Influenza A virus reproduction in humanendometrial cells

Full Text

Заболеваемость вирусом гриппа (ВГ) А занимает лидирующее положение среди сезонных респираторных вирусных инфекций по количеству заболевших и тяжести заболевания. Беременные женщины представляют собой особую группу риска, в которой заболевание может протекать в тяжелой форме, а выбор средств защиты крайне ограничен. Уровень заболеваемости гриппом среди беременных женщин намного выше, чем среди не беременных [2, 4]. При высокой степени зараженности организма вирус гриппа способен инфицировать макрофаги и моноциты крови [21], что обеспечивает диссеминацию вируса по кровеносному руслу и проникновение вируса через плацентарный барьер с последующим заражением плода. Гриппозная инфекция у беременных женщин может привести к спонтанным абортам, преждевременным родам, плацентарной недостаточности, патологии развития плода. Инфицированность организма низкими дозами вируса гриппа может привести к хронической инфекции с отдаленными осложнениями для матери и плода [2]. Одна из причин тяжелых последствий инфекции ВГ для беременных женщин заключается в том, что на естественный процесс иммуносупрессии, возникающий во время беременности, накладывается подавление иммунной системы, вызванное вирусными белками [4]. Успешное развитие начальных этапов взаимодействия матери и плода зависит прежде всего от иммунологического контроля инвазии трофобласта в стенку матки и формирования иммунологической толерантности для полуаллогенного развивающегося плода, нарушение которой может привести к патологическому течению беременности. Ведущая роль в подавлении цитотоксического ответа организма матери на полуаллогенный плод отводится молекулам главного комплекса гистосовместимости HLA-G, экспрессирующимся в клетках трофобласта [13]. К другим защитным механизмам относится формирование структуры плаценты, связанное с активацией процессов ангиогенеза и апоптоза. На ранних стадиях беременности взаимодействие между инвазирующим трофобластом и материнскими децидуальными клетками является критическим. Нарушение самых первых этапов имплантации зародыша в ткань эндометрия может привести к последующим тяжелым последствиям в протекании беременности [6]. В связи с этим, представляет интерес изучение влияния репродукции вирусов гриппа А на некоторые функции клеток эндометрия человека. Целью нашего исследования явилось изучение репродукции вирусов гриппа подтипов А(H3N2) и А(H1N1)pdm в первичных клеточных культурах эндометрия человека, полученных на 8-й и 19-й день менструального цикла (МЦ). Как правило, все вирусологические исследования на клеточных культурах проводятся при использовании высокой множественности инфекции (МИ) клеток вирусом гриппа (МИ = 1–10) [7], что приводит к цитодеструктивной гибели клеток. В нашей лаборатории было показано, что низкая МИ вируса гриппа (МИ = 0,0001–0,00001) вызывает практически во всех лимфобластоидных и в некоторых монослойных клеточных линиях стимуляцию пролиферации клеток [1, 5]. В этой связи при заражении клеток эндометрия мы использовали высокие дозы заражения клеток (МИ = 0,3) как модель острой инфекции и низкие дозы вируса (МИ = 0,0003) для имитации хронической инфекции. В качестве критериев взаимодействия вируса гриппа и клеток эндометрия были выбраны изменения клеточной морфологии, пролиферации, индукции апоптоза, активности желатиназ (ММР-2 и ММР-9) и продолжительность обнаружения РНК вируса в клетках эндометрия. Помимо этого, проведено цитохимическое исследование маркеров некоторых биологически активных клеточных белков. Материалы и методы Вирусы Для заражения клеток использовали вирусы гриппа А/Санкт-Петербург/5/09 (H1N1) pdm, А/Брисбен/10/07 (H3N2), поддерживаемые в аллантоисной жидкости куриных эмбрионов.. Были исследованы также современные изоляты вирусов гриппа А (H3N2), исходно выделенные на клетках МDСК и имеющие низкий пассажный уровень (1–2 пассажа после выделения): А/Санкт-Петербург/1/12, А/Санкт-Петербург/4/12, Красноярск/3/12, А/Омск/3/12, А/Москва/9/12, А/Астрахань/6/12, А/Новосибирск/10/12. Клеточные культуры Перевиваемая клеточная линия клеток почки собаки (MDCK), используемая для определения инфекционного титра вирусов и расчета МИ, получена из Коллекции клеточных культур ФГБУ НИИ гриппа МЗ РФ. Клетки культивировали в среде альфа-МЕМ с добавлением 2 % фетальной сыворотки (ф. с.) без добавления антибиотиков. Ткань эндометрия была получена из матки пациенток в результате проведения диагностической гистероскопии. Взятие материала проводилось в стерильных условиях операционного блока на 8-й