Email this article In vitro antimycotic sensitivity of the genus candida yeast and lactobacillus rhamnosus probiotic strain
- Authors: Spasibova E.V.1,2, Savicheva A.M.1,2
-
Affiliations:
- The Research Institute of Obstetrics, Gynecology, and Reproductology named after D.O. Ott
- aint Petersburg State Pediatric Medical University
- Issue: Vol 68, No 5 (2019)
- Pages: 83-89
- Section: Original Research
- URL: https://journals.eco-vector.com/jowd/article/view/18733
- DOI: https://doi.org/10.17816/JOWD68583-89
- ID: 18733
Cite item
Full Text
Abstract
Hypothesis/aims of study. Vulvovaginal candidiasis (VVC) is one of the most common inflammatory diseases of the vagina. Herewith, a synergistic effect of lactobacilli and antifungal drugs in VVC treatment is suggested. In this regard, it seems relevant to study the effect of antimycotics used to treat VVC on the enhanced L. casei rhamnosus 35 (LCR35) probiotic strain. This study was aimed to determine the sensitivity to antimycotic drugs of the probiotic LCR35 strain included in the Lactoginal® vaginal capsules, as well as the sensibility of the genus Candida yeast under separate and joint cultivation with lactobacilli.
Study design, materials and methods. LCR35 was cultured on a MRS agar. Identification of bacteria grown on the medium, as well as clinical isolates of C. albicans and C. parapsilosis, isolated from the vagina, was performed by MALDI-TOF mass spectrometry. The sensitivity of yeast was determined on a modified Müller-Hinton agar with 40% glucose and methylene blue. Discs with fluconazole, voriconazole, itraconazole, ketoconazole, clotrimazole, and nystatin were used. Interpretation of growth inhibition zones was carried out according to EUCAST-2018 or according to the recommendations of the disc manufacturer.
Results. The probiotic LCR35 strain is resistant to antimycotics that are effective against C. albicans and C. parapsilosis. When determining the sensibility of C. albicans and C. parapsilosis to antimycotics in separate and joint cultivation with LCR35, no differences were found in the degree of yeast-like fungi growth suppression.
Conclusion. The probiotic LCR35 strain, which is part of the Lactoginal® vaginal capsules, is resistant to antimycotic drugs and does not affect the sensitivity of the tested yeast-like fungi to antimycotics.
Full Text
Введение
Воспалительные заболевания влагалища, в том числе кандидозный вульвовагинит (КВВ), являются наиболее частыми причинами обращения женщин за медицинской помощью [1]. В общей структуре вагинальных инфекций на долю заболеваний, вызванных дрожжеподобными грибами рода Candida, приходится от 5 до 50 % [2, 3]. По данным Eckert et al. (1998), до 75 % сексуально активных женщин испытывали по крайней мере один эпизод КВВ в течение жизни [2]. Основными жалобами разной степени выраженности при манифестной кандидозной инфекции являются зуд, вагинальный дискомфорт, диспареуния, дизурия, эритема вульвы, густые белые выделения [4]. В 80–90 % случаев возбудителем КВВ является Candida albicans. Другие виды кандид хотя и выделяют реже, но с ними связывают неудачи терапии и рецидивирование кандидоза при использовании эмпирических схем без предварительной идентификации возбудителя и определения чувствительности к антимикотическим препаратам.
Практические рекомендации по лечению КВВ включают применение системных антимикотиков путем однократного приема флуконазола в дозе 150 мг, реже назначают кетоконазол, итраконазол и другие препараты в комбинации с местными имидазолами (клотримазол, бутоназол, миконазол, тиоконазол в форме мазей или вагинальных суппозиториев). Однако эффективность однократной дозы системного антимикотика и местного (интравагинального) лечения азолами сопоставима.
