Secretory placental factors influence to endothelial cells EA.hy926 proliferation

Full Text

Введение Физиологическое развитие беременности в значительной степени зависит от адекватного развития ткани плаценты, соответствующего потребностям плода на различных этапах развития беременности. В свою очередь морфология плаценты определяется развитием ее сосудистой сети за счет процессов васкулогенеза и ангиогенеза. На протяжении всей беременности непрерывно изменяются секреторные функции плаценты [5], а также изменяются фенотипические особенности эндотелиальных клеток (ЭК) [1]. Однако в настоящее время недостаточно изучено влияние, которое оказывают секреторные продукты ткани плаценты на функциональные свойства эндотелиальных клеток. Важными характеристиками эндотелиальных клеток в процессе ангиогенеза является их способность к пролиферации, от чего зависит скорость восстановления эндотелиальной выстилки сосудов при повреждении и скорость формирования ее при образовании новых сосудов. Поддержание жизнеспособности и пролиферативной активности эндотелиальных клеток в ткани плаценты осуществляют секретируемые тканью плаценты факторы VEGF, PlGF, Ang-1, Ang-2, bFGF, PDGF, MMP, IL-8 [7, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 20, 21]. При беременности, осложненной гестозом, отмечается нарушение инвазии трофобласта в децидуальную ткань и нарушение ангиогенеза в ткани плаценты. Гестоз также сопровождается эндотелиальной дисфункцией сосудистого русла матери. Ранее нами было показано изменение экспрессии и секреции тканью плаценты ангиогенных цитокинов, таких как VEGF, ММР-2 , bFGF [2, 5], ангиопоэтины [6], а также антиангиогенных факторов (sVEGFR-1, TGFβ [2, 8], TSP-1[9]), что может быть причиной нарушения ангиогенеза при гестозе. Однако влияние выявленных изменений на функциональное состояние ЭК остается неизученным. Поэтому целью нашей работы было оценить влияние факторов, секретируемых тканью плаценты на ранних и поздних сроках физиологической беременности и при беременности, осложненной гестозом, на пролиферативную активность ЭК. Материалы и методы Использовали плаценты, полученные при искусственном аборте у женщин с физиологическим течением беременности на сроке 9–11 недель (n = 15, группа 1); плаценты женщин, у которых беременность протекала без осложнений на сроке 38–39 недель (n = 20, группа 2); плаценты женщин с течением беременности, осложненным гестозом на сроке 38–39 недель (n = 25, группа 3). Все плаценты на сроке 38–39 недель получены при родоразрешении путем кесарева сечения. Получено информированное согласие пациенток на исследование. Диагноз гестоза установлен на основании ведущих клинических симптомов различной степени выраженности — наличия протеинурии, отеков, гипертензии (повышение систолического давления от 135 мм рт. ст. и выше, диастолического давления от 85 мм рт. ст. и выше). Кусочки ворсинчатого хориона из центральной части плацент культивировали 24 часа в питательной среде DMEM\F12 без эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС). Кондиционированные среды замораживали (−20 ºС). Поскольку различные цитокины оказывают митогенное действие в различных концентрациях, то в исследовании использовали разведения кондиционированных сред. Культура клеток. Исследования проводили с использованием эндотелиальных клеток линии EA.hy926. Культура получена путем гибридизации первичной культуры человеческих эндотелиальных клеток вены пупочного канатика (HUVEC) с клетками карциномы легкого A-549 в 1983 году Dr. C. J. Edgell (Университет Северной Каролины, США). Клетки линии EA.hy926 воспроизводят основные морфологические, фенотипические и функциональные характеристики, присущие эндотелию. Для культивирования использовали среду DMEM/F12 (Sigma, США) с добавлением 10 % инактивированной ЭТС (Sigma, США), 100 Ед/мл пенициллина (Sigma) и 100 мкг/мл стрептомицина (Sigma, США), 2 мМ L-глутамина («ICN», США), НАТ (Sigma, США). При помощи раствора трипанового синего оценивали жизнеспособность клеток, при этом она составляла не менее 96 %. Оценку влияния секретируемых тканью плаценты факторов на пролиферативную активность эндотелиальных клеток линии EA.hy926 проводили при помощи метода, основанного на окраске белковых компонентов цитоплазмы ЭК витальным красителем кристаллическим фиолетовым. Указанный метод по чувствительности сопоставим с другими методами оценки пролиферативной активности [3]. Клетки линии EA.hy926 помещали в лунки 96-луночного плоскодонного планшета для адгезионных культур («Sarstedt», Австрия) в концентрации 5 000 