и 19-й день МЦ. Монослойную первичную культуру клеток эндометрия человека разных сроков получения (8-й и 19-й день МЦ) поддерживали в среде альфа-МЕМ с добавлением 5 % ф. с. без антибиотиков. Для проведения опытов использовали клеточные культуры не старше 15–18 пассажа. Расчет множественности инфекции проводили, используя значения тканевой цитопатической дозы (ТЦД50), определенной на клетках MDCK. Данная линия является одной из наиболее пермиссивных к вирусам гриппа человека и, следовательно, число инфекционных вирусных частиц, необходимое для расчета МИ, для нее рассчитывается наиболее точно. Титры вирусов, поддерживаемых на куриных эмбрионах, соответствовали 105–106 ТЦД50. Титры вирусов, поддерживаемых на клетках MDCK, соответствовали 102–104 ТЦД50. Проведение опыта. Для проведения опыта суспензию клеток с концентрацией 3 × 104 клеток/мл вносили в 24-луночные пластины. Через 24 ч проводили заражение монослоя клеток разными дозами вируса гриппа. Использовали высокую дозу заражения (МИ = 0,3) и низкую дозу заражения (МИ = 0,0003). Изучение пролиферации клеток. На 3-и сутки после заражения клетки снимали с поверхности раствором версен/химопсин и количество клеток в суспензии подсчитывали в камере Фукса–Розенталь. Долю выросших клеток выражали в виде процента от контроля. Определение апоптоза. Клетки выращивали в пенициллиновых флаконах со стеклышками и на 1, 2 и 3-е сутки после заражения вирусом клетки фиксировали фиксатором Карнуа и окрашивали красителем Hoechst-33258. Индукцию апоптоза в клетках определяли при просмотре препаратов в люминесцентном микроскопе по наличию деградации хроматина ядерной ДНК. Антивирусные препараты. Ремантадин (Sigma, Германия) — в концентрации 10 мкг/мл и ингавирин (аптечный препарат фирмы ОАО «Валента Фармацевтика») — в концентрации 100 мкг/мл разводили в среде альфа/МЕМ. Цитохимическое исследование проводили на клетках, выращенных на стеклышках, после фиксации фиксатором метанол: ацетон на 3-и сутки после заражения вирусом, с использованием моноклональных мышиных антител к исследуемым белкам и других реагентов для визуализации их экспрессии фирмы «Novocastra». Оценку интенсивности окрашивания препарата проводили визуально, по степени окрашивания по 4-балльной системе (от+ до +++) (микроскоп Nikon Eclipse E400, увеличение 100×). Статистическая обработка результатов проводилась с использованием пакетов программ MS Office Excel 2010 и Statistica 6.0. Результаты Морфологические изменения клеток эндометрия. При заражении клеток эндометрия, взятых из разных фаз цикла, все исследуемые вирусы вызывали цитопатические изменения в клетках только при очень высоких дозах заражения (МИ = 3), что свидетельствует о низкой чувствительности клеток эндометрия к вирусам гриппа А. Морфология цитопатических изменений в клетках эндометрия была характерной для вируса гриппа А и выражалась в округлении клеток, их отделении от поверхности, что приводило к разрежению монослоя. Влияние вирусной инфекции на пролиферацию клеток эндометрия. Как показал подсчет клеток через 72 часа после вирусной инфекции, при высокой дозе заражения (МИ = 0,3 – 0,03) в отсутствие ЦПД происходило снижение числа жизнеспособных клеток по сравнению с контролем в результате цитотоксического действия вируса на клетки и/или апоптоза. При инфицировании клеток эндометрия низкими дозами вируса (МИ = 0,0003) наблюдалось увеличение количества выросших клеток по сравнению с контролем, что свидетельствовало о стимулирующем действии низких доз вируса гриппа на клетки эндометрия человека (табл. 1). Влияние противовирусных препаратов на вирус-индуцированную пролиферацию клеток эндометрия. Проведено исследование влияния двух антивирусных препаратов на вирус-стимулированную пролиферацию клеток эндометрия: ремантадина, вызывающего подавление репродукции вируса гриппа in vivo (на мышах) и in vitro (на клетках MDCK) и иммуномодуляторного препарата ингавирин, проявляющего антивирусный эффект только in vivo. Антивирусный препарат ремантадин восстанавливал рост клеток, угнетенных высокими дозами вируса до уровня контрольных клеток, в то же время стимулированная низкими дозами заражения вируса пролиферация клеток в присутствии ремантадина снижалась до уровня контроля. В присутствии ингавирина — препарата с иммуномодулирующим действием, не отмечено изменения пролиферации клеток эндометрия в присутствии вируса гриппа: высокие дозы вируса подавляли клеточное деление, а низкие дозы вируса его стимулировали (рис. 1). Изучение апоптоза. Индукция апоптоза в клетках эндометрия, инфицированных вирусами гриппа А, наблюдалась