В настоящее время не вызывает сомнения ключевая роль эндогенных лактобацилл в поддержании физиологического состояния влагалищного биотопа женщин репродуктивного возраста. Лактобациллы реализуют свои защитные функции в результате поддержания pH на уровне 4,0–4,5, продукции молочной кислоты, перекиси водорода, обеспечении колонизационной резистентности влагалищного биотопа, иммуномодулирующего действия, выработки лактоцинов и т. д. Доминирующими видами у большинства женщин репродуктивного возраста Санкт-Петербурга являются L. jensenii, L. crispatus, L. gasseri, L. iners, L. johnsonii [5].
Использование лактобацилл в лечении кандидозного вульвовагинита до сих пор обсуждается. Дрожжеподобные грибы рода Сandida размножаются в присутствии лактобацилл и вегетируют в одном биотопе. Вероятно, имеет значение вид, а также способ промышленного производства пробиотических лактобацилл.
Если сравнивать терапию с использованием лактобацилл со стандартной пероральной или местной противогрибковой терапией, то преимуществами могут стать снижение риска развития резистентности дрожжеподобных грибов к антимикотическим препаратам, уменьшение побочных эффектов и финансовых затрат [6]. По результатам исследования РЕВОЛАКТ-2017, препарат Лактожиналь® может эффективно предотвращать развитие рецидива хронического вульвовагинального кандидоза при его применении в составе двухэтапной терапии КВВ [7]. По результатам многоцентрового открытого неинтервенционного исследования 2018 г., при системной или местной терапии КВВ антимикотиками с последующим применением препарата Лактожиналь® в течение 21 дня было отмечено снижение рецидивов в 7 раз по сравнению с группой контроля, то есть с пациентками, не получавшими терапии пробиотиками [8]. Lactobacillus casei rhamnosus 35 (LCR35), входящие в состав препарата Лактожиналь®, благодаря усиленным в процессе производства свойствам обладают подходящими для исследования технологическими характеристиками: способны коагрегировать, оказывают антимикробное действие на дрожжеподобные грибы рода Candida, а также способны к конкурентной адгезии на клетках HeLa [9]. В исследовании in vitro было показано, что LCR35 в достаточной концентрации подавляют избыточный рост Candida во влагалище, обеспечивая колонизационную устойчивость и поддерживая низкий уровень концентрации дрожжевых клеток, что особенно актуально для профилактики кандидоза на фоне антимикробной терапии [10].
Накопленные данные позволяют предполагать синергическое действие лактобацилл и противогрибковых препаратов при лечении КВВ. В связи с вышеизложенным, представляется актуальным изучение влияния антимикотических препаратов, применяемых для лечения КВВ, на пробиотический штамм LCR35, входящий в состав вагинальных капсул Лактожиналь®.
Цель нашей работы заключалась в определении чувствительности к антимикотическим препаратам пробиотического штамма L. rhamnosus, входящего в состав вагинальных капсул Лактожиналь®, а также чувствительности дрожжеподобных грибов рода Candida при раздельном и совместном с лактобациллами культивировании.
Материалы и методы
Культивирование LCR35 осуществляли на плотной среде MRS после регидратации лиофильно высушенных микроорганизмов, находящихся в капсуле препарата Лактожиналь®. Выросшие на среде MRS бактерии идентифицировали методом MALDI-TOF масс-спектрометрии.
В качестве тестируемых дрожжеподобных грибов использовали клинические изоляты C. albicans и C. parapsilosis, выделенные из влагалища.