клеток на лунку в 100 мкл среды DMEM/F12 c добавлением 10 % ЭТС (Sigma, США) и культивировали сутки при 37 ˚С во влажной атмосфере с 5 % содержанием СО2 для прикрепления ЭК к поверхности планшета. Затем культуральную среду удаляли и вносили кондиционированные среды, полученные при культивировании ткани плаценты, в разведениях от 1:1 до 1:1024, приготовленных на среде DMEM/F12 с добавлением 2,5 % ЭТС (Sigma, США), и культивировали 72 часа при 37 0С, 5 % СО2. Затем клетки линии EA.Hy926 окрашивали 0,2 % раствором кристаллического фиолетового (Sigma, США), содержащего 5 % метанола, для чего в каждую лунку вносили краситель в объеме 100 мкл на лунку и инкубировали 10 минут. После окраски производили 4-кратную отмывку лунок дистиллированной водой. Планшет высушивали, проводили экстракцию красителя 10 % раствором уксусной кислоты. Учет оптической плотности проводили на микропланшетном ридере «Labsystems» (Финляндия) при длине волны 540 нм. По изменению оптической плотности оценивали интенсивность пролиферации ЭК. Положительным контролем функциональной активности ЭК служила их инкубация в среде DMEM/F12 с добавлением 5 % и 10 % ЭТС. Спонтанный уровень пролиферативной активности определяли после инкубации ЭК в среде DMEM/F12 с добавлением 2,5 % ЭТС. Результаты Установлено, что цельная кондиционированная среда, полученная после культивирования ткани плацент всех групп женщин, снижала пролиферативный потенциал клеток линии EA.hy926. Это, по-видимому, связано с полным истощением ростовых факторов культуральной среды клетками плаценты во время культивирования эксплантов плаценты в течение суток с целью получения кондиционированных сред. Отсутствие ростовых факторов не позволяло реализовать специфическую ангиогенную активность секреторных продуктов ткани плаценты. Инкубация клеток линии EA.hy926 с кондиционированными средами, полученными после культивирования ткани плаценты женщин с физиологической беременностью на сроке 9–11 недель, в разведениях от 1:2 до 1:32 и на сроке 38–39 недель в разведениях от 1:2 до 1:128 стимулировало пролиферативную активность этих клеток по сравнению с их инкубацией в присутствии среды DMEM/F12 с добавлением 2,5 %ЭТС (рисунок 1). Кондиционированные среды плацент женщин из групп 9–11 недель и группы 38–39 недель (физиологическая беременность) обладали одинаковым стимулирующим действием на пролиферативную активность ЭК линии EA.hy926. Однако по результатам медианного теста стимулирующий эффект в отношении пролиферативной активности кондиционированных сред ткани плацент женщин с физиологической беременностью на сроке 38–39 недель в разведениях от 1:2 до 1:128 был ниже по сравнению с влиянием кондиционированных сред ткани плацент женщин с физиологической беременностью на сроке 9–11 недель (рисунок 1). Инкубация клеток линии EA.hy926 в присутствии кондиционированных сред, полученных после культивирования плацент беременных с гестозом, в разведениях от 1:2 до 1:128 также стимулировало пролиферативную активность клеток линии EA.hy926 по сравнению со спонтанным уровнем их пролиферативной активности в присутствии среды DMEM/F12 с добавлением 2,5 % ЭТС (рисунок 1). По данным медианного теста эффект усиления пролиферативной активности под влиянием кондиционированных сред ткани плацент женщин с гестозом в разведениях от 1:2 до 1:128 был ниже по сравнению с влиянием кондиционированных сред ткани плацент женщин с физиологической беременностью на сроке 38– 39 недель (рис. 1). Обсуждение Кондиционированные среды всех исследованных групп стимулировали пролиферативную активность ЭК по сравнению со спонтанным уровнем (пролиферативная активность ЭК в присутствии среды DMEM\F12 с добавление 2,5 % ЭТС), что отражает наличие ангиогенных факторов в кондиционированных средах плацент женщин всех исследованных групп. Характер изменения пролиферативной активности ЭК линии EA.hy926 при разведении кондиционированных сред плацент был одинаков среди женщин всех исследуемых групп. Наблюдаемое максимальное стимулирующее действие кондиционированных сред плацент на пролиферативную активность ЭК в разведениях 1:2 и 1:4 связано с действием ангиогенных факторов, секретируемых тканью плацент. При дальнейшем разведении кондиционированных сред при наличии в среде ростовых факторов, снижение концентрации ангиогенных факторов приводило к снижению пролиферативной активности ЭК. В первом триместре физиологической беременности наряду с продукцией антиангиогенных факторов sVEGF-R1 [8], TSP-1 [9] ткань плаценты продуцирует в большом количестве стимулирующие пролиферативную