Rapid tests in the diagnostics of sexually transmitted infections

Full Text

Введение Инфекции, передаваемые половым путем (ИППП), представляют серьезную угрозу репродуктивному здоровью населения. Известно, что своевременно установленный диагноз является залогом успешного лечения пациента и его партнера и препятствует развитию осложнений и дальнейшему распространению инфекции, в связи с чем разработка быстрых и точных тестов является одним из приоритетов развития микробиологической диагностики. Быстрыми тестами принято называть тесты, которые обеспечивают быстрое получение результатов, идеально, в течение 30 минут. Быстрые тесты можно разделить на тесты, предназначенные для использования в лаборатории, и тесты, предназначенные для использования в кабинете врача во время приема пациента, так называемые point-of-care (POC) тесты. Очевидно, что принципиальное различие между ними заключается в том, что для выполнения быстрых лабораторных тестов необходимы лабораторная инфраструктура и обученный лабораторный персонал. В 2003 году Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) предложила критерии идеального POC-теста для диагностики ИППП, обозначенные акронимом ASSURED (Affordable; Sensitive; Specific; User-friendly; Rapid and Robust; Equipment-free; Delivered to end users), который можно перевести как доступный, чувствительный и специфичный, простой в использовании, быстрый и нетребовательный к условиям хранения, выполняемый без оборудования или с минимальным оборудованием, доставляемый конечному пользователю [17]. Очевидно, что сфера применения POC-тестов существенно шире, чем быстрых лабораторных тестов, в связи с чем термин «быстрый тест» очень часто используется как синоним термина «POC-тест». Тем не менее быстрые лабораторные тесты также могут иметь свое место в диагностике ИППП, например, в медицинских учреждениях, имеющих высоко развитую логистическую инфраструктуру между клиникой и лабораторией. Целью данной работы было обобщение данных литературы по вопросам разработки и использования быстрых тестов для диагностики основных ИППП (хламидийной инфекции, гонореи, трихомониаза, сифилиса и генитального герпеса), а также перспективных исследований в этом направлении. Эпидемиология и клиническая значимость инфекций, передаваемых половым путем Более 30 инфекционных агентов (бактериальных, вирусных, грибковых и протозойных) передаются преимущественно половым путем; вызываемые ими заболевания представляют серьезную угрозу репродуктивному здоровью человека. Спектр клинических проявлений ИППП включает воспалительные заболевания нижних и верхних отделов урогенитального тракта мужчин и женщин, бесплодие, заболевания новорожденных детей (табл. 1). По оценке ВОЗ, в 2008 году в мире было выявлено около 500 миллионов новых случаев ИППП среди населения в возрасте от 15 до 49 лет (105,7 миллионов - урогенитальной хламидийной инфекции, 106,1 миллионов - гонореи, 276,4 миллионов - трихомониаза и 10,6 миллионов - сифилиса) [43]. В Российской Федерации, согласно данным официальной статистики, в 2008 году показатели заболеваемости хламидийной инфекцией равнялись 89,5, гонореей - 56,4, трихомониазом - 167,4, сифилисом - 59,9, генитальным герпесом - 23 случая на 100 тысяч населения [1]. Необходимо отметить, что очень часто ИППП не имеют специфических проявлений или протекают бессимптомно. Так, до 50 % мужчин и до 90 % женщин с хламидийной инфекцией могут не иметь симптомов заболевания [20]. Бессимптомная гонококковая инфекция также встречается достаточно часто - до 10 % случаев у мужчин, и до 50 % (по некоторым данным - до 90 %) - у женщин [13]. Трихомониаз протекает бессимптомно у 70-80 % мужчин и 50 % женщин [37]. Это существенно ограничивает возможности синдромного подхода, являющегося основным в борьбе против ИППП во многих регионах мира с низким уровнем дохода [44] и делает ключевой роль микробиологической диагностики в установлении диагноза. Традиционная диагностика инфекций, передаваемых половым путем Для диагностики ИППП применяют универсальные методы клинической микробиологии - культуральные, микроскопические, иммунологические (в том числе серологические), молекулярно-биологические (табл. 2). Несмотря на то, что большинство микроскопических методов часто рассматриваются как POC-тесты, так как их выполнение не требует большого количества времени и оборудования, кроме микроскопа, их использование в этом качестве очень ограничено, ввиду отсутствия у клиницистов навыков микроскопии, а также по причине их невысокой (в некоторых случаях - неприемлемо низкой) чувствительности. Внедрение методов амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) в микробиологическую диагностику значительно повысило ее эффективность. Преимущества МАНК перед другими микробиологическими методами заключаются в том, что они сочетают высокую чувствительность с высокой специфичностью, в высокой степени стандартизированы и автоматизированы, имеют высокую пропускную способность. При использовании МАНК не требуется сохранения жизнеспособности возбудителя, поэтому они менее требовательны к условиям хранения и транспортировки образцов. МАНК предоставляют возможность тестирования образцов, полученных неинвазивным способом, а также образцов, полученных самим пациентом. В настоящее время МАНК являются основным способом диагностики хламидийной инфекции и активно внедряются в протоколы диагностики гонореи, трихомониаза, сифилиса и генитального герпеса [45]. Быстрые тесты в диагностике инфекций, передаваемых половым путем Разработка быстрых тестов, позволяющих в течение нескольких минут или десятков минут, желательно во время приема пациента врачом, установить этиологический диагноз, является одним из основных направлений современной микробиологической диагностики, включая диагностику ИППП. Своевременно проведенное этиотропное лечение обеспечивает лучший клинический эффект, а ограничение использования эмпирической антибиотикотерапии в долгосрочной перспективе может способствовать снижению развития антибиотикорезистентности микроорганизмов. Кроме того, необходимо учитывать, что значительная часть пациентов не приходит на повторный прием, поэтому немедленно начатое лечение позволяет снизить риск развития осложнений у инфицированных лиц, а также распространения инфекций. Математическое моделирование показало, что повсеместное внедрение идеального POC-теста на сифилис могло бы спасти более 201 тысячи жизней и предотвратить 215 тысяч мертворождений в год во всем мире. Внедрение POC-тестов на гонорею, хламидийную инфекцию и ВИЧ-инфекцию могло бы сохранить приблизительно 4 миллиона лет жизни, скорректированных по нетрудоспособности (disability-adjusted life years (DALYs)) и предотвратить более 16,5 миллионов случаев гонококковой и хламидийной инфекций и более 212 тысяч случаев ВИЧ-инфекции в год [3]. На сегодняшний день подавляющее большинство POC-тестов для диагностики ИППП основано на иммунологических реакциях (в основном, иммунохроматографии и агглютинации) для выявления антигенов или антител [45]. Современные иммунологические POC-тесты обладают достаточно высокой специфичностью, однако их чувствительность существенно варьирует (табл. 3). В целом быстрые иммунологические тесты обладают достаточно высокой чувствительностью для выявления антител, по причине их высокого содержания в крови, однако они менее чувствительны при выявлении антигенов. Так, большинство иммунологических POC-тестов для диагностики хламидийной и гонококковой инфекций имеют чувствительность 50-70 % по сравнению с МАНК (табл. 3). Необходимо подчеркнуть, что показатели чувствительности существенно зависят от референтного теста, по отношению к которому определяются диагностические характеристики оцениваемого теста. Например, чувствительность одного из тестов для выявления хламидий (Clearview Chlamydia test) составляла 95 % при сравнении с результатами культурального исследования [39], и только 32,8 % при сравнении с результатами ПЦР [46] (табл. 3). Так как в настоящее время адекватную диагностику многих инфекций, включая инфекции урогенитального тракта, могут обеспечить только молекулярно-биологические методы, в последние годы мировыми производителями диагностических систем стали разрабатываться быстрые тесты на основе методов анализа нуклеиновых кислот [27]. Для того чтобы эти методы могли применяться в кабинете врача, необходимо сокращение продолжительности реакции и полная автоматизация процесса. Одним из решений данной задачи представляется применение микрофлюидных технологий [7, 12]. Микрофлюидика - междисциплинарная наука, описывающая поведение малых объемов и потоков жидкостей, и молекулярная диагностика является одной из важнейших сфер ее применения. Биоаналитические системы, основанные на микрофлюидике, позволяют миниатюризацию и интеграцию процессов, которые традиционно выполняются в полном масштабе как последовательность отдельных операций [42]. Так, с применением микрофлюидных технологий недавно были разработаны иммунологические POC-тесты на основе миниатюризированного иммуноферментного анализа для серологической диагностики сифилиса и ВИЧ, чувствительность и специфичность которых была сопоставима с таковыми традиционных