Чувствительность дрожжеподобных грибов определяли по EUCAST-2018 на модифицированном агаре Мюллера – Хинтон с 40 % глюкозой и метиленовым синим. Использовали диски с флуконазолом (FCA25) и вориконазолом (VOR1) (Oxoid, Великобритания). Чувствительными (S) к флуконазолу считали микроорганизмы с зоной задержки больше или равно 19 мм, устойчивыми (R) — менее или равно 14 мм. Чувствительными (S) к вориконазолу считали микроорганизмы с зоной задержки больше или равно 17 мм, устойчивыми (R) — менее или равно 13 мм. Дополнительно определяли чувствительность к набору дисков с антимикотиками (НИЦФ, Россия): итраконазолу 10 мкг, кетоконазолу 20 мкг, клотримазолу 10 мкг, нистатину 80 ЕД. Производитель рекомендует следующие параметры интерпретации зон задержки роста: итраконазол R ≤ 13 мм, S ≥ 19 мм; кетоконазол R ≤ 19 мм, S ≥ 26 мм; клотримазол — S ≥ 12 мм; нистатин S ≥ 18 мм.
Результаты
Размеры зон задержки роста тестируемых микроорганизмов представлены в табл. 1.
Таблица 1 / Table 1
Результаты тестирования чувствительности L. rhamnosus, С. albicans и C. parapsilosis к антимикотическим препаратам
L. rhamnosus, C. albicans and C. parapsilosis antimycotic sensitivity test results
Микроорганизм | EUCAST | Дополнительно |
L. rhamnosus | FCA25 R (0 мм) VOR1 R (0 мм) | Итраконазол R (0 мм) Кетоконазол R (0 мм) Клотримазол R (0 мм) Нистатин R (0 мм) |
Candida albicans | FCA25 I (18 мм) VOR1 S (17 мм) | Итраконазол R (0 мм) Кетоконазол R (18 мм) Клотримазол S (13 мм) Нистатин S (19 мм) |
Candida parapsilosis | FCA25 S (32 мм) VOR1 S (40 мм) | Итраконазол R (10 мм) Кетоконазол S (32 мм) Клотримазол S (26 мм) Нистатин R (15 мм) |
L. rhamnosus + Candida albicans | FCA25 I (18 мм) VOR1 S (17 мм) | Итраконазол R (0 мм) Кетоконазол R (19 мм) Клотримазол S (12 мм) Нистатин S (20 мм) |
L. rhamnosus + Candida parapsilosis | FCA25 S (25 мм) VOR1 S (30 мм) | Итраконазол R (10 мм) Кетоконазол S (30 мм) Клотримазол S (18 мм) Нистатин R (15 мм) |
Примечание. S — чувствительный (от англ. sensitive); R — устойчивый (от англ. resistant); I — умеренно устойчивый (от англ. intermediate).
Результат культивирования LCR35 представлен на рис. 1. Видно, что на плотной питательной среде MRS бактерии дают сплошной рост. Количество выросших лактобацилл составило 1011 КОЕ/мл. При проведении теста чувствительности L. rhamnosus к антимикотикам установлено, что этот вид лактобацилл устойчив ко всем препаратам (рис. 2).
Рис. 1. Рост L. rhamnosus на чашке с питательной средой MRS
Fig. 1. L. rhamnosus growing on MRS agar
Рис. 2. Отсутствие зон задержки роста L. rhamnosus вокруг дисков с антимикотиками
Fig. 2. Absence of growth inhibition zones against L. rhamnosus formed around antimycotic discs
При тестировании Candida albicans и Candida parapsilosis с использованием диско-диффузионного метода выявлено, что все исследованные антимикотические препараты эффективно действуют на эти дрожжеподобные грибы (рис. 3, 4).
Рис. 3. Определение чувствительности C. albicans к антимикотическим препаратам диско-диффузионным методом
Fig. 3. Antimycotic sensitivity of C. albicans determined by the disk diffusion method
Рис. 4. Зоны задержки роста C. parapsilosis вокруг дисков с флуконазолом и вориконазолом
Fig. 4. Presence of growth inhibition zones against C. parapsilosis formed around discs with fluconazole and voriconazole
Совместное культивирование дрожжеподобных грибов с LCR35 не повлияло на чувствительность Candida albicans и Candida parapsilosis к антимикотическим препаратам (рис. 5, 6).