активность ЭК ангиогенные факторы VEGF, PlGF, PDGF, bFGF, Ang-2 [4, 5, 6], что отражается в высоком уровне пролиферативной активности ЭК в присутствии секреторных продуктов ткани плацент первого триместра физиологической беременности. При разведении 1:4 стимулирующее действие кондиционированных сред ткани плацент первого триместра беременности было максимальным, при дальнейшем разведении эффект постепенно снижался при сохранении стимулирующего действия по сравнению с контролем. Таким образом, усиленная пролиферативная активность ЭК в присутствии факторов первого триместра физиологической беременности соответствует ранее полученным данным о повышенной секреции ангиогенных факторов тканью плаценты первого триместра и способствует процессу активного ангиогенеза в ткани плаценты и децидуальной ткани в начале беременности. Пролиферативная активность ЭК была снижена под влиянием секреторных продуктов ткани плацент третьего триместра физиологической беременности по сравнению с первым триместром. При развитии ткани плаценты от первого к третьему триместру происходит смена факторов, контролирующих ангиогенез, приводящая к изменению характера пролиферативной активности ЭК. Ранее было показано, что продукция и секреция тканью плаценты ангиогенных факторов Ang-2, ММР-2, PlGF, VEGF [4, 6] снижалась в третьем триместре по сравнению с первым. Продукция тканью плаценты TSP-1 [4] и секреция растворимой формы VEGF-R1 [8], являющихся антиангиогенными факторами, также снижалась. Одновременно повышалась секреция Ang-1 [6], способного ингибировать пролиферативную активность ЭК [12]. Такое изменение секреторной функции ткани плаценты приводит к снижению пролиферативной активности ЭК, что может быть направлено на стабилизацию сосудистого русла плаценты к концу беременности и поддержание жизнеспособности ЭК. Снижение пролиферативной активности ЭК под действием факторов, секретируемых тканью плаценты при гестозе, связано с отмеченными нами ранее изменениями в секреции факторов тканью плаценты при беременности, осложненной гестозом [4, 6, 8]. В частности, снижение секреции Ang-1 и Ang-2 тканью плаценты при беременности, осложненной гестозом [6] и снижение экспрессии bFGF в ткани плаценты при гестозе [2], оказывающие влияние на пролиферативную активность ЭК [11, 18], могут способствовать снижению пролиферативной активности ЭК плаценты в условиях in vivo. Повышение при гестозе продукции тканью плаценты антиангиогенных факторов, таких как sVEGF-R1 [8] и TSP-1 [9], также может вносить вклад в подавление пролиферативной активности ЭК линии EA.hy926. Повышенная при гестозе экспрессия TGFβ тканью плаценты [2], что может подавлять пролиферацию и жизнеспособность ЭК [19]. Сниженная пролиферативная активность ЭК при гестозе может приводить к нарушению проницаемости сосудов и целостности эндотелиальной выстилки сосудов, что проявляется в виде отеков и протеинурии у женщин с гестозом. Таким образом, секреторные продукты ткани плаценты стимулируют пролиферативную активность ЭК за счет секреции ангиогенных факторов VEGF, ангиопоэтинов, bFGF, PlGF, PDGF. В первом триместре высокий уровень секреции этих факторов приводит в высокой пролиферативной активности ЭК. В третьем триместре наблюдается снижение секреции тканью плаценты ангиогенных факторов, что приводит к снижению пролиферативной активности ЭК и способствует стабилизации сосудистого русла плаценты к концу беременности. Нами выявлено снижение пролиферативной активности ЭК под влиянием факторов, секретируемых тканью плаценты при гестозе, по сравнению с физиологической беременностью, что может вносить вклад в патогенез этой тяжелой формы акушерской патологии.

About the authors

Olga Igorevna Stepanova

FSBI “D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology” NWB RAMS

Email: alzass@mail.ru
scientist, laboratory of immunology

Kseniya Nikolayevna Furayeva

FSBI “D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology” NWB RAMS

Email: Furaeva-Kseniya@mail.ru
student

Igor Pavlovic Nikolayenkov

FSBI “D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology” NWB RAMS

Email: nikolaenkov_igor@mail.ru
post-graduate student

Sergey Alekseyevich Selkov

FSBI “D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology” NWB RAMS

Email: selkovsa@mail.ru
doctor of medical sciences, head of the laboratory of immunology

Dmitriy Igorevich Sokolov

FSBI “D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology” NWB RAMS

Email: corbie@hotmail.ru
doctor of biological sciences, leading researcher

References

Supplementary files