Diagnostic value of p16inkα/Ki-67 Dual-stained cytology in HPV-associated cervical diseases

Full Text

В настоящее время общеизвестен тот факт, что для развития рака шейки матки необходимо присутствие вируса папилломы человека (ВПЧ) высокого онкогенного риска. В то же время каждый второй житель земного шара с началом половой жизни имеет шанс инфицирования ВПЧ [2, 10]. При этом вероятность развития ВПЧ-ассоциированного поражения шейки матки тяжелой степени равна 1 : 250. По данным отечественных авторов, ВПЧ обнаружен у 30,3 % здорового населения Европейского региона нашей страны [1]. Наиболее подвержена инфицированию ВПЧ возрастная группа 18-30 лет. Частота передачи вируса достигает 80 % при однократном половом контакте, до 60 % молодых людей приобретают ВПЧ в течение двух лет после начала половой жизни [4]. Однако ведущим фактором канцерогенеза является не инфицирование ВПЧ, а развитие персистирующей и интегрированной формы папилломавирусной инфекции (ПВИ). Известно, что в 70 % случаев ПВИ заканчивается спонтанным выздоровлением в течение 1 года, а в 90 % случаев - в течение 2 лет, но длительная персистенция типов ВПЧ высокого онкогенного риска (более 2 лет) является наиболее опасным фактором прогрессии в предрак и рак шейки матки [8, 12]. В современных условиях развития науки известны и доступны три пути профилактики рака шейки матки, каждый из которых имеет равные права на реализацию, но требует соблюдения определенных условий. Во-первых, это отказ (воздержание) от половой жизни или соблюдение условий моногамии обоими половыми партнерами. Данный путь может реализоваться лишь в небольших регионах, а значит он не имеет большого значения в профилактике цервикального рака в современном мире. Во-вторых, это применение профилактических вакцин до первого полового контакта (эффективность метода возрастает при применении среди представителей как женского, так и мужского пола, и считается перспективой для современных молодых женщин). В-третьих, проведение обязательного цервикального скрининга с применением цитологического метода и/или определения ДНК ВПЧ высокого онкогенного риска. В странах с обязательными скрининговыми программами заболеваемость и смертность от рака шейки матки снизилась на 70 %, однако цитологический метод, являющийся основой цервикального скрининга в большинстве стран, демонстрирует низкую чувствительность [3]. Высокая частота ложноотрицательных результатов оценки цервикальных мазков, а также доказанная вероятность регресса минимальных степеней диспластических поражений цервикального эпителия и необходимость идентификации тех вирус-индуцированных цервикальных дисплазий, которые с высокой долей вероятности будут прогрессировать в инвазивный рак, привели к необходимости поиска и внедрения новых методов верификации не столько присутствия ДНК ВПЧ в цервикальном эпителии, сколько обнаружения персистирующей и прогрессирующей формы папилломавирусной инфекции (ПВИ) [5, 11]. Такими методами оказались иммуноцитохимические методы определения наличия и степени экспрессии вирусных (ДНК, м-РНК) и клеточных (р16inkα, Ki-67 и др.) биомаркеров вирус-индуцированной пролиферации [13]. Целью исследования явилась сравнительная оценка прогностической ценности цитологического и иммуноцитохимического методов исследования при диагностике ВПЧ-ассоциированных заболеваний шейки матки. Материалы и методы Обследовано 100 пациенток в возрасте 20-49 лет, обратившихся в амбулаторное звено с жалобами, не связанными с патологией шейки матки, например нарушения менструального цикла, бесплодие, планирование беременности, плановый профилактический осмотр. Методы обследования включали: онкоцитологическое исследование в режиме цервикального скрининга методом автоматизированной жидкостной цитологии NOVAPREP-25 (NOVACYT), ВПЧ-тестирование методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с типированием вируса, иммуноцитохимическое исследование цитологических препаратов с оценкой ко-экспрессии онкопротеинов р16inkα и Ki-67 по стандартной методике