Рис. 5. Отсутствие различий в результатах тестирования чувствительности C. albicans к антимикотическим препаратам при раздельном и совместном с L. rhamnosus культивировании: S — чувствительный (от англ. sensitive); R — устойчивый (от англ. resistant); I — умеренно устойчивый (от англ. intermediate)
Fig. 5. No differences in the results of testing the antimycotic sensitivity of C. albicans in separate and joint cultivation with L. rhamnosus: S — sensitive; R — resistant; I — intermediate
Рис. 6. Отсутствие различий в результатах тестирования чувствительности C. parapsilosis к антимикотическим препаратам при раздельном и совместном с L. rhamnosus культивировании: S — чувствительный (от англ. sensitive); R — устойчивый (от англ. resistant); I — умеренно устойчивый (от англ. intermediate)
Fig. 6. No differences in the results of testing the antimycotic sensitivity of C. parapsilosis in separate and joint cultivation with L. rhamnosus: S — sensitive; R — resistant; I — intermediate
Обсуждение
Ross et al. (1995) изучали in vitro влияние на моделируемую вагинальную экосистему дрожжеподобных грибов C. albicans и антимикотического препарата клотримазол. Моделируемая экосистема представляла собой смесь ацидофильных микроорганизмов, которые ассоциированы с нормальной вагинальной микрофлорой. Исследователи установили, что после добавления к модели C. albicans количество Lactobacillus acidophilus и других компонентов нормальной микрофлоры влагалища уменьшилось. После добавления клотримазола в модель c кандидами содержание компонентов нормальной микрофлоры продолжало снижаться вплоть до их полного исчезновения в течение 48 ч. Аналогичное исчезновение L. acidophilus наблюдалось через 5 дней после добавления клотримазола в модель без внесения дрожжеподобных грибов. Несмотря на то что поведение микроорганизмов in vitro нельзя полностью переносить в условия человеческого организма, эти результаты подтверждают необходимость восстановления лактобациллярной микрофлоры одновременно с местным лечением антимикотическими препаратами [3].
Рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование, проведенное в Швеции, показало более низкий процент рецидивов и жалоб на неприятные выделения из влагалища у женщин, получавших капсулы с L. gasseri, L. fermentum, L. casei subsp. rhamnosus и P. acidilactici после обычного лечения бактериального вагиноза и/или КВВ [11].
Авторы следующего исследования сообщают о безопасном и эффективном адъювантном подходе для уменьшения симптомов и рецидивов КВВ при использовании смеси Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rhamnosus и бычьего лактоферрина [12].
Полученные нами данные коррелируют с результатами, опубликованными в работе P.R. De Gregorio [13]. Авторы исследовали in vitro антимикробные свойства тридцати вагинальных штаммов лактобацилл и одиннадцати вагинальных клинических изолятов Candida. Кроме этого, на мышиной экспериментальной модели изучали эффект интравагинального применения штаммов L. reuteri или L. rhamnosus после заражения Candida albicans. Лактобациллы in vitro и in vivo оказывали противомикробное действие на дрожжеподобные грибы, что позволяет предположить, что они могут быть перспективными кандидатами для профилактики КВВ.
Вызывают интерес исследования, посвященные изучению влияния пробиотических штаммов лактобацилл на формирование биопленок. Например, получены данные, что изоляты L. paracasei, L. rhamnosus и L. fermentum проявляют выраженные ингибирующие свойства в отношении C. albicans. Совместная инкубация приводила к задержке формирования биопленки и замедлению образования псевдомицелия [14].
Несмотря на то что ряд работ демонстрирует клиническую эффективность лактобацилл против дрожжеподобных грибов рода Candida, для более четкого представления механизмов этого действия нужны дальнейшие исследования. Получены результаты по изучению антикандидозной активности модельного пробиотического штамма Lactobacillus rhamnosus GG для определения молекулярных взаимодействий. Авторы обнаружили, что L. rhamnosus GG может влиять на рост, морфогенез и адгезию Candida. В дополнение к этому полученные ими данные показывают, что очищенный экзополисахарид (EPS) лактобацилл может мешать образованию псевдомицелия и адгезии к эпителиальным клеткам [15].