серологических тестов, при этом для анализа использовался только 1 мкл цельной крови [7]. Миниатюризация ПЦР-систем также может обеспечить значительные преимущества, включая сокращение времени анализа, уменьшение расхода реагентов, портативность, а также возможность интеграции множественных пре- и пост-ПЦР процессорных модулей в самодостаточную систему с полной автоматизацией [32]. Мультиплексное тестирование, т. е. одновременное тестирование на целый ряд микроорганизмов, которые могут встречаться в определенном анатомическом сайте при определенном клиническом состоянии, также является технологическим подходом, позволяющим сократить время установления этиологического диагноза. В качестве примера слияния метода амплификации нуклеиновых кислот (ПЦР в реальном времени), микрофлюидных и мультиплексных технологий можно привести коммерчески доступную систему GeneXpert (Cepheid), предназначенную для одновременной диагностики хламидийной и гонококковой инфекций в кабинете врача [11]. Ручные операции сведены к минимуму, а именно к внесению материала от пациента в картридж. Тест прост в применении, обладает высокой чувствительностью (выше 97 %) и специфичностью (выше 99 %) (табл. 3). Тем не менее его трудно назвать идеальным, с точки зрения критериев ASSURED, POC-тестом - он длительный (продолжительность анализа составляет около 90 минут), дорогой (требует дорогостоящего оборудования). Значительный потенциал для создания POC- тестов содержится также в применении электрохимических ДНК-биосенсоров [10, 14, 22, 30]. В основе метода лежит взаимодействие между нуклеиновой кислотой микроорганизма, амплифицированной или неамплифицированной, и комплементарными олигонуклеотидными зондами, иммобилизованными на микроэлектродах (сенсорах), в результате чего генерируется электрохимический сигнал, детектируемый сенсором [9]. Этот подход реализован в диагностической платформе для POC-диагностики ИППП, разработанной компанией Atlas Genetics. Это быстрый тест (время анализа - около 25 минут), полностью автоматизированный, основанный на ПЦР-амплификации с последующей электрохимической детекцией продуктов амплификации. Чувствительность и специфичность теста очень высоки - в доклинических испытаниях они составили 98,1 % и 98 %, соответственно, для выявления C. trachomatis [33], и 95,5 % и 95,7 %, соответственно, для выявления T. vaginalis [34]. Данная система на сегодняшний день коммерчески не доступна. Существенным недостатком аналитических ПЦР-систем в контексте их применения для POC-диагностики является необходимость в сложном и часто дорогостоящем оборудовании. Решению этой проблемы могло бы способствовать внедрение методов изотермической амплификации, когда реакция амплификации проходит при фиксированной температуре в обычном термоблоке. Так, недавно была разработана методика выявления ДНК вируса простого герпеса (HSV) и реализована в коммерческий тест IsoAMP HSV компанией Biohelix, основанная на изотермической хеликаза-зависимой амплификации (Helicase-Dependent Amplification, HDA) [18], в которой для разделения нитей ДНК используется не высокотемпературная денатурация, а ферментативная активность ДНК-хеликазы [41]. Подготовка образца к амплификации заключается в его простом разведении, а этап анализа продуктов амплификации сводится к установке пробирки с ампликонами после реакции в кассету для последующей колориметрической детекции [18]. Тест имеет чувствительность и специфичность, сопоставимую с ПЦР (табл. 3), прост в применении, не требует инструментов и оборудования (кроме микродозатора и термоблока), что делает его потенциально пригодным для POC-диагностики [21]. Полагают, что разработка POC-тестов на основе изотермических амплификационных методов является важным направлением развития POC-диагностики инфекционных заболеваний [8]. Заключение Для эффективного контроля над ИППП необходима разработка и внедрение точных, быстрых и недорогих тестов. Современные POC-тесты, в большинстве своем основанные на иммунологических реакциях, как правило, высокоспецифичны, однако их чувствительность недостаточно высока, особенно у тестов для выявления антигенов. Последние достижения в области молекулярных диагностических технологий (амплификационных, микрофлюидных, биосенсорных) открывают возможности для создания высокочувствительных и высокоспецифичных, простых в использовании, доступных POC-тестов для диагностики ИППП.

About the authors

Olga Sergeyevna Ryzhkova

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS

Email: olga81@yandex.ru
researcher, Laboratory of Microbiology

References

Supplementary files