с использованием набора Cintec plus; кольпоскопию и прицельную биопсию (по показаниям) с гистологическим исследованием полученного материала. Степень экспрессии онкопротеинов оценивалась как положительная, слабоположительная и отрицательная в зависимости от наличия и степени интенсивности окраски препарата. Для количественного анализа ко-экспрессии использовали систему компьютерного анализа изображений «Морфология 5.2» (ВидеоТест, Россия). Интерпретации результатов цитологического исследования мазков-соскобов с поверхности шейки матки и из цервикального канала проводилась согласно классификационной системе Бетесда (2001 г.). Для оценки диагностической ценности не инвазивных и малоинвазивных методов обнаружения плоскоклеточных поражений эпителия шейки матки у пациенток с подозрением на ПВИ нами применялись следующие статистические параметры: положительная прогностическая значимость, чувствительность и специфичность метода. Результаты Средний возраст обследованных больных составил 30,8 ± 6,56 лет. В обследованной группе частота выявления ВПЧ высокого онкогенного риска составила 50 %. Определение типа ВПЧ выполнено 37 пациенткам, при этом 17 (45,9 %) пациенток были инфицированы несколькими типами ВПЧ высокого онкогенного риска единовременно. Распределение типов ВПЧ в обследованной группе было следующим: преобладающим по частоте был 16 тип - 19 (51,3 %), на втором месте по частоте выявления был 31 тип - 10 (27 %), на третьем месте оказались 56 тип - 6 (16,2 %) и 18 тип - 5 (13,5 %). При ДНК-типировании вируса папилломы человека также были обнаружены 52 и 33 типы ВПЧ - 4 (10,8 %); 51 и 58 типы - 3 (8,1 %); 45 тип - 2 (5,4 %); 35, 39 и 66 типы - 1 (2,7 %). По результатам онкоцитологического исследования в 60 % случаев интраэпителиальные изменения (категория NIL по системе Бетесда), в 18 % случаев были обнаружены цитологические признаки ПВИ (дискариоз, койлоцитоз и т. д.), в 9 % случаев обнаружены атипичные клетки неясного значения (ASCUS), в 9 % случаев - плоскоклеточные интраэпителиальные поражения низкой степени (LSIL), в 3 % случаев - атипичные клетки, не позволяющие исключить HSIL (ASC-H), в 1 % случаев - плоскоклеточные интраэпителиальные поражения высокой степени (HSIL). Мы сопоставили данные цитологического скрининга с результатами гистологического исследования. Положительная прогностическая ценность цитологического метода для определения вирусного поражения в целом составила 88,8 %, чувствительность метода - 44,4 %, специфичность - 72,7 %. Для оценки результатов кольпоскопического исследования мы применяли международную классификацию кольпоскопических терминов, принятую в 2011 году в Рио-де-Жанейро (IFCPC), согласно которой у 15 % обследованных нами пациенток была обнаружена нормальная кольпоскопическая картина. Аномальная кольпоскопическая картина 1 степени была выявлена в 66 %, 2 степени - в 19 % случаев. При иммуноцитохимическом исследовании клеточного материала, полученного из эндо- и экзоцервикса, положительная экспрессия протеина р16inkα выявлялась в 74 % случаев, при этом в 19 % экспрессия расценивалась как слабоположительная, а в остальных 55 % случаев экспрессия протеина р16inkα была положительной. Экспрессия маркера клеточной пролиферации, протеина Ki-67, выявлялась в 39 %, при этом в 14 % случаев экспрессия расценивалась как слабоположительная, а в 25 % случаев выявлена положительная экспрессия протеина Ki-67. Прицельная биопсия была выполнена в 65 случаях. Согласно результатам гистологического исследования биоптатов шейки матки в большинстве случаев (49,23 %) были диагностированы неспецифические гистологические признаки ПВИ (воспалительная атипия, дискератоз, койлоцитоз, паракератоз), в 16,92 % случаев в биоптатах определялась цервикальная эктопия с элементами метаплазии. В 33,9 % случаев при морфологическом исследовании биоптатов шейки матки обнаруживалась дисплазия различной степени тяжести: дисплазия легкой степени (CIN I) была обнаружена в 15,4 % случаев, дисплазия средней степени (CIN II) - в 10,76 %, тяжелая дисплазия (CIN III) - в 6,15 %, карцинома in situ (CIS) - в 1,54 %. Необходимо отметить, что в нашем исследовании при цитологической и морфологической оценке степени выраженности ВПЧ-ассоциированного поражения цервикального эпителия расхождений в результатах исследований не было выявлено. На основе полученных данных была произведена оценка положительной прогностической ценности иммуноцитохимического исследования с оценкой экспрессии протеинов р16inkα и Ki-67 для диагностики морфологически верифицированного ВПЧ-ассоциированного поражения цервикального эпителия. По результатам расчетов положительная прогностическая значимость оценки экспрессии протеина р16inkα составила 84 %, чувствительность - 77 %, а специфичность - 27 %. Положительная прогностическая значимость оценки экспрессии протеина Ki-67 составила 87,5 %, чувствительность - 42 %, а специфичность - 80 %. При этом положительная прогностическая ценность для определения дисплазии составила 100 % по обоим иммуноцитохимическим показателям экспрессии, а положительная прогностическая значимость и чувствительность ИЦХ-метода для определения наличия неспецифических признаков ВПЧ-ассоциированного поражения цервикального эпителия составили 77 и 87,5 % по протеину р16inkα, соответственно. У 34 пациенток, которым была выполнена прицельная биопсия шейки матки, при ИЦХ-исследовании выявлялась ко-экспрессия протеинов р16inkα и Ki-67, при этом положительная прогностическая значимость иммуноцитохимического метода была выше и составила 86 %, а чувствительность метода - 71 %, специфичность - 50 %. Необходимо отдельно отметить, что чувствительность ИЦХ-метода исследования при выявлении ко-экспрессии протеинов р16inkα и Ki-67 для выявления дисплазии составила 60 %, для выявления цитологических признаков поражения клетки ДНК ВПЧ высокого онкогенного риска чувствительность ко-экспрессии достигала 77 %. Выводы Цитологический метод исследования является одним из наиболее доступных и распространенных методов цервикального скрининга. В то же время высокая специфичность, но низкая чувствительность данного теста определяют необходимость поиска новых, более специфических методов диагностики ВПЧ-ассоциированного поражения шейки матки. Включение в цервикальный скрининг методов идентификации ВПЧ высокого онкогенного риска (метод ПЦР в реальном времени, основанном на реакции амплификации ДНК вируса, Digene-тест с применением ДНК-гибридизации) позволяет оптимизировать организацию цервикального скрининга и выявить группы пациенток, нуждающихся в дополнительном обследовании с применением инвазивных методик [6, 7, 9]. В то же время положительный результат ВПЧ-теста позволяет лишь определить группу риска, но не диагностировать предрак или рак шейки матки. Внедрение в клиническую практику иммуноцитохимического метода оценки ко-экспрессии белков клеточной пролиферации p16ink4a и Ki67 и применение его в сочетании с цитологическим методом позволит не только повысить чувствительность и специфичность неинвазивных способов диагностики вирус-ассоцированного поражения цервикального эпителия, но и создать четкие алгоритмы ведения пациенток группы высокого риска, избежать хирургического лечения в случаях поражений, имеющих высокую вероятность спонтанного регресса, что особенно важно у молодых женщин репродуктивного возраста.

About the authors

Armine Robertovna Khachaturyan

I. P. Pavlov State Medical University of St. Petersburg

Email: armine2709@rambler.ru
associate professor of the chair of Obstetrics and Gynecology

Ekaterina Konstantinovna Orekhova

EMC clinic

Email: orekhovakatherine@gmail.com
оbstetrician-gynecologist

Gulrukhsor Khaybulloevna Tolibova

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS

Email: gulyatolibova@mail.ru
PhD. MD. Senior Scientist. Laboratory of Cell Biology, Department of Pathomorphology

Tatyana Georgiyevna Tral

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS

Email: TTG2008@bk.ru
MD. Pathologist. Department of Pathomorphology

References

Supplementary files