Ранее нами были обнаружены явные конкурентные взаимоотношения LCR35 с C. albicans и C. glabrata. При совместной инкубации штамм LCR35 в составе препарата Лактожиналь® оказывал ингибирующее действие на дрожжевые грибы рода Candida в отсутствие антимикотиков [10].
Результаты данного исследования демонстрируют невосприимчивость пробиотического штамма LCR35 к большинству антимикотических препаратов, применяемых в практике, что позволяет рассматривать Лактожиналь® в качестве рекомендуемого препарата в комбинированной терапии КВВ. Хотя мы не выявили in vitro изменения чувствительности дрожжеподобных грибов к антимикотикам при совместном тестировании, это не отрицает наличия синергизма при одновременном применении пробиотиков и антимикотиков в вагинальной экосистеме за счет проявления защитных функций экзогенных и эндогенных лактобацилл наряду с действием антимикотических препаратов.
Ввиду возрастающей резистентности грибов рода Candida к антимикотикам потенцирующее антимикотическое действие лактобацилл может приобретать большее клиническое значение и перспективен для дальнейшего исследования.
Заключение
Пробиотический штамм L. rhamnosus, входящий в состав вагинальных капсул Лактожиналь®, устойчив к антимикотическим препаратам и не оказывает отрицательного влияния на чувствительность тестируемых дрожжеподобных грибов к антимикотикам.
About the authors
Elena V. Spasibova
The Research Institute of Obstetrics, Gynecology, and Reproductology named after D.O. Ott; aint Petersburg State Pediatric Medical University
Author for correspondence.
Email: elena.rybina@gmail.com
MD. The Laboratory of Microbiology; Assistant. The Department of Clinical Laboratory Diagnostics. The Faculty of Postgraduate and Additional Professional Education
Russian Federation, Saint PetersburgAlevtina M. Savicheva
The Research Institute of Obstetrics, Gynecology, and Reproductology named after D.O. Ott; aint Petersburg State Pediatric Medical University
Email: savitcheva@mail.ru
MD, PhD, DSci (Medicine), Professor, Honoured Scholar of the Russian Federation, the Head of the Laboratory of Microbiology; the Head of the Department of Clinical Laboratory Diagnostics. The Faculty of Postgraduate and Additional Professional Education
Russian Federation, Saint PetersburgReferences
- Overman BA. The vagina as an ecologic system. Current understanding and clinical applications. J Nurse Midwifery. 1993;38(3):146-151. https://doi.org/10.1016/0091-2182(93)90038-i.
- Eckert L, Hawes SE, Stevens CE, et al. Vulvovaginal candidiasis: clinical manifestations, risk factors, management algorithm. Obstet Gynecol. 1998;92(5):757-765. https://doi.org/10.1016/S0029-7844(98)00264-6.
- Ross RA, Lee ML, Onderdonk AB. Effect of Candida albicans infection and clotrimazole treatment on vaginal microflora in vitro. Obstet Gynecol. 1995;86(6):925-930. https://doi.org/10.1016/0029-7844(95)00318-l.
- Ringdahl EN. Treatment of recurrent vulvovaginal candidiasis. Am Fam Physician. 2000;61(11):3306-3312, 3317.
- Будиловская О.В., Шипицына Е.В., Герасимова Е.Н., и др. Видовое разнообразие вагинальных лактобацилл в норме и при дисбиотических состояниях // Журнал акушерства и женских болезней. – 2017. – Т. 66. – № 2. – С. 24–32. [Budilovskaya OV, Shipitsyna EV, Gerasimova EN, et al. Species diversity of vaginal lactobacilli in norm and in dysbiotic states. Journal of Obstetrics and Women’s Diseases. 2017;66(2):24-32. (In Russ.)]. https://doi.org/10.17816/JOWD66224-32.
