olympus FlueView1000 с программным обеспечением ASW. Оценку осуществляли в программе Морфология 5.0, при этом исследовали такие параметры, как относительная площадь экспрессии и средняя яркость.

Статистический анализ

Для статистической оценки различий значений признаков, имеющих непрерывное распределение, применяли ранговый U-критерий Манна – Уитни в программе Statistica 7.0. Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы принимали равным 0,05.

Результаты и обсуждение

Ранее нами было показано, что KISS1/KISS1R в большей степени экспрессируется цилиндрическими клетками эпителия железы, а не соединительнотканными клетками стромы [13], в связи с чем клеточная культура была проанализирована на наличие эпителиоподобных железистых клеток с использованием маркера цитокератина-8. По данным S. Wonodirekso, цитокератин-8 — это цитоплазматический белок, являющийся специфическим маркером клеток однослойного плоского эпителия. Число железистых клеток варьировало от образца к образцу (S_эксСK-8 = 5,72–38,29 %) [22].

Было установлено, что кисспептин, его рецептор и ММП-2, -9 присутствуют в первичной клеточной культуре эндометрия в единичных клетках (табл. 1).

 

Таблица 1 / Table 1

Показатели экспрессии исследуемых белков в клеточной культуре эндометрия

Protein expression indicators in the endometrial cell cultures

Возраст	День менструального цикла	Контроль/ степень наружного генитального эндометриоза	Относительная площадь экспрессии KISS1,%	Относительная площадь экспрессии KISS1R, %	Относительная площадь экспрессии MMП-2, %	Относительная площадь экспрессии ММП-9, %
33	22-й	Контроль	1,022	3,716	1,957	2,976
27	7-й	Контроль	1,938	2,713	2,510	2,162
30	21-й	Контроль	1,405	0,948	1,558	2,371
38	20-й	Контроль	2,032	1,932	1,302	1,938
35	22-й	I	1,305	2,167	1,136	1,062
23	12-й	IV	0,916	1,603	1,567	2,531
32	9-й	IV	0,568	3,599	8,789	2,872

 

При оценке относительной площади экспрессии кисспептина была выявлена тенденция к уменьшению уровня белка при НГЭ. При этом при НГЭ IV степени были установлены самые низкие показатели (S_эксKISS1 = 0,568). Эти различия не являются статистически достоверными. Для более тщательного анализа требуется увеличить количество исследуемых клеточных культур. При оценке рецептора к кисспептину не было обнаружено никаких закономерных различий в уровне экспрессии.

Миграция и инвазия — ключевые свойства живых клеток, играющие решающую роль в нормальном развитии организма, иммунного ответа и патологических процессов, таких как метастазирование при раке и воспалительные процессы [23–25]. Изучение миграции клеток в исследованиях эндометриоза представляет особый интерес, поскольку одной из основных проблем НГЭ является образование эндометриоидных гетеротопий. В нашем исследовании был проведен анализ инвазии клеточных культур, основанный на измерении подвижности клеток и активности движения клеток по градиенту химиоаттрактанта. Было показано, что в контрольной группе количество клеток, прошедших через трансаэробный фильтр (пора 8 мкм) и прикрепившихся на поверхности, варьировало от 4,6 до 16,3 в пяти полях зрения (при увеличении ×40). В клеточной культуре, полученной при эндометриозе, эти цифры практически не отличались и равнялись 6,5–12,8 (рис. 1). Добавление перитонеальной жидкости в нижнюю камеру не влияло на миграционные способности клеток контрольной группы, однако усиливало инвазию в группе с НГЭ. Полученные данные объясняются повышением в перитонеальной жидкости пациенток с НГЭ числа цитокинов, активирующих ангиогенез (ИЛ-1β, ИЛ-6 и ИЛ-8) и стимулирующих адгезию клеток эндометрия к мезотелию брюшины (ФНОα) [26], а также факторов роста (VEGF) [27], усиливающих инвазивные свойства культуры клеток.