в основном при высоких дозах заражения (МИ = 0,3) через 20–24 часа после заражения, тогда как и при меньших дозах заражения апоптоз был выражен очень слабо и проявлялся в более поздние сроки, по мере накопления инфекционного вируса. Штаммы вируса гриппа А (H3N2), выделенные в 2012 г. на клетках МDСК и имеющие низкий пассажный уровень, вызывали более интенсивный уровень апоптоза, чем штаммы, поддерживаемые на куриных эмбрионах. Окрашивание клеток красителем Hoechst-33258 выявляло деградацию клеточного хроматина, который приобретал вид шариков, а в удлиненных клетках фибробластоподобной морфологии картина была подобна горошинам в стручке. Цитохимическое изучение маркеров синтеза некоторых белков. Цитохимическое изучение синтеза белков р53, Cyclin A и Ki-67, участвующих в регуляции клеточного цикла, показало, что высокие дозы вируса гриппа останавливают деление клетки в фазе G0/G1, что подтверждалось преимущественным присутствием белка р53 в клеточном ядре по сравнению с диффузным распределением белка в цитоплазме контрольных клеток и клеток, зараженных с низкой МИ вируса. При низких дозах заражения клеток вирусом клетки переходили в S-фазу, что подтверждалось повышением внутриядерного присутствия белков Cyclin A и Ki-67 по сравнению с контролем и клетками, зараженными высокой дозой вируса. Эти результаты полностью согласуются с подавлением пролиферации клеток, зараженных высокой дозой вируса и стимуляцией пролиферации клеток при низкой степени инфекции клеток. Цитохимическое изучение клеток эндометрия на присутствие антиапоптозного белка Bcl-2 показало значительное увеличение его синтеза в клетках, инфицированных вирусом гриппа в высокой дозе, по сравнению с контрольными клетками и клетками, инфицированными вирусом в низкой дозе. В то же время наличие Fas-рецептора на клетках, зараженных вирусом в высокой дозе, было невысоким, лишь несколько выше, чем в контрольных клетках, тогда как при низкой дозе заражения клеток вирусом гриппа уровень Fas-рецептора повышался. Эти данные полностью подтверждают результаты по изучению апоптоза в клетках эндометрия, уровень которого был очень низким при заражении вирусом гриппа. Высокий уровень антиапоптозного белка Bcl-2 при заражении клеток вирусом гриппа в высокой дозе коррелирует с увеличением синтеза белка р53, задерживающего клеточное деление в фазе G0/G1. В контрольных клетках эндометрия отмечен высокий уровень синтеза металлопротеиназы ММР-9, который незначительно повышался при заражении вирусом гриппа в высокой дозе, но снижался при низкой дозе вирусной инфекции. Эта же закономерность отмечена и относительно синтеза провоспалительного цитокина TNFα, синтез которого был выше при высокой дозе заражения вирусом, но низким при низкой дозе вирусной инфекции. В наших опытах отмечен достаточно высокий уровень синтеза белка кисспептина (маркер подавления инвазии и ослабления хемотаксиса клеток) как в контрольных клетках, так и инфицированных вирусом гриппа в высокой дозе заражения, и его значительное увеличение при низкой дозе заражения клеток вирусом. В целом более яркое окрашивание, связанное с более высоким уровнем синтеза биологически активных белков, наблюдалось в клетках эндометрия, полученных на 8-й день МЦ, по сравнению с клетками 19-го дня МЦ. Обсуждение Уже более 10 лет группой японских исследователей проводится изучение влияния вируса гриппа А на клетки хорионаллантоисной оболочки плода человека [7, 17]. При использовании очень высоких доз заражения вирусом гриппа (МИ = 4 – 40) авторами доказана индукция апоптоза только в культуре клеток хориона, а также экспрессия ряда провоспалительных цитокинов и хемокинов. Авторами установлено, что апоптотическая гибель клеток хориона из слоя трофобласта была вызвана в результате внутриклеточного оксидативного стресса и могла быть ингибирована применением антиоксидантов [7, 17, 18]. Инфицирование организма беременной женщины вирусом гриппа А может спровоцировать нарушение нормального процесса развития плода и на другом этапе развития. В последние годы появились сообщения об индукции пандемическими и сезонными вирусами гриппа А молекул неклассического основного комплекса гистосовместимости I класса HLA-G, в основные функции которого входит подавление цитолитического действия NK-клеток и Т-цитотоксических лимфоцитов в процессе беременности, при развитии опухолей и при гриппозной инфекции [15]. Индукция вирусом гриппа иммуносупрессивных молекул HLA-G на поверхности различных иммунных клеток позволяет вирусу гриппа избежать иммунной защиты хозяина [12, 16, 19], но в то же время сверхэкспрессия