- Elmer GW, Surawicz CM, McFarland LV. Biotherapeutic agents. A neglected modality for the treatment and prevention of selected intestinal and vaginal infections. JAMA. 1996;275(11):870-876. https://doi.org/10.1001/jama.275. 11.870.
- Башмакова Н.В., Волкова Н.Ю., Гнатко Е.П., и др. Пробиотик для профилактики рецидивов вульвовагинального кандидоза (результаты международного многоцентрового открытого исследования РЕВОЛАКТ) // Акушерство и гинекология. – 2017. – № 6. – С. 136–142. [Bashmakova NV, Volkova NY, Gnatko EP, et al. Probiotics for prophylaxis of vulvovaginal candidiasis relapses: Results of the international multicenter open-label REVOLACT study. Akush Ginekol (Mosk). 2017;(6):136-142. (In Russ.)]. https://doi.org/10.18565/aig.2017.6.136-42.
- Манухин И.Б., Абашова Е.И., Базина М.И., и др. Лактобактерии LCR35 для профилактики рецидивов вульвовагинального кандидоза (результаты многоцентрового открытого неинтервенционного исследования) // Акушерство и гинекология. – 2018. – № 12. – С. 132–140. [Manukhin IB, Abashova EI, Bazina MI, et al. Lactobacteria LCR35 for prevention of relapse of vulvovaginal candidiasis: results of the multicenter open noninterventional study. Akush Ginekol (Mosk). 2018;(12):132-40. (In Russ.)]. https://doi.org/10.18565/aig.2018.12.132-140.
- Verdenelli MC, Coman MM, Cecchini C, et al. Evaluation of antipathogenic activity and adherence properties of human Lactobacillus strains for vaginal formulations. J Appl Microbiol. 2014;116(5):1297-1307. https://doi.org/10.1111/jam.12459.
- Савичева А.М., Рыбина Е.В. Исследование in vitro роста, размножения, антибиотикорезистентности, конкурентных взаимоотношений штамма Lactobacillus casei rhamnosus // Акушерство и гинекология. – 2014. – № 7. – С. 79–83. [Savicheva AM, Rybina EV. In vitro study of the growth, reproduction, antibiotic resistance, and competitive relationships of a Lactobacillus casei rhamnosus strain. Akush Ginekol (Mosk). 2014;(7):79-83. (In Russ.)]
- Ehrström S, Daroczy K, Rylander E, et al. Lactic acid bacteria colonization and clinical outcome after probiotic supplementation in conventionally treated bacterial vaginosis and vulvovaginal candidiasis. Microbes Infect. 2010;12(10):691-699. https://doi.org/10.1016/j.micinf.2010.04.010.
- Russo R, Superti F, Karadja E, et al. Randomised clinical trial in women with Recurrent Vulvovaginal Candidiasis: Efficacy of probiotics and lactoferrin as maintenance treatment. Mycoses. 2019;62(4):328-335. https://doi.org/10.1111/myc.12883.
- De Gregorio PR, Silva JA, Marchesi A, et al. Anti-Candida activity of beneficial vaginal lactobacilli in in vitro assays and in a murine experimental model. FEMS Yeast Res. 2019;19(2). https://doi.org/10.1093/femsyr/foz008.
- Rossoni RD, de Barros PP, de Alvarenga JA, et al. Antifungal activity of clinical Lactobacillus strains against Candida albicans biofilms: identification of potential probiotic candidates to prevent oral candidiasis. Biofouling. 2018;34(2):212-225. https://doi.org/10.1080/08927014.2018.1425402.
- Allonsius CN, van den Broek MFL, De Boeck I, et al. Interplay between Lactobacillus rhamnosus GG and Candida and the involvement of exopolysaccharides. Microb Biotechnol. 2017;10(6):1753-1763. https://doi.org/10.1111/1751-7915.12799.
Supplementary files