 

Рис. 1. Анализ инвазии клеточных культур по хемоаттрактанту (увеличение ×40): a — контрольная клеточная культура эндометрия; b — клеточная культура эндометрия от пациенток с наружным генитальным эндометриозом

Fig. 1. Invasion assay data (in response to a chemotactic gradient; ×40 magnification): a — control cell endometrial culture; b — endometrial cell culture from patients with endometriosis genitalis externa

 

Ранее исследователями не было выявлено существенных различий между пролиферативной активностью клеток при эндометриозе и у здоровых пациенток [28]. Мы изучали подвижность этих двух культур клеток с помощью Scratch-теста. Изменения числа клеток в ране, их местоположение и форму фиксировали с помощью цифровой фотокамеры. При анализе полученного материала установлено, что клеточные линии принципиально различаются между собой по миграционной способности. В контрольной культуре клеток через 24 ч площадь раны составляла 27,29 % от площади препарата, через 48 ч — 17,61 %. В культуре от пациенток с НГЭ площадь раны через 24 ч равнялась 20,77 %, через 48 ч — 8,21 % (рис. 2). Данные различия статистически достоверны (р < 0,05) и, возможно, связаны со способностью кисспептина ингибировать миграцию клеток. Исходя из ширины раны, мы рассчитали расстояние миграции и скорость движения клеток, которая оказалась 36,53 мкм/ч. Так как в клеточной культуре от пациенток с НГЭ был снижен уровень KISS1, миграционная активность этой линии была повышена по сравнению с контролем. Однако стоит отметить, что на эти различия могут влиять индивидуальные особенности пациенток, от которых был получен материал эндометрия: гормональный фон, возраст, особенности течения эндометриоза, сопутствующие заболевания и т. д. В ряде исследований было показано, что активация KISS1R с помощью KISS1 ингибирует подвижность клеток, пролиферацию, инвазию, хемотаксис и образование метастазов [29–31].

 

Рис. 2. Тест на зарастание раны — Scratch-тест (выделена площадь раны, увеличение ×400)

Fig. 2. Wound healing assay data (the wound area is highlighted; ×400 magnification)

 

Обе культуры демонстрируют одинаковый тип движения по субстрату: отмечается коллективная миграция, то есть клетки переднего края тянут за собой остальной монослой, так как его клетки находятся в плотном контакте. Одиночные клетки практически не покидают монослой и в «рану» не мигрируют, а клетки, находящиеся в «ране», через мезенхимно-эпителиальный переход примыкают к монослою.

В исследовании показано, что при «поломке» рецептора к кисспептину половое созревание не происходит [32]. Система КISS1/KISS1R подавляет метастазирование и регулирует выработку гонадотропин-рилизинг-гормона, который, в свою очередь, способствует секреции эстрадиола и прогестерона, что дает возможность предположить ее связь с гормонально зависимыми заболеваниями, такими как НГЭ. Инвазию клеток эндометрия и образование гетеротопий часто сравнивают с агрессивным развитием рака и инвазией трофобласта при наступлении беременности — во всех этих процессах задействованы ММП и другие ферменты. Экспрессия кисспептина была исследована при раке эндометрия: Kang et al. доказали, что экспрессия KISS1R обратно зависима от развития опухоли и гистологической стадии эндометриального рака [33]. В этом исследовании продукция KISS1 была ниже в эндометриальной клеточной культуре с НГЭ, чем в нормальной культуре клеток, в то же время экспрессия рецептора не изменялась. Есть данные о низком уровне KISS1 у женщин с необъяснимым бесплодием (исследование перед экстракорпоральным оплодотворением) [34]. Уровень KISS1 оказывает влияние на оплодотворение ооцитов, подготовку эндометриальных слоев для имплантации эмбриона и, следовательно, успешную беременность.

Кисспептин может синтезироваться не только в гипоталамусе, но и в других органах, восприимчивых к стероидным гормонам. Оболочка матки состоит из эндометриальных эпителиальных клеток и эндометриальных стромальных клеток, функции этих клеток различны, но секретируемые молекулы, экспрессируемые рецепторы и молекулы адгезии в первую очередь способствуют прикреплению и развитию эмбриона. С другой стороны, уникальный молекулярный профиль клеток эндометрия является неблагоприятным фактором, так как позволяет им прикрепляться, имплантироваться и приживаться в других тканях, формируя эндометриоидные очаги. Исследование культуры эндометрия от пациенток с эндометриозом и выявление в них кисспептина и рецептора к этому белку в железистых клетках обозначает новую таргетную мишень.

Установлен высокий пролиферативный потенциал культуры; высокая жизнеспособность после криоконсервации (90–95 %). Во всех культивируемых образцах эндометрия преобладали клетки с фибробластоподобной морфологией, что дало нам основание предполагать отсутствие контаминации эндометриальной линии со стороны других клеточных популяций.

Заключение

В результате исследования был отработан ферментативный метод получения эндометриальной клеточной культуры от пациенток с НГЭ и от здоровых женщин. Было установлено, что в культурах присутствуют KISS1, KISS1R, ММП-2 и ММП-9. Кисспептин и его рецептор показали статистически не различимые уровни экспрессии как в контроле, так и в эутопическом эндометрии. В результате анализа экспрессии ММП-2, -9 в культуре было выяснено, что статистические различия между контролем и исследуемой группой отсутствовали, возможно, это обусловлено небольшой выборкой.

Так как исследуемые молекулярные мишени связаны с миграционными и инвазивными свойствами, нами был проведен Scratch- и миграционный тесты, которые показали, что клетки эндометрия при НГЭ обладают повышенной скоростью движения по субстрату.

В дальнейшем необходимо увеличить выборку, оценить экспрессию молекулярных мишеней в эндометриальных клетках в разных фазах менструального цикла и в разных возрастных группах, а также получить эндометриоидные клетки из гетеротопий.

About the authors

Tatyana S. Kleimenova

The Research Institute of Obstetrics, Gynecology, and Reproductology named after D.O. Ott; aint Petersburg State Pediatric Medical University of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Author for correspondence.
Email: kleimenovats@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-0767-5564
SPIN-code: 4876-3420
Scopus Author ID: 57194462104
ResearcherId: Р-7344-2016

Junior Researcher. The Laboratory of Cell Biology, the Department of Pathomorphology; Senior Laboratory Assistant. The Department of Medical Biology

Russian Federation, Saint Petersburg

Anna O. Drobintseva

The Research Institute of Obstetrics, Gynecology, and Reproductology named after D.O. Ott; aint Petersburg State Pediatric Medical University of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: anna.drobintseva@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-6833-6243
SPIN-code: 4277-0122
Scopus Author ID: 57188840020
ResearcherId: K-1210-2013

PhD, Senior Researcher. The Laboratory of Cell Biology, the Department of Pathomorphology; Associate Professor. The Department of Medical Biology

Russian Federation, Saint Petersburg

Victoria O. Polyakova

The Research Institute of Obstetrics, Gynecology, and Reproductology named after D.O. Ott; aint Petersburg State University

Email: vopol@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8682-9909
SPIN-code: 5581-5413
Scopus Author ID: 7004515705
ResearcherId: O-1461-2016

PhD, DSci (Biology), Professor, Professor of the Russian Academy of Sciences, the Head of the Laboratory of Cell Biology; Professor. The Department of General Physiology, Biological Faculty

Russian Federation, Saint Petersburg

Anna A. Tsypurdeyeva

The Research Institute of Obstetrics, Gynecology, and Reproductology named after D.O. Ott

Email: tsypurdeeva@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7774-2094
SPIN-code: 5208-9707

MD, PhD, Senior Researcher. The Department of Gynecology with the Operating Unit

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files