молекул HLA-G, вызванная вирусом гриппа, в процессе беременности может нарушить баланс иммунной защиты клеток трофобласта. В результате установлено, что инфицирование клеток эндометрия вирусами гриппа А вызывает значительное изменение функциональной активности этих клеток, причем клетки эндометрия раннего срока были более чувствительны к вирусу гриппа, чем клетки, полученные на 19-й день цикла. Действие вируса зависело от множественности инфекции: при высокой инфекционной дозе вируса (МИ = 0,3) происходила остановка клеточного цикла в фазе G0/G1, на что указывало усиление синтеза белка р53 и его преимущественно внутриядерная локализация. В результате цитодеструктивного действия вируса или апоптоза происходила гибель клеток, наблюдалось увеличение синтеза антиапоптозного белка Bcl-2, провоспалительного цитокина TNFα и металлопротеиназы ММР-9. Низкая степень инфекции клеток эндометрия вирусом гриппа (МИ = 0,0003) сопровождалась переходом клеток из фазы G0/G1 в S-фазу, что подтверждалось повышением внутриядерного присутствия белков Cyclin A и Ki-67 и сопровождалось стимуляцией пролиферации клеток, а также снижением синтеза белков Bcl-2, ТNFα и ММР-9. При низкой дозе вирусной инфекции клеток эндометрия наблюдалось увеличение синтеза белка кисспептина — маркера подавления инвазии и ослабления хемотаксиса клеток. Известно, что вирус гриппа вызывает в зараженных клетках задержку прохождения клеточного цикла в фазе G0–G1, поскольку именно эта фаза наиболее благоприятна для репродукции вируса гриппа, после чего клетка может подвергаться апоптозу или цитолизу [14]. Ранее нами было показано, что стимулирующий эффект на пролиферацию клеток, вызванный низкими дозами вируса гриппа, происходит в результате перехода фазы клеточного цикла из G0/G1 в S-фазу [3]. Это же явление обнаружено нами и в клетках эндометрия человека, причем стимуляция пролиферации клеток не сопровождалась индукцией апоптоза. Обнаруженное нами усиление синтеза антиапоптозного белка Bcl-2 при инфицировании клеток высокими дозами вируса может свидетельствовать не столько о подавлении апоптоза, сколько о продлении жизни инфицированных вирусом клеток и переходе вируса к существованию в латентной форме [9]. Белки из семейства Bcl-2 как с антиапоптозной, так и проапоптозной активностью, играют значительную роль не только в процессе эмбриогенеза, но и в нормальном функционировании ткани эндометрия. Активность этих белков различна на разных фазах развития клеток эндометрия (пролиферация, дифференцировка), которые находятся под воздействием гормонов эстрогена и прогестерона [8]. Высокий уровень синтеза провоспалительного цитокина TNFα может объяснить не только гибель клеток, инфицированных высокими дозами вируса, но и активирующее действие этого цитокина на синтез металлопротеиназы ММР-9 [20]. Нарушения баланса синтеза белков из семейства Bcl-2, провоспалительных цитокинов и металлопротеиназ может вызвать дисфункцию клеток эндометрия, что, возможно, может произойти при инфицировании клеток вирусом гриппа и что может повлиять как на нормальный процесс функционирования клеток эндометрия, так и на самые ранние стадии эмбриогенеза. Полученные результаты свидетельствуют о возможной роли вируса гриппа А как на самых ранних стадиях развития плода, так и при нарушении нормального функционирования клеток эндометрия.

About the authors

Anna Olegovna Durnova

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS

Email: anna.durnova@gmail.com
PhD, senior researcher of the Laboratory of Cell Biology, the Department of Pathomorphology

Renata Anvarovna Kadyrova

Research Institute of Influenza

junior researcher of the Laboratory of Cell Cultures

Darya Mikhaylovna Danilenko

Research Institute of Influenza

Email: daria.baibus@gmail.com
researcher of the Laboratory of Evolutionary Changeability of Influenza Viruses

Maksim Igorevich Dyukov

Research Institute of Influenza

researcher of the Laboratory of Molecular Virology and Genetic Engineering

Vera Aleksandrovna Martyntseva

Research Institute of Influenza

junior researcher of the Laboratory of Cell Cultures

Tatyana Dmitriyevna Smirnova

Research Institute of Influenza

Email: cellcultures@influenza.spb.ru
PhD, leading researcher of the Laboratory of Cell Cultures

Mikhail Yuryevich Yeropkin

Research Institute of Influenza

Doctor of Science, head of the Laboratoty of Evolutionary Changeability of Influenza Viruses

Oleg Ivanovich Kiselev

Research Institute of Influenza

academician, professor, director of the Research Institute of Influenza

